Cmklr1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了CMKLR1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)采用不同濃度的α-NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體外模型，然后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)；通過(guò)定量濃度的α-NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型，對(duì)采集的組織進(jìn)行檢測(cè)，證明了CMKLR1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用。CMKLR1小分子拮抗劑可以特異性的拮抗GPCR受體ChemR23，為非酒精性脂肪肝或脂肪肝肝炎的藥物提供新的工具。CMKLR1小分子拮抗劑的合成相對(duì)簡(jiǎn)單，成本比較低廉，在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】CMKLR1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，飲食結(jié)構(gòu)以及生活水平不斷得到改善，由飲食營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩所導(dǎo)致的代謝綜合癥也越來(lái)越多。代謝綜合癥是指體內(nèi)能量過(guò)剩所致的一組代謝失調(diào)相關(guān)性疾病，其三大產(chǎn)能物質(zhì)不能有效地產(chǎn)生能量而出現(xiàn)儲(chǔ)存過(guò)多，如糖過(guò)多轉(zhuǎn)化為糖原或脂肪，導(dǎo)致細(xì)胞儲(chǔ)存池飽和，繼而出現(xiàn)胰島素抵抗及糖尿病；脂類(lèi)物質(zhì)儲(chǔ)存處于飽和狀態(tài)時(shí)出現(xiàn)肥胖、脂肪肝及膽固醇增高相關(guān)性疾病，如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等。在患代謝綜合征的人群中，有三分之一病人患有非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),同時(shí)帶有肥胖病和糖尿病，己成為危害人類(lèi)健康最常見(jiàn)的肝病之一。
[0003]1980年，Ludwig等首次定義了非酒精性脂肪肝及肝炎(NAFLD和NASH)。根據(jù)臨床病理表現(xiàn)，非酒精性脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。NAFLD和NASH的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，目前比較接受“二次打擊學(xué)說(shuō)”，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激以及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)起關(guān)鍵作用。由于胰島素抵抗導(dǎo)致肝臟脂肪酸積累，結(jié)果造成脂肪肝臟，這就是所謂的第一次打擊，并伴隨著肝細(xì)胞、肥大細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、炎癥因子以及特殊的活性氧相互作用造成肝臟進(jìn)一步的損傷，形成脂肪性肝炎或者肝硬化，這也就是第二次打擊。目前尚不清楚病人是如何通過(guò)脂肪肝階段發(fā)展成為肝炎和肝硬化的。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M這一發(fā)生發(fā)展的過(guò)程發(fā)現(xiàn)，自由脂肪酸一旦被釋放進(jìn)入肌肉和脂肪細(xì)胞即被轉(zhuǎn)化為甘油三酯或者在線(xiàn)粒體、過(guò)氧化物酶體、微粒體被氧化。但是脂滴過(guò)氧化長(zhǎng)生過(guò)多的輕基壬烯酸和丙二醒，從而引起肝纖維化同時(shí)引起trans-forming growthfactor-betaCTGF-β)增加。炎癥調(diào)節(jié)因子也參與NAFLD過(guò)程中。促炎癥反應(yīng)因子比如NF-κ B經(jīng)常伴隨著脂肪性肝炎的發(fā)生而升高，以及TNF-a在NAFLD病理過(guò)程均上升，表明其重要抗炎作用。除了上述炎癥因子參與，肝臟中的枯否氏細(xì)胞也參與其病理過(guò)程，枯否氏細(xì)胞屬于巨噬細(xì)胞的一種，參與先天性以及獲得性免疫，研究表明在NASH發(fā)展過(guò)程中枯否氏細(xì)胞的活動(dòng)過(guò)度可能是造成由脂肪肝轉(zhuǎn)變?yōu)楦窝椎闹匾襟E。另外，也有研究表明，儲(chǔ)鐵蛋白，視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)等都參與非酒精性脂肪肝的病理過(guò)程。最近，許多實(shí)驗(yàn)表明脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等參與NAFLD病理過(guò)程。從另一方面，也說(shuō)明多種脂肪因子的相互作用可能在脂肪肝的炎癥反應(yīng)以及纖維化過(guò)程起關(guān)鍵作用。
[0004]脂肪因子是指一系列由脂肪組織分泌的生物活性物質(zhì)，除了包括上述的瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、還包括內(nèi)肥素、腫瘤壞死因子、纖溶酶原激活物抑制因子和白介素-6等。隨著研究的不斷深入，新脂肪因子也不斷被發(fā)現(xiàn)。
[0005]Chemerin是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和代謝的一個(gè)新脂肪因子，也是與肥胖和代謝綜合征組成部分相關(guān)的一個(gè)新脂肪因子。1997年，首次報(bào)道了 chemerin，其也稱(chēng)作他扎羅汀誘導(dǎo)基因2或者視黃酸受體反應(yīng)蛋白2，他扎羅汀誘導(dǎo)基因2在銀屑病皮損中能受到維生素A類(lèi)似物他扎羅汀(tazarotene)的誘導(dǎo)。Chemerin的前體為prochemerin能被凝血、纖溶和炎性反應(yīng)中的絲氨酸蛋白酶所激活，即絲氨酸蛋白酶切割去除prochemerin羧基端的數(shù)個(gè)氨基酸殘基后，使其成為具有生物活性的chemerin。Chemerin基因在肝臟、肺臟、垂體、卵巢、腎臟等均有較高表達(dá)。2003年，chemerin的受體被鑒定出來(lái)，Wittamer等在卵巢癌腹水中分離、鑒定出chemerin，發(fā)現(xiàn)它是一種趨化蛋白，受體的名字為ChemR23，也稱(chēng)CMKLR1。CMKLRl，于1998年由Samson等首次報(bào)道，一種在未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)的GPCR。但是直到2003年之前未發(fā)現(xiàn)其配體。多項(xiàng)研究也提示Chemerin-CMKLRI系統(tǒng)有趨化抗原呈遞細(xì)胞(APC)和NK細(xì)胞等在炎癥或損傷組織的聚集的作用。近年來(lái)，針對(duì)CMKLRl的研究主要集中在肝臟以及肝臟相關(guān)疾病方面。Parlee等報(bào)道了該受體的基因在脂肪肝病中高表達(dá)，說(shuō)明該受體參與肝臟疾病的重要性。
[0006]CMKLRl 屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)是具有 7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)受體，是人體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)家族。GPCRs屬于信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)受體(如傳遞視覺(jué)信號(hào)、攜帶神經(jīng)信息等)。此外，GPCR信號(hào)還在多種重要疾病中扮演關(guān)鍵的角色。
[0007]近年來(lái)，針對(duì)GPCR的藥物層出不窮，GPCR已經(jīng)成為20種最暢銷(xiāo)藥物中的12種藥物的作用祀標(biāo)，包括充血性心力衰竭藥物Coreg、高血壓藥物Cozaar、乳腺癌藥物Zoladex、焦慮藥物Buspar、精神分裂藥物Clozaril。此外，Zantac和Claritin的作用祀標(biāo)也是GPCR。這類(lèi)藥物每年的銷(xiāo)售總額高達(dá)2000億美元。藥物的種類(lèi)既包括GPCRs的激動(dòng)劑，也包括其抑制劑。ChemR23的抑制劑有很多種，包括阻斷ChemR23與其配體結(jié)合的或降低CMKLRl 表達(dá)的。2_ (alpha-Naphthoyl) ethyltrimethylammonium 1dide (α-ΝΕΤΑ),季銨化合物，經(jīng)證明為ChemR23的小分子拮抗劑。a -NETA最初被認(rèn)定的作用是乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的可逆抑制劑，在高濃度下，a -NETA激活的乙酰膽堿酯酶(EC50，360 μ m)和抑制膽堿酯酶(EC50，1100 μ m)。2012年，a -NETA被鑒定為ChemR23的新型拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)a -NETA(IC50:0.4uM)可以抑制chemerin刺激CMKLRl的β _arrestin2相關(guān)表達(dá)，同時(shí)可以抑制chemerin 刺激的 CMKLRl 高表達(dá)的細(xì)胞遷移(IC50:1.2uM)。2013 年，Kareem Graham 等發(fā)現(xiàn)小分子拮抗劑a-NETA可以抑制脫髓鞘病。
[0008]非酒精性脂肪性肝病是一種無(wú)過(guò)量飲酒史的以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。該病目前的藥物治療方法大至包括中醫(yī)，西醫(yī)以及其他治療方法，但每種方法均具有缺點(diǎn)。
[0009]中藥療法療效慢，治愈率不高，而且難以向國(guó)際推廣。西醫(yī)療法尚缺乏規(guī)范性的完全有效的治療方法，部分藥物能使血中脂質(zhì)沉積于肝臟，同時(shí)對(duì)肝臟本身有毒性。運(yùn)動(dòng)療法能夠改善胰島素抵抗。但是所需時(shí)間長(zhǎng)。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0010]本發(fā)明的目的在于提供CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0012]CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用；所述CMKLRl小分子拮抗劑為a -NETA及其衍生物。
[0013]所述非酒精性脂肪肝及肝炎為高能量飲食引起的脂肪肝及肝炎。
[0014]本發(fā)明通過(guò)采用不同濃度的a -NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體外模型，然后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)；通過(guò)定量濃度的a-NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型，對(duì)采集的組織進(jìn)行檢測(cè)，證明了 CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用，具體操作如下:
[0015](I)非酒精性脂肪肝體外模型的建立:正常培養(yǎng)的!fepal-6細(xì)胞鋪板，密度生長(zhǎng)至70%，加入0.8mM油酸誘導(dǎo)三天；
[0016]非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型的建立:SPF級(jí)BALB/C小鼠(5_6周)，設(shè)立對(duì)照組，高脂飲食組；聞脂組使用45wt%聞脂詞料詞喂，詞養(yǎng)12周；
[0017](2)正常培養(yǎng)的!fepal-6細(xì)胞，按照一定細(xì)胞密度鋪6孔板；待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度a -NETA (300Nm、1000Nm、3000nM)的培養(yǎng)基(α -ΝΕΤΑ、DMEM高糖培養(yǎng)基、10wt%FBS、青鏈霉素、谷氨酰胺)，24小時(shí)后，加入換帶有油酸和a -NETA的培養(yǎng)基(0.8mM油酸、α -肥14、01^11高糖培養(yǎng)基、10被9^^3、青鏈霉素、谷氨酰胺)；三天后，取細(xì)胞提取總RNA使用熒光定量PCR (qPCR)方法，在基因水平上檢測(cè)脂代謝的關(guān)鍵基因(ADRP、PPAR_Y、HSL、PPAR-δ、HMGCR)和炎癥因子(IL-6、TNF-α );在細(xì)胞的脂肪化程度上，采用油紅O染色、異丙醇洗脫然后酶標(biāo)儀檢測(cè)0D500吸光度值，從而判斷小鼠肝細(xì)胞H印al-6內(nèi)甘油三酯的生成量；
[0018](3)在非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型(高脂飼喂的BALB/C小鼠)中，我們?cè)O(shè)立對(duì)照組和NAFLD模型組，采取6w齡雄性小鼠，高脂飼喂8w，實(shí)驗(yàn)組每周2次腹腔注射lmg/kg α -ΝΕΤΑ(lwt%DMS0的生理鹽水溶解)，對(duì)照組每周2次腹腔注射lmg/kg含lwt%DMS0的生理鹽水；每2周取實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟一次，稱(chēng)重拍照，并在基因水平上檢測(cè)脂代謝的關(guān)鍵基因(ADRP、PPAR- Y、HSL、PPAR- δ、HMGCR)和炎癥因子(IL-6、TNF- α )，并通過(guò)組織切片HE染色觀(guān)察肝細(xì)胞脂肪變情況，同時(shí)按照目前較為公認(rèn)的方法對(duì)小鼠脂肪肝形成進(jìn)行定級(jí)；實(shí)驗(yàn)鼠血清TC、TG和ALT變化情況使用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0019]本發(fā)明的作用機(jī)理:本發(fā)明所涉及的CMKLRl小分子拮抗劑為a -NETA及其衍生物，主要是通過(guò)拮抗肝細(xì)胞中的CMKLRl受體而發(fā)揮作用的。
[0020]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明所涉及的CMKLRl小分子拮抗劑為a -NETA及其衍生物主要是通過(guò)拮抗肝細(xì)胞中的CMKLRl受體而發(fā)揮作用的。a -NETA及其衍生物可以特異性的拮抗GPCR受體ChemR23，為非酒精性脂肪肝或脂肪肝肝炎的藥物提供新的工具。a -NETA及其衍生物的合成相對(duì)簡(jiǎn)單，成本比較低廉，在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0021]圖1是熒光定量PCR檢測(cè)肝細(xì)胞的結(jié)果圖；其中:Α為熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞系H印al-6油酸誘導(dǎo)后與對(duì)照相比chemerin的表達(dá)的結(jié)果圖；B為熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞系Hepal-6油酸誘導(dǎo)后與對(duì)照相比ChemR23的表達(dá)的結(jié)果圖；C為肝臟中chemerin在高脂飼養(yǎng)后的結(jié)果圖；D為肝臟中ChemR23的表達(dá)隨時(shí)間變化的結(jié)果圖。
[0022]圖2是油紅O染色油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞系H印al-6脂肪變的結(jié)果圖；其中:A為陰性對(duì)照的結(jié)果圖；B為陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果圖；C為加入300ηΜα-ΝΕΤΑ后誘導(dǎo)油紅O染色結(jié)果圖；D為加入100nM a -NETA后誘導(dǎo)油紅O染色結(jié)果圖；Ε為加入3000ηΜ a -NETA后誘導(dǎo)油紅O染色結(jié)果圖；F為經(jīng)異丙醇洗脫后測(cè)定各誘導(dǎo)染色OD值的結(jié)果圖。
[0023]圖3是熒光定量PCR方法檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞系Hepal-6脂代謝相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果圖；其中:A為ADRP基因在100nMa-NETA處理一天的表達(dá)結(jié)果圖；B為PPAR-Y在300、1000、3000nMa-NETA處理三天的表達(dá)結(jié)果圖；C SPPAR-α的表達(dá)結(jié)果圖；D SHSL表達(dá)在300nM a -NETA處理一天的表達(dá)結(jié)果圖；Ε為PPAR- δ在3000nM a -NETA處理兩天的表達(dá)結(jié)果圖；F SHMGCR在300、100nM a-NETA處理兩天的表達(dá)結(jié)果圖；G為IL_6、TNF_ α在300、1000、3000nM 的 a-NETA 處理兩天的表達(dá)結(jié)果圖；H 為 IL_6、TNF_ α 在 300、1000、3000nM 的a -NETA處理三天的表達(dá)結(jié)果圖。
[0024]圖4是實(shí)驗(yàn)小鼠體重增長(zhǎng)曲線(xiàn)圖；其中:A為a -NETA干預(yù)高脂飲食組、高脂飲食組與對(duì)照組的小鼠體重增長(zhǎng)曲線(xiàn)出為a-NETA干預(yù)高脂飲食組、高脂飲食組與對(duì)照組的小鼠肝臟稱(chēng)重結(jié)果圖'C為a-NETA干預(yù)高脂飲食組、高脂飲食組與對(duì)照組的第二周和第八周實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟圖。
[0025]圖5是實(shí)驗(yàn)小鼠血清TC、TG、AST及ALT水平測(cè)定的結(jié)果圖；其中:A為未經(jīng)a-NETA干預(yù)的第二周空白小鼠血清的結(jié)果圖；B為第二周高脂飲食組小鼠血清的結(jié)果圖；C為經(jīng)a-NETA干預(yù)的第二周高脂飲食組小鼠血清的結(jié)果圖；D為未經(jīng)a-NETA干預(yù)的第八周空白小鼠血清的結(jié)果圖；E為第八周高脂飲食組小鼠血清的結(jié)果圖；F為經(jīng)a-NETA干預(yù)的第八周高脂飲食組小鼠血清的結(jié)果圖。
[0026]圖6是各組肝臟切片檢測(cè)結(jié)果；其中:A_C，顯示在第二周高脂組肝臟有輕度的脂肪變。D-F，第八周有中度的脂肪變。但是在a-NETA干預(yù)組脂肪變情況不明顯。G，脂肪肝及肝炎分級(jí)。
[0027]圖7 是熒光定量 PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠 AdipoRl、LDLR、ADRP、PPAR-Y、PPAR-a、HSL、PPAR-S、HMGCR、IL-6&TNF-a表達(dá)的結(jié)果；其中:A為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠AdipoRl的表達(dá)結(jié)果；B為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠LDLR的表達(dá)結(jié)果；C為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠ADRP的表達(dá)結(jié)果；D為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠PPAR-Y的表達(dá)結(jié)果；E為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠PPAR-α的表達(dá)結(jié)果；F為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠HSL的表達(dá)結(jié)果；G為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠PPAR- δ的表達(dá)結(jié)果；Η為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠HMGCR的表達(dá)結(jié)果；1為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠IL-6的表達(dá)結(jié)果；J為熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠TNF-a的表達(dá)結(jié)果。
【【具體實(shí)施方式】】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0029]實(shí)施例1
[0030]CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用；所述CMKLRl小分子拮抗劑為a -NETA及其衍生物。
[0031]所述非酒精性脂肪肝及肝炎為高能量飲食引起的脂肪肝及肝炎。
[0032]通過(guò)采用不同濃度的a-NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體外模型，然后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)；通過(guò)定量濃度的a-NETA干預(yù)非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型，對(duì)采集的組織進(jìn)行檢測(cè)，證明了 CMKLRl小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用，具體操作如下:
[0033](I)非酒精性脂肪肝體外模型的建立:37°C、5%C02條件下，培養(yǎng)H印al_6細(xì)胞，以15/毫升細(xì)胞密度鋪板，密度生長(zhǎng)至70%，加入0.8mM油酸誘導(dǎo)三天；
[0034]非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型的建立:SPF級(jí)BALB/C小鼠(5_6周)，設(shè)立對(duì)照組小鼠20只，聞脂飲食組20只；聞脂組使用45wt%聞脂詞料詞喂，詞養(yǎng)12周；
[0035]結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，經(jīng)高脂喂養(yǎng)后，肝臟中的chemerin及CMKLRl的mRNA水平高于正常飼料喂養(yǎng)后肝臟中相應(yīng)基因的水平；體外肝細(xì)胞，經(jīng)油酸誘導(dǎo)后，chemerin及CMKLRl的mRNA水平高于未經(jīng)油酸誘導(dǎo)的表達(dá)水平。
[0036](2)正常培養(yǎng)的!fepal-6細(xì)胞，按照15/毫升細(xì)胞密度鋪6孔板；待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度α-ΝΕΤΑ (300ηΜ、1000ηΜ、3000ηΜ)的培養(yǎng)基(a-NETA、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，11965-092，下同。)、10wt%FBS、青鏈霉素、谷氨酰胺)，24小時(shí)后，加入換帶有油酸和a -NETA的培養(yǎng)基(0.8mM油酸、α -ΝΕΤΑ,DMEM高糖培養(yǎng)基、10wt%FBS、青鏈霉素、谷氨酰胺)；三天后，取細(xì)胞提取總RNA使用熒光定量PCR法(該方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。)在基因水平上檢測(cè)脂代謝的關(guān)鍵基因(ADRP、PPAR- Y、HSL、PPAR- δ、HMGCR)和炎癥因子(IL-6、TNF-α );在細(xì)胞的脂肪化程度上，采用油紅O染色、異丙醇洗脫然后酶標(biāo)儀檢測(cè)0D500吸光度值，從而判斷小鼠肝細(xì)胞H印al-6內(nèi)甘油三酯的生成量。油紅染色步驟為:0.5g油紅O和10ml異丙醇(含量98wt%)配制成油紅飽和液。取油紅飽和液6毫升，加蒸餾水4毫升，靜置5-10分鐘后過(guò)濾成為油紅稀釋液。肝組織制備冰凍切片，或肝細(xì)胞鋪在蓋玻片上，4wt%多聚甲醛溶液固定，蒸餾水充分洗滌，經(jīng)油紅稀釋液染10-15分鐘，避光、密封。60wt%乙醇鏡下分化至間質(zhì)清晰；水洗；再用Marry氏蘇木素復(fù)染核冰洗；甘油或甘油明膠封片。結(jié)果:脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無(wú)色。
[0037]結(jié)果如圖2、圖3所示，油酸誘導(dǎo)之后，Hepal-6肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)有紅色、大的脂滴聚集在肝細(xì)胞中。當(dāng)經(jīng)油酸協(xié)同不同濃度a-NETA，300nM，100nM或3000nM處理肝細(xì)胞后，油酸誘導(dǎo)形成的脂滴減少，脂滴變小，且呈細(xì)碎狀。
[0038](3)在非酒精性脂肪肝體內(nèi)模型(高脂飼喂的BALB/C小鼠)中，我們?cè)O(shè)立對(duì)照組和NAFLD模型組，采取6w齡雄性小鼠，高脂飼喂8w，實(shí)驗(yàn)組每周2次腹腔注射lmg/kg α -ΝΕΤΑ(lwt%DMS0的生理鹽水溶解)，對(duì)照組每周2次腹腔注射lmg/kg含lwt%DMS0的生理鹽水；每2周取實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟一次，稱(chēng)重拍照，并在基因水平上檢測(cè)脂代謝的關(guān)鍵基因(ADRP、PPAR- Y、HSL、PPAR- δ、HMGCR)和炎癥因子(IL-6、TNF- α )，并通過(guò)組織切片HE染色觀(guān)察肝細(xì)胞脂肪變情況，同時(shí)根據(jù)1995年全國(guó)肝炎會(huì)議修訂標(biāo)準(zhǔn)，脂肪肝程度與單純性脂肪肝一致，分為4度(H)?4);依據(jù)炎癥程度分為3級(jí)(G0?3) ；G0無(wú)炎癥；G1腺泡3帶呈現(xiàn)少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)散在個(gè)別點(diǎn)灶狀壞死；G2腺泡3帶明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死增多，門(mén)管區(qū)輕?中度炎癥；G3腺泡3帶廣泛的氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死明顯，門(mén)管區(qū)輕至中度炎癥伴/或門(mén)管區(qū)周?chē)装Y。依據(jù)纖維化的范圍和形態(tài)，把NASH肝纖維化分為4期(S0?4):S0無(wú)纖維化；S1腺泡3帶局灶性或廣泛的竇周/細(xì)胞周纖維化；S2纖維化擴(kuò)展到門(mén)管區(qū)，局灶性或廣泛的門(mén)管區(qū)星芒狀纖維化；S3纖維化擴(kuò)展到門(mén)管區(qū)周?chē)衷钚曰驈V泛的橋接纖維化；S4肝硬化。依據(jù)以上方法對(duì)小鼠脂肪肝形成進(jìn)行定級(jí)；實(shí)驗(yàn)鼠血清TC、TG和ALT變化情況使用酶聯(lián)免疫吸附方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖4-7所示，a-NETA顯著減輕了高脂喂養(yǎng)引起的脂肪肝及肝炎，也減輕了肝纖維化。a-NETA顯著降低了高脂喂養(yǎng)引起的血清中TC\TG及ALT的水平。a -NETA降低了油酸或高脂誘導(dǎo)產(chǎn)生的HMGCR，IL-6，TNF-α、PPAR的表達(dá)，這些基因都與脂代謝、炎癥相關(guān)。
[0039]a -NETA及其衍生物的作用機(jī)理:本發(fā)明所涉及的CMKLRl小分子拮抗劑為a -NETA及其衍生物，主要是通過(guò)拮抗肝細(xì)胞中的CMKLRl受體而發(fā)揮作用的。
[0040]以上所述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.00(1^1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用；所述00(1^1小分子拮抗劑為0-肥及其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的0*1^1小分子拮抗劑在防治非酒精性脂肪肝及肝炎中的應(yīng)用，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝及肝炎為高能量飲食引起的脂肪肝及肝炎。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK104434888SQ201310424520
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】張鍵, 穆淑花, 張旭 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院