一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其包括：1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物，用混合抗生素灌胃3～7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉菌素；2、將步驟1灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6～8天；3、接種幽門螺桿菌：將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8～12小時后進食；所述的步驟3的接種頻率為：隔日1次，共2～4次；4、將經步驟3，2～4次接種后的小鼠進行飼養。本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久，模型能廣泛應用于相關研究的幽門螺桿菌感染動物的方法。
【專利說明】一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物學和實驗動物學領域，特別涉及一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法。
【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)被公認為是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要致病因子，人是幽門螺桿菌感染的唯一易感宿主。在發達國家，幽門螺桿菌感染率約為50%左右，而在發展中國家則達到60%以上。為此，國內外研究者正在通過建立幽門螺桿菌感染的動物模型，研究幽門螺桿菌致病機理、特異性防治以及一些藥物或微生態制劑的療效。
[0003]國內外關于幽門螺桿菌感染動物模型的報道中，以豚鼠、裸鼠作為實驗動物的，由于易死亡、自身的免疫缺陷等問題，使得建模成功率低于80%，且模型應用受到一定局限；以小鼠CD1、Balb/c A以及Balb/c等品種作為實驗動物的，則感染率不高，且模型不穩定。其他以猴子、沙鼠、小豬等動物為模型的，存在價格昂貴、數量少、飼養條件高、感染困難等限制因素。同時，所有報道中的建模實驗時間較長，連續灌胃且次數較多，大大增加了建模時動物的死亡率和并發癥的產生。因此，對于幽門螺桿菌機理、藥物應用等研究，一個穩定的、重現性好的動物模型進行臨床前的動物實驗是必要的，找到一種普通的、易于飼養的動物，建立一個建模時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、建模致死率低的動物模型建立方法，為幽門螺桿菌感染的徹底攻克奠定了基礎。`
【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題在于，為了克服現有技術中建立幽門螺桿菌感染的動物模型可控性差、不穩定，成功率不高，建模時間較長，操作復雜，成本較高，一般實驗室中難于建立等缺陷，而提供了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法。本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久，模型能廣泛應用于相關研究的幽門螺桿菌感染動物的方法。
[0005]本發明通過下述技術方案解決上述技術問題:
[0006]本發明提供了一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其包括以下步驟:
[0007]步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉囷素；
[0008]步驟2、將步驟I灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6-8天；
[0009]步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8-12小時后進食；
[0010]所述的步驟3的接種頻率為:隔日I次，共2-4次；
[0011]步驟4、將經步驟3，2-4次接種后的小鼠進行飼養。
[0012]步驟I中，用混合抗生素灌胃可以有效降低小鼠胃部原有菌群對幽門螺桿菌感染建立的影響。所述的灌胃的方法可參考本領域中常規的灌胃方法進行。所述的用混合抗生素灌胃的天數優選7天。
[0013]步驟I中，所述的4周齡雌性C57BL/6小鼠可為本領域常規的4周齡雌性C57BL/6小鼠，一般體重都在llg± I-2g。
[0014]步驟I中，所述的混合抗生素中，較佳地，慶大霉素0.058-0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77萬單位/只/天；更佳地，慶大霉素0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77萬單位/只/天。
[0015]步驟2中，所述的飼養可為本領域中常規的飼養方法，一般在SPF級環境中飼養。所述的 SPF (specific-pathogen-free)級環境為:溫度 22±2°C,,濕度 56±5%，I 周換 2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規飼料；自由進食、進水。
[0016]步驟2中，所述的飼養的時間優選為7天。
[0017]步驟3中，所述的禁食的時間優選12-24h，更優選24h。
[0018]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養基中形成的菌液；所述的幽門螺桿菌菌液中，所述的液體培養基可為BHI (brain heart infusion)。
[0019]步驟3中，所述的幽門螺桿菌優選為幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydneystrain SSI, Hp SSlX
[0020]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液中，其細菌密度優選大于IX 108cfu/mL，更優選為 lX109cfu/mL。
[0021]步驟3中，所述的灌胃的方法可為本領域常規的灌胃方法。所述的灌胃的次數優選3次。
[0022]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量優選0.18-0.22mL/只/次，更優選
0.2mL/ 只 / 次。
[0023]步驟3中，所述的接種頻率優選為:隔日I次，共3次。
[0024]步驟4中，所述的飼養的方法可為本領域常規的飼養方法，一般在SPF級環境中飼養。所述的 SPF (specific-pathogen-free)級環境為:溫度 22±2°C,,濕度 56±5%，I 周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規飼料；自由進食、進水。所述的飼養的時間優選為兩周。
[0025]所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法后，還可通過抽檢確定步驟來確定是否將幽門螺桿菌定殖于胃部。
[0026]所述的抽檢確定步驟優選包括:將經過上述步驟I-步驟4處理的C57BL/6小鼠禁食24h后處死，取幽門端，通過尿素酶實驗、細菌培養和病理切片驗證幽門螺桿菌是否定殖于胃部。所述的抽檢確定步驟可參考文獻:“建立幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠動物模型”，《使用臨床醫藥雜志》，2013年第17卷第I期，P27-P33。
[0027]本發明中，小鼠進食的飼料可為本領域中常規的飼養飼料。
[0028]在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0029]本發明中除所述的幽門螺桿菌菌株外，所用試劑和原料均市售可得。
[0030]本發明的積極進步效果在于:本發明的建模方法實驗時間短、操作次數少、感染幽門螺桿菌數量級高、感染時間長久，模型能廣泛應用于各項幽門螺桿菌相關研究。【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為陰性對照小鼠胃組織切片。
[0032]圖2為陽性對照小鼠胃組織切片。
【具體實施方式】
[0033]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0034]下述實施例中涉及的飼養均是在SPF級環境下進行飼養，具體條件為:溫度22±2°C，，濕度56±5%，I周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規飼料；自由進食、進水。
[0035]慶大霉素、萬古霉素、制霉菌素:上海閃晶生物公司。
[0036]幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI):仁濟醫院惠贈。所述的幽門螺桿菌悉尼菌株SSl在以下文獻中被報道:“幽門螺桿菌(SSl)感染及其胃炎的小鼠模型”，《中國微生態雜志》，2003年6月第15卷第3期。
[0037]BHI 培養基:0xoid 公司。
[0038]實施例1:
[0039]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--慶大霉素0.062萬單位/只/天，萬古霉`素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77萬單位/只/天)—正常飼養一周一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.18mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細菌密度lX109cfu/mL，8小時后進食。隔日I次，共3次一飼養兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率96%。
[0040]實施例2:
[0041 ] 4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--慶大霉素0.058萬單位/只/天，萬古霉素1.2mg/只/天，制霉菌素0.72萬單位/只/天)—正常飼養6天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.2mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細菌密度lX109cfu/mL，8小時后進食。隔日I次，共3次一飼養兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率100%。
[0042]實施例3:
[0043]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃3天(方案--慶大霉素0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.5mg/只/天，制霉菌素0.77萬單位/只/天)—正常飼養6天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細菌密度lX109cfu/mL，12小時后進食。隔日I次，共2次一飼養兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率100%。
[0044]實施例4:
[0045]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重llg±l-2g，混合抗生素灌胃7天(方案:慶大霉素0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.7g/只/天，制霉菌素0.77萬單位/只/天)—正常飼養8天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食12h后，0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細菌密度lX108cfu/mL，12小時后進食。隔日I次，共4次一飼養兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率94%。
[0046]效果實施例1
[0047]1、建模評估
[0048]I)尿素酶實驗:取小鼠近幽門端1/3的胃，立即置于尿素酶快速檢測卡(珠海麗珠試劑有限公司)中，24h后觀察。
[0049]結論:抽檢小鼠尿素酶反應均為陽性。
[0050]2)細菌培養:將實施例1的小鼠胃組織幽門端的1/3與400 ii L BHI置于無菌的玻璃勻漿器內勻漿數次，分別取勻漿液的10倍和100倍的無菌生理鹽水(濃度0.75%，氯化鈉相對于溶液的質量百分數，經滅菌處理的生理鹽水)稀釋液各IOOii L (樣本1、樣本I1、樣本III)涂板，培養后鏡檢菌落并進行菌落計數，結果如表I所示。
[0051 ] 表I建模抽檢幽門螺桿菌菌落計數結果
[0052]
【權利要求】
1.一種幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其包括以下步驟:步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗動物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬古霉素和制霉囷素；步驟2、將步驟I灌胃后的C57BL/6小鼠飼養6-8天；步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8-12小時后進食；所述的步驟3的接種頻率為:隔日I次，共2-4次；步驟4、將經步驟3，2-4次接種后的小鼠進行飼養。
2.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟I中，所述的混合抗生素中，慶大霉素0.058-0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77萬單位/只/天。
3.如權利要求2所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟I中，所述的混合抗生素中，慶大霉素0.062萬單位/只/天，萬古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素：0.77萬單位/只/天。
4.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的禁食時間為12-24小時。
5.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌為幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI)。
6.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養基中形成的菌液；所述的幽門螺桿菌菌液中，所述的液體培養基為BHI。
7.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液中，其細菌密度大于1*108cfu/ml，優選1*109cfu/ml。
8.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量為0.18-0.22mL/只/次，優選0.2mL/只/次。
9.如權利要求1所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:步驟4中，所述的飼養的時間為兩周。
10.如權利要求1或9所述的幽門螺桿菌感染動物模型的建立方法，其特征在于:所述的飼養在SPF級環境中飼養；所述的SPF級環境為:溫度22±2°C，，濕度56±5%，I周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規飼料；自由進食、進水。
【文檔編號】A61K31/7048GK103446576SQ201310415511
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】苗君蒞, 郭本恒, 劉振民, 吳正鈞, 于鵬 申請人:光明乳業股份有限公司