用于治療肺癌的牛樟芝萃取物及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種牛樟芝萃取物及其制備方法，所述方法包括：（a）以低極性的溶劑萃取牛樟芝（Antrodia?cinnamomea）以取得萃取液，其中所述低極性的溶劑是選自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意組合所組成的群組；以及（b）以大孔吸附樹脂分離所述萃取液，以獲得低極性分離液。本發明還涉及本發明的牛樟芝萃取物在治療或預防肺癌中的用途。
【專利說明】用于治療肺癌的牛樟芝萃取物及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種牛樟芝萃取物及其制備方法。本發明還涉及本發明的牛樟芝萃取物在治療或預防肺癌中的用途。
【背景技術】
[0002]牛樟芝(Antrodia cinnamomea)為臺灣特有種燕菌類，目前研究結果顯示牛樟芝具有抗腫瘤、增強免疫力、抗病毒、抗發炎、抗氧化效果和保肝效果等多種功能。其中抗肺癌相關研究與專利多集中于直接使用牛樟芝子實體或菌絲體粉體或不同溶劑的抽取物或單一化合物在肺癌細胞上的毒殺效果(IC5tl),未有人使用管柱將牛樟芝乙醇萃取物再進行分級(fract1n)，并將得到的活性物級分應用于動物模型以證實該活性級分具有抗肺癌的效果O
[0003]肺癌是全世界盛行率與致死率最高的癌癥之一，手術切除是肺癌的主要治療手段，但利用外科手術切除法往往會加速癌細胞的轉移，進而造成癌癥患者主要死亡原因；此外，據統計確診時約70%~80%患者已失去手術切除機會，對于已無手術機會的患者，放療與化療是重要的局部治療手段。放療法雖然可以成功殺死癌細胞，但卻會沒有選擇性地一并殺死正常細胞，通常會引起病人發炎性肺炎并導致嚴重肺損傷。鑒于傳統癌癥治療法有副作用太大的缺點，有必要尋求新的替代療法來改善副作用的問題。

【發明內容】

[0004]本發明所使用 的牛樟芝子實體乙醇萃取物的活性級分(active fract1n)DCB-AC301于動物模型證實除可有效抑制肺癌結節率與改善肺腫脹外，亦可明顯改善化療組體重下降現象。DCB-AC301對肺癌細胞(HCC827、H1975、A549及CL1-5)模型結果顯不IC50明顯優于同一 HPLC化學分析極性區的已發表的單一化合物安卓奎諾爾(Antroqu1nonol)、去氫硫色多孔菌酸(Dehydrosulphurenic acid,馬階一號)、樟芝酸 A(Antcin A)與樟芝酸B (Antcin B)等化合物。此外，本發明在LLC/C57B6動物模型中證實牛樟芝活性級分DCB-AC301抑肺癌結節率達80.8%，優于化療藥物(Gemzar)的78.1%及先前技術常使用的單純牛樟芝子實體乙醇萃取物(AC-E) 17.9%，改善疾病組肺重量60.6%，優于化療藥物組56.5%及先前技術常使用的單純牛樟芝子實體乙醇萃取物8.7%。
[0005]除非本文另外界定，否則本發明所用的科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解的含義。該等術語的含義及范疇應為清晰的；然而，在任何潛在歧義的情況下，本文所提供的定義優于任何辭典或外在定義。
[0006]除非另外指出，否則如本揭示內容所用的以下術語應理解為具有以下含義。
[0007]如本文所用的術語“大孔吸附樹脂”或“大孔樹脂”(彼此可互換使用)意指一種吸附樹脂，由聚合單體和交聯劑、致孔劑(porogen)、分散劑等添加劑經聚合反應制備而成。大孔吸附樹脂在干燥狀態下其內部具有較高的孔隙率，且孔徑較大，在約50nm至2000nm之間。[0008]如本文所用的術語“大孔吸附樹脂管柱”意指主要利用“大孔吸附樹脂”或“大孔樹脂”來進行層析的管柱，例如(包括但不限于)Dia1n? HP-10、
Dia1n? HP-20、Dia1n? HP-30、Dia1n? HP-40、Dia1n? HP-50、Amberlite?XAD-4、Amberlite? XAD-6、Amberlite? XAD-7、Amberlite? XAD-16、Amberlite? XAD-1180 或Amberlite? XAD-1600。
[0009]如本文所用的術語“萃取物”意指針對一物質進行萃取所得的產物，通常是通過將所欲萃取的物質浸泡或混合于溶劑中而獲得的溶液或濃縮制劑。典型地，萃取物系制備自新鮮植物或經研磨或干燥的植物樣本。此領域已知有各種萃取方法，包括但不限于浸潰、滲濾、再滲濾、消解、逆流萃取、渦輪萃取、擠壓/壓擠/壓榨或超臨界流體二氧化碳萃取。適當的溶劑包括但不限于水、乙醇、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、正丁醇、異丁醇、丙酮、己烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或其它溶劑?？筛鶕枰x擇試劑的種類或調配溶劑的濃度，以達適當極性而進行萃取，例如，低極性溶劑包括但不限于石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇；高極性溶劑包括但不限于水、50%或以下的乙醇、甲醇、丁醇、異丁醇、80%或以下的丙酮。溶劑與待萃取物質的比例可為約1:1至約 1:100 (w/v (g/ml))、(優選約 1:1 至約 1:50 (w/v (g/ml))、更優選約 1:1 至約 l:20、(w/V (g/ml)),更優選約1:15或1:10 (w/v (g/ml))。萃取可在適當溫度進行,例如,在約5°C至約 100°C、約 10°C至約 100°C、約 20°C至約 100°C、約 40°C至約 100°C、約 60°C至約 100°C，優選室溫25°C或100°C煮沸。不同階段的萃取物可相互合并，亦可于后續再進行濃縮步驟，例如，蒸發，或純化或分離步驟，例如，過濾、離心和色譜分析。在一實例中，將新鮮植物或干燥的植物樣本的全部或部分(視需要地經切碎或磨碎)與適當的溶劑混合或浸泡于其中并攪拌達一段足夠的時間 ，例如，4小時或以上、6小時或以上、8小時或以上、10小時或以上、12小時或以上、14小時或以上、或16小時或以上，在室溫進行或加熱進行，經由過濾移除固體殘留物(濾渣)，然后收集所獲得的汁液(萃取液)；視需要重復浸泡或混合步驟，合并所得汁液，進一步予以濃縮、純化或分離。
[0010]如本文所用的術語“肺癌“是指肺部組織內細胞生長失去控制的疾病。這種細胞生長可能會造成轉移，就是侵入相鄰的組織和滲透到肺部以外。
[0011]如本文所用的術語“預防”是指遲延罹患疾病個體的癥狀發作或減少疾病出現。
[0012]如本文所用的術語“治療”表示緩解或改善感病個體的癥狀。
[0013]如本文所用的術語“個體”表示動物，尤其哺乳動物。在一較佳實施例中，術語“個體”表示“人類”。
[0014]如本文所用的術語“治療有效劑量”是指單獨或與其它治療/藥物組合使用以治療肺癌顯示治療功效的活性成份的量。
[0015]術語“載劑”或“醫藥學上可接受的載劑”是指一般熟習此項技術者所熟知的用以制備醫藥組合物的稀釋劑、賦形劑、接受劑(receptor)或類似物。
[0016]除非本文另外需要，否則單數術語應包括復數且復數術語應包括單數。
[0017]本發明提供各種態樣的牛樟芝萃取物的制備方法。在一態樣中，本發明的牛樟芝萃取物是由一方法制備而得，該方法包含:
[0018](a)以低極性的溶劑萃取牛樟芝以取得萃取液，其中該低極性的溶劑是選自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意組合所組成的群組；以及
[0019](b)以大孔吸附樹脂分離該萃取液，以獲得低極性分離液。
[0020]較佳地，所使用的低極性溶劑是95%乙醇。此外，具體而言，以大孔吸附樹脂分離該萃取液時，可將該萃取液通入大孔吸附樹脂管柱，依次使用水:乙醇的體積比為1:0至O:1(優選3:2~1:4)的溶液及70-100%乙醇(優選95%乙醇)依序洗脫，最后收取使用該乙醇而獲得的洗脫液。又特定而言，依此方法所制備的牛樟芝萃取物經以乙腈(0.05%三氟乙酸)及水(0.05%三氟乙酸)的梯度洗脫而進行的高效液相色層分析顯示具有保留時間分別為 62.5,63.6,73.8,74.0 及 84.3 的波峰。
[0021 ] 在一較佳實施例中，該步驟b)所使用的大孔吸附樹脂是選自由Dia1n?
HP-10、Dia1n? HP-20、Dia1n? HP-30、Dia1n? HP-40、Dia1n? HP-50、Amberlite? XAD-4、Amberlite? XAD-6、Amberlite? XAD-7、Amberlite?XAD-16、Amberlite? XAD-1180、Amberlite? XAD-1600所纟I[成的群組。更佳
地，該步驟b)所使用的大孔吸附樹脂是Dia1n? HP-20。
[0022]本發明亦提供一種通過如上述的方法制備的牛樟芝萃取物。在一較佳實施例中，該牛樟芝萃取物含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)。在一更佳實施例中，該牛樟芝萃取物具有如圖6所示的化學指紋圖譜。
[0023]本發明又提供一種醫藥組合物，其包含治療有效劑量的如上所述的牛樟芝萃取物及可選地醫藥學上可接受 的載劑。
[0024]在另一實施例中，該醫藥組合物另外包含一或多種其它治療肺癌的藥劑。
[0025]本發明更提供一種上述醫藥組合物的用途，其是用于制備用以預防或治療肺癌的醫藥品。
[0026]在一較佳實施例中，該醫藥品是用于給予每公斤體重約I至1000毫克的牛樟芝萃取物。在一更佳實施例中，該醫藥品是用于給予每公斤體重約75至300毫克的牛樟芝萃取物。
[0027]在一較佳實施例中，該醫藥品的功效包含但不限于抑制肺部腫瘤結節產生、改善肺腫脹的現象及/或毒殺肺癌細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1說明不同牛樟芝分離物對LLC/C57B6肺癌動物模型體重的影響。
[0029]圖2說明不同牛樟芝分離物對LLC/C57B6肺癌動物模型肺癌結節數與外觀等抗癌功效試測。
[0030]圖3說明不同牛樟芝分離物降低LLC/C57B6肺癌動物模型腫瘤的結節數比較(***p〈0.001對比癌癥組；*p〈0.01對比癌癥組)。
[0031]圖4說明不同牛樟芝分離物在LLC/C57B6肺癌動物模型測試中對肺臟重量的影響(.ρ〈0.001對比正常組;***ρ〈0.001對比癌癥組;*p〈0.01對比癌癥組)。
[0032]圖5說明牛樟芝子實體級分DCB-AC301的分離流程。
[0033]圖6說明牛樟芝子實體級分DCB-AC301的化學指紋圖譜。【具體實施方式】
[0034]本發明可能以不同的形式來實施，并不僅限于下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
[0035]實施例1:DCB-AC301對LLC/C57B6肺癌動物模型功效試驗
[0036]使用動物為雄性小鼠C57B/6，購自國家動物中心。飼養在有12小時光照周期(AM7:00-PM7:00)，并有適當溫度及濕度控制，充分供應飼料與飲水。所使用的癌細胞株為小鼠肺癌細胞LLC (Lewis Lung Carcinoma)。于尾靜脈注射I X 16細胞/100 μ L的LLC小鼠肺癌細胞，小鼠以5-8只為一組，隨機分籠，共分8組。腫瘤誘發I周后開始以口服(ρ.ο.)方式，評估DCB-AC301 (不同劑量)配合不同濃度的肺癌臨床一線化療用藥吉西他濱(Gemcitabin)的增效減毒效果，每天觀察并記錄小鼠存活、食量變化及其它生理狀況。連續給藥3周后停止實驗，取出各器官后稱重、拍照記錄并進行病理分析，病理分析評估項目包括病組織分析。利用病理組織切片染色觀察肺部形態變化的情形，并以蘇木紫與伊紅染色法(Hematoxylin and Eosin stains, H&E stain)并透過顯微鏡觀察器官型態的變化和完整性。另外，并利用蛋白印跡(Western blot)分析轉移相關生物標的物的表達(MMP-2、MMP-1/2, E-cadherin)，方法如下:取適量的肺部組織(30~50mg)置于1.5mL微量離心管(Eppendorf)中，并加入600yL~ImL的裂解緩沖液(Lysis buffer),使用超聲波震碎器將組織震碎及細胞膜打破。接著以4°C、1000rpm離心5分鐘，抽取上清液置于新的1.5mL微量離心管中，保存于-80°C冰箱。定量蛋白濃度并進行SDS-PAGE，使用I抗溶于1%BSA和0.l%Tween-20于4°C過夜，隔夜后再給予2抗，并使用ECL顯色壓片定量，結果示于表1、表2、圖1、圖2、圖3及圖4。結果顯示在連續三個星期的喂食后；發現給予牛樟芝組別(AC-E、AC-S-M3及DCB-AC301)小鼠產生肺臟腫瘤結節的數量明顯較少:AC_E300mg/kg(以下簡稱mpk)組平均約為39.4顆、AC-M3組為32.3顆、AC_30175mpk組為24.5顆、AC-301150mpk組為14.2顆，其中又以AC_301300mpk劑量組效果最為顯著，其肺臟腫瘤結節數量為9.23顆，而對照組(Cancer alone)為48顆，具有極明顯的統計差異(P < 0.0001)。此外，AC-301300mpk與正對照組(Gemzar)組別相較，均具有約80%抑制肺轉移的效果。對照測量肺臟重量結果，AC-E組約為0.42g、AC-M3組為0.33g、DCB_AC30175mpk組為0.28g、DCB-AC301150mpk 組為 0.21g，其中又以 DCB_AC301300mpk 組 0.18g 與對照組 0.46g 相較，最具顯著統計差異，并與肺臟腫瘤結節實驗結果達到一致性。最終小鼠體重，對照組小鼠平均體重為23.3g，實驗組小鼠體重為24.lg，顯示測試藥物無明顯毒性。
[0037]表1:不同牛樟芝萃取物樣品降低LLC/C57B6肺癌動物模型腫瘤結節數試驗
【權利要求】
1.一種制備牛樟芝萃取物的方法，其包括: (a)以低極性的溶劑萃取牛樟芝(Antrodiacinnamomea)以取得萃取液,其中所述低極性的溶劑是選自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意組合所組成的群組；以及 (b)以大孔吸附樹脂分離所述萃取液，以獲得低極性分離液。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述低極性的溶劑是95%乙醇。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述步驟b)是將所述萃取液通入大孔吸附樹脂管柱,并依次使用水:乙醇的體積比為1:0至O:1的溶液及70-100%乙醇依序洗脫，最后收集使用所述乙醇而獲得的洗脫液。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述步驟b)是將所述萃取液通入大孔吸附樹脂管柱,并依次使用水:乙醇的體積比為3:2至1:4的溶液及95%乙醇依序洗脫，最后收集使用所述乙醇而獲得的洗脫液。
5.—種通過如權利要求1所述的方法制備的牛樟芝萃取物。
6.如權利要求5所述的牛樟芝萃取物,其含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氫齒孔酸。
7.如權利要求5所述的牛樟芝萃取物，其經以乙腈(0.05%三氟乙酸)及水(0.05%三氟乙酸)的梯度洗脫而進行的高效液相色層分析顯示具有保留時間分別為62.5,63.6,73.8、74.0及84.3的波峰。
8.如權利要求5所述的牛樟芝萃取物，其具有如圖6所示的化學指紋圖譜。
9.一種醫藥組合物，其包含治療有效劑量的如權利要求5所述的牛樟芝萃取物及任選存在的醫藥學上可接受的載劑。
10.一種如權利要求9項所述的醫藥組合物的用途，其是用于制備用以預防或治療肺癌的醫藥品。
11.一種牛樟芝萃取物，其具有如圖6所示的化學指紋圖譜。
12.一種醫藥組合 物，其包含有效劑量的如權利要求11項所述的牛樟芝萃取物及任選存在的醫藥學上可接受的載劑。
13.—種如權利要求12所述的醫藥組合物在制備用以預防或治療肺癌的醫藥品中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK104027362SQ201310424339
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年3月6日
【發明者】翁豐岳, 陳惠玲, 錢瑤珍, 盧昭岑, 鐘玉山 申請人:財團法人生物技術開發中心