禾本科來源的變應(yīng)原性已降低并保持t-細(xì)胞反應(yīng)性的1類變應(yīng)原的變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及禾本科來源的變應(yīng)原性已降低并保持T-細(xì)胞反應(yīng)性的1類變應(yīng)原的變體。本發(fā)明還涉及禾本科（白菖蒲）的1類變應(yīng)原的變體的制備和用途，該1類變應(yīng)原的特征在于與已知野生型變應(yīng)原相比，其IgE反應(yīng)性已降低，同時(shí)基本上保持了與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。這些低變應(yīng)原性的變應(yīng)原變體可被用于對(duì)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者的特異性免疫治療（脫敏作用）或用于對(duì)草花粉變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防性免疫治療。
【專利說明】禾本科來源的變應(yīng)原性已降低并保持T-細(xì)胞反應(yīng)性的1類變應(yīng)原的變體
[0001]本申請是申請日為2005年7月11目的中國專利申請200580024464.5“禾本科來源的變應(yīng)原性已降低并保持T-細(xì)胞反應(yīng)性的I類變應(yīng)原的變體”的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0002]本發(fā)明涉及禾本科(白菖蒲)的I類變應(yīng)原的變體的制備和用途，該I類變應(yīng)原的特征在于與已知野生型變應(yīng)原相比，其IgE反應(yīng)性已降低，同時(shí)基本上保持了與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。這些低變應(yīng)原性的變應(yīng)原變體可被用于對(duì)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者的特殊免疫治療(脫敏作用)或用于對(duì)草花粉變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防性免疫治療。
[0003]本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及梯牧草(貓尾草)花粉來源的主要變應(yīng)原Phl pi的變體。
【背景技術(shù)】
[0004]I型變態(tài)反應(yīng)對(duì)全世界均有意義。工業(yè)化國家有高達(dá)20%的人口患有諸如過敏性鼻炎、結(jié)膜炎或支氣管哮喘的疾病。這些變態(tài)反應(yīng)均是由多種來源，諸如植物花粉、螨、貓或狗釋放并存在于空氣中的變應(yīng)原(氣源性變應(yīng)原)引起的。在這些I型變態(tài)反應(yīng)患者中，高達(dá)40%的患者依次表現(xiàn)出與草花粉變應(yīng)原的特異性IgE反應(yīng)性(Freidhoff et al.，1986，J.Allergy Clin.1mmunol.78:1190-2002)。
[0005]觸發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)、糖蛋白或多肽。這些變應(yīng)原通過粘膜被吸收后，可與致敏的人類個(gè)體內(nèi)肥大細(xì)胞表面結(jié)合的IgE分子反應(yīng)。2個(gè)IgE分子通過I個(gè)變應(yīng)原進(jìn)行的彼此交聯(lián)導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)(例如組胺、前列腺素)和細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致了相應(yīng)的臨床癥狀。
[0006]根據(jù)單個(gè)變應(yīng)原分子與變態(tài)反應(yīng)患者的IgE抗體反應(yīng)的相對(duì)頻率，可區(qū)分主要和次要變應(yīng)原。
[0007]以梯牧草(貓尾草)為例，迄今已鑒別的主要變應(yīng)原為Phl pi (Petersen et al.，1993,J.Allergy Clin.1mmunol.92:789-796)、Phl p5(Matthiesen and Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy21:297-307 ； Petersen et al.,1992,Int.Arch.Allergy Immunol.98:105-109)、Phl p6 (Petersen et al.,1995, Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)、Phlp2 / 3 (Dolecek et al.，1993，F(xiàn)EBS335(3)，299-304)、Phl p4 (Haavik et al.，1985，Int.Arch.Allergy App1.1mmunol.78:260-268 ；Valenta et al.，1992，Int.Arch.AllergyImmunol.97:287-294, Fischer et al.,1996, J.Allergy Clin.1mmunol.98:189-198)和Phl pl3 (Suck et al., 2000, Clin.Exp.Allergy30:324-332 ；Suck et al., 2000, Clin.Exp.Allergy30:1395-1402)。
[0008]梯牧草(貓尾草)內(nèi)，占優(yōu)勢的主要變應(yīng)原為Phl pi和Phl p5o由于禾本科成員來源的主要變應(yīng)原彼此具有高度同源性，因而具有非常相似的生化和免疫學(xué)特性，這些相關(guān)蛋白被集中分為I類和5類變應(yīng)原。[0009]I類變應(yīng)原可與95%以上的草花粉變態(tài)反應(yīng)患者體內(nèi)的IgE抗體反應(yīng)，因而是草花粉中占優(yōu)勢的主要變應(yīng)原。
[0010]I類變應(yīng)原是分子量約為32kDa的糖蛋白，位于花粉粒的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。花粉粒與上呼吸道粘膜的接觸以及花粉粒被雨潤濕后均可導(dǎo)致這些變應(yīng)原的快速釋放。亞細(xì)胞微粒形式的I類變應(yīng)原的快速釋放能夠滲透進(jìn)入下呼吸道，從而觸發(fā)嚴(yán)重的哮喘發(fā)作。
[0011]業(yè)已鑒別了貓尾草(Laffer et al.,1994, J.Allergy Clin.Tmmunol.94:689-698)、黑麥草(Perez et al.，1990，J.Biol.Chem.265:16210-16250)、絨毛草(Schrammet al., 1997, J.Allergy Clin.1mmunol.1999:781-787)、草地早熟禾(Sturaro u.Viotti,1998，NCBI GenBank, Acc.N0.AJ131850)、狗牙根(Smith et al.，1996，J.Allergy Clin.1mmunol.98:331-343)、喜濕篇草(Suphioglu et al.,1995, Clin.Exp.Allergy25:853-865)和水稻(Xu et al.，1995，Genel64:255-259)來源的 I 類變應(yīng)原的 cDNAs。
[0012]除了對(duì)這些序列最初的描述，與原始序列在各個(gè)位置處存在差異的其它I類變應(yīng)原序列也已被公開在數(shù)據(jù)庫中。這些同種型也被認(rèn)為是其它的草花粉變應(yīng)原。
[0013]正因?yàn)樗鼈兊耐葱裕纵牌?禾本科)的I類變應(yīng)原與人IgE抗體具有高交叉反應(yīng)性(Laffer et al., 1996,Mol.1mmunology33:417-426) ?該免疫學(xué)交叉反應(yīng)性基于非常相似的氨基酸序列，如梯牧草(貓尾草)的I類變應(yīng)原Phl Pl與圖1中選定物種來源的I類分子的序列比較所示。
[0014]該禾本科來源的其它I類變應(yīng)原中的同源序列區(qū)同時(shí)存在本文在低變應(yīng)原性變體的構(gòu)建中所述的Phl pi氨基酸序列缺失的序列區(qū)域，及其側(cè)翼序列區(qū)域。此外，該禾本科的I類變應(yīng)原的半胱氨酸的數(shù)目以及周圍的序列區(qū)域不變。正因?yàn)檫@些序列同源性，禾本科的I類變應(yīng)原被劃分在β -蘋果青霉素的蛋白質(zhì)家族內(nèi)(Cosgrove D.J.,2000Nature407:321-6)。
[0015]有效治療變態(tài) 反應(yīng)的傳統(tǒng)方法是特異性免疫療法或脫敏作用(Fiebig，1995，Allergo J.4(6):336-339:Bousquet et al., 1998, J.Allergy Clin.Tmmunol.102(4):558-562)，即將天然變應(yīng)原提取物以遞增劑量皮下注射進(jìn)患者體內(nèi)。但該方法卻有導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)或者甚至過敏性休克的風(fēng)險(xiǎn)。為了將這些風(fēng)險(xiǎn)減至最小，人們應(yīng)用了類變應(yīng)原形式的創(chuàng)新制劑。與上述未經(jīng)處理的提取物相比，這些制劑是IgE反應(yīng)性已顯著降低，但仍保持了 T-細(xì)胞反應(yīng)性的化學(xué)改良變應(yīng)原提取物。這些T-細(xì)胞表位在脫敏作用中對(duì)上述變應(yīng)原制劑的治療作用至關(guān)重要(Fiebig，1995，Allergo J.4(7):377-382)。
[0016]采用重組法制備的變應(yīng)原實(shí)現(xiàn)更高程度的治療優(yōu)化是可能的。通過重組法制備的高純度變應(yīng)原的成分明確的混合物，如果與患者的各個(gè)致敏模式相符，便可取代天然變應(yīng)原來源的提取物，因?yàn)楹笳叱卸喾N變應(yīng)原外，還含有相當(dāng)大量具有免疫原性而非變應(yīng)原性的附屬蛋白質(zhì)。
[0017]經(jīng)過特異性突變的重組變應(yīng)原，即其中的IgE表位被特異性缺失，而脫敏療法所必需的T-細(xì)胞表位并未受損的重組變應(yīng)原，使利用重組表達(dá)產(chǎn)物可能實(shí)現(xiàn)安全脫敏的現(xiàn)實(shí)前景得以出現(xiàn)(Schramm et al.，1999, J.1mmunol.162:2406-2414)。
[0018]對(duì)脫敏作用而言，一個(gè)不同的概念則基于下述事實(shí)，即保護(hù)性免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)，尤其是被具有阻斷作用的IgG4抗體誘導(dǎo)。依照該假設(shè)，業(yè)已描述了重組Phl pi片段，并認(rèn)為其適用于誘導(dǎo)保護(hù)性IgG4應(yīng)答(Ball et al.，1999，F(xiàn)ASEB J.13:1277-1290)。該概念與具有降低的IgE反應(yīng)性并保持T-細(xì)胞反應(yīng)性的低變應(yīng)原性變應(yīng)原變體的概念完全不同。
[0019]通過治療影響變態(tài)反應(yīng)患者體內(nèi)被擾亂的T輔助細(xì)胞平衡的另一種可能性是采用編碼相關(guān)變應(yīng)原的可表達(dá)DNA進(jìn)行治療(免疫治療性DNA接種)。業(yè)已通過注射變應(yīng)原編碼DNA，在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)免疫應(yīng)答的變應(yīng)原特異性影響(Hsu et al.，1996，Nature Medicine2(5):540-544)。
[0020]本發(fā)明的目標(biāo)在于提供禾本科的新型I類變應(yīng)原的變體，并可在蛋白質(zhì)和DNA水平根據(jù)其降低的IgE活性和基本上保持的T-細(xì)胞反應(yīng)性對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，從而使其適用于治療和預(yù)防性特異免疫療法和免疫治療性DNA接種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:禾本科物種的Phl p1-同源氨基酸序列(由eDNA序列推導(dǎo)的成熟蛋白序列):草地早熟禾(Poa P)絨毛草(Hol I)、黑麥草(Lol P)、狗牙根(Cyn d)、水稻(Ory s)和喜濕觀草(Pha a),蛋白質(zhì)序列根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, Bethesda, USA)的“GenBank”數(shù)據(jù)庫的cDNA序列推導(dǎo)而得，編號(hào)方式:成熟蛋白的氨基酸位置，下劃線突出顯示的:與Phl pi序列不同的氨基酸，黑框:半胱氨酸
[0022]圖2:已加工的Phl pi野生型蛋白和變體Phl plNoCys、Phl plWt (野生型)的氨基酸序列比對(duì):蛋白質(zhì)序列根據(jù)cDNA序列(位于Bethesda的美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的“GenBank”數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為Z27090)推導(dǎo)而得，編號(hào)方式:成熟蛋白的氨基酸位置，黑色突出顯示:蛋白Phl plNoCys中絲氨酸對(duì)半胱氨酸的氨基酸取代
[0023]圖3:低變應(yīng)原性變體 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 PhlPlNoCysA 1-6,115-119,213-220的氨基酸序列比對(duì)，作為實(shí)例描述，編號(hào)方式:氨基酸位置，下劃線突出顯示的:缺失
[0024]圖 4:對(duì)重組變體 Ph`l PINoCys, Phl pINoCys Δ 213-220 和 Phl pINoCys Δ 1-6,115-119,213-220 的 SDS-PAGE 和身份檢驗(yàn)
[0025]A: SDS-PAGE
[0026]B:利用aPhl pi抗體(Allergopharma)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡
[0027]1.標(biāo)記蛋白
[0028]2.nPhl pi *
[0029]3.rPhl plWt (-組氨酸-標(biāo)志)*
[0030]4.標(biāo)記蛋白
[0031]5.Phl plNoCys (+組氨酸-標(biāo)記)
[0032]6.Phl plNoCys D213-220 (+組氨酸-標(biāo)記)
[0033]7.Phl PINoCys D1-6，115-119，213-220 (+組氨酸-標(biāo)記)
[0034]8.標(biāo)記蛋白
[0035]*還原樣品(二硫蘇糖醇)
[0036]圖 5:檢驗(yàn) Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220在非變性條件下的IgE結(jié)合能力的條帶檢驗(yàn)
[0037]DrPhl plfft
[0038]2)Phl plNoCys[0039]3)Phl pINoCys D213—220
[0040]4)Phl pINoCys Dl-6，115-119，213-220
[0041]5)rPhl plfft
[0042]TP:總蛋白著色
[0043]P:臨床確定為草花粉變態(tài)反應(yīng)患者的血清
[0044]圖6:通過采用4個(gè)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者(P)的代表性血清樣品進(jìn)行EAST抑制試驗(yàn)，對(duì) Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的降低的IgE反應(yīng)性的確定
[0045]圖7:通過采用4個(gè)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者(P)的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)對(duì)Phl plNoCys的低變應(yīng)原性的確定
[0046]圖8:通過采用4個(gè)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者(P)的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)對(duì)Phl PlNoCysA 213-220的低變應(yīng)原性的確定
[0047]圖9:通過采用4個(gè)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者(P)的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)對(duì)Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220的低變應(yīng)原性的確定
[0048]得到上述變體的工作是以Phl Pl為模型變應(yīng)原進(jìn)行的。由圖1所示序列比對(duì)可清楚地知道由于I類變應(yīng)原之間的高同源性，即使起點(diǎn)為另一個(gè)I類變應(yīng)原，也可獲得相同的結(jié)果。
[0049]因此，一定也可以假定上下文提供的結(jié)果也適用于黑麥來源的Seccl，或言之利用Sec Cl也可以獲得這些結(jié)果，盡管該I類變應(yīng)原的序列尚未知。
[0050]因此，本發(fā)明涉及禾本科的I類變應(yīng)原的變體，其特征在于與已知野生型變應(yīng)原相比，其IgE反應(yīng)性已降低，但仍保持了與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。這些I類變應(yīng)原優(yōu)選貓尾草、黑麥草、草地早熟禾、絨毛草、狗牙根、水稻和喜濕Il草來源的Phl pUPoa PUHolpl、Lol PI > Cyn dl、0ry si 和 Pha al。更優(yōu)選的是 Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi 或 Phaal,尤其優(yōu)選的是Phl pi。
[0051]構(gòu)建I類變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體的起點(diǎn)是野生型Phl pi的cDNA，其是借助于特異性引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從貓尾草花粉的總cDNA中分離獲得(“GenBank”登錄號(hào)為 Z27090 ；NCBI, Bethesda, USA) (SEQ ID N01)。
[0052]氨基酸序列SEQ ID N02由野生型Phl pi的cDNA序列推導(dǎo)而得。
[0053]由240個(gè)氨基酸構(gòu)成的Phl pi以其天然形式被糖基化，與所有的I類變應(yīng)原一樣
(參見圖1)----特征在于成熟分子中存在7個(gè)半胱氨酸。除了 Cyn dl和Ory si,這
7個(gè)半胱氨酸在所有I類變應(yīng)原中的氨基酸位置均為41、57、69、72、77、83和139 (Petersenet al.，1995, J.Allergy Clin.Tmmunol95:987-994)。
[0054]業(yè)已在大腸桿菌中表達(dá)獲得非糖基化蛋白形式的Phl pi。該重組野生型蛋白(rPhl plwt)可與草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的IgE抗體反應(yīng),該IgE抗體具有與天然純化Phl pi (nPhl pi)的反應(yīng)性(Petersen et al., 1998, Clin.Exp.Allergy28:315-321) ?
【具體實(shí)施方式】
[0055]低變應(yīng)原性Phlpl變體的制備和表征
[0056]由上述rPhl plwt cDNA開始,制備了通過遺傳工程修飾的重組Phl pi變體。[0057]重組變體Phl plNoCys (SEQ ID N04)的氨基酸序列含有7個(gè)絲氨酸殘基，而不是野生型中存在的7個(gè)半胱氨酸(圖2)。變體Phl plNoCys充當(dāng)了構(gòu)建多種缺失突變體的起點(diǎn)。這些缺失突變體均已缺失了編碼Phl plNoCys的cDNA中長度為15_90bp的單個(gè)片段，或這些片段的組合，導(dǎo)致在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)的多肽鏈中相應(yīng)缺失了氨基酸1-6、1-30、92-104、115-119、175-185 和 213-220，從而獲得:Phl pINoCys Δ 1-6 (SEQ ID N05 和
6)、Phl plNoCysA 1-30 (SEQ ID N07 和 8)、Phl plNoCys Δ 92-104 (SEQ ID N09 和 10)、PhlplNoCys Λ 115-119 (SEQ ID NOll 和 12)、Phl plNoCys Δ 175-185 (SEQ ID NO 13 和 14)、PhlPlNoCysA 213-220 (SEQ ID N015和 16)，以及Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 (SEQ IDN017 和 18)。
[0058]這些重組蛋白在大腸桿菌內(nèi)以組氨酸融合蛋白的形式被表達(dá)。用該類型的融合蛋白進(jìn)行免疫學(xué)表征。
[0059]首先，將重組變體固定在硝酸纖維素膜上后，考察它們被代表性血清集合中IgE抗體結(jié)合的能力，和被草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的個(gè)體血清中IgE抗體結(jié)合的能力(條帶檢驗(yàn))。在該方法中，驚訝地觀察到IgE抗體與Phl plNoCys的結(jié)合減少了。該結(jié)果通過IgE抑制試驗(yàn)(EAST)得到證實(shí)，該試驗(yàn)考察了未固定蛋白與溶液中的IgE抗體的IgE結(jié)合能力。
[0060]因此，本發(fā)明尤其涉及位于相應(yīng)于成熟Phl pi蛋白氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸已被除去或被另一種氨基酸取代后獲得的I類變應(yīng)原變體。尤其優(yōu)選的是Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi或Pha al的相應(yīng)變體,更優(yōu)選的是Phl pi的變體。
[0061]如果上述7個(gè)半胱氨 酸中的至少2個(gè)被除去而未被取代，或被另一種氨基酸取代，便可使上述變體與IgE抗體的結(jié)合減少。但優(yōu)選的是所有7個(gè)半胱氨酸均被絲氨酸取代。
[0062]在效應(yīng)細(xì)胞上膜結(jié)合IgE的交聯(lián)及其體外活化期間，Phl plNoCys的降低的IgE結(jié)合能力對(duì)功能性作用的影響是通過采用草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行的活化試驗(yàn)考察的。與rPhl plwt相比,Phl plNoCys顯示對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞的活化顯著較低，因此在功能上其變應(yīng)原性也降低了。
[0063]通過相同方法，根據(jù)IgE結(jié)合能力(條帶檢驗(yàn)，EAST)和功能作用(嗜堿性粒細(xì)胞活化)考察了以Phl PlNoCys為基礎(chǔ)制備的多種缺失突變體。令人驚訝的是，這些缺失突變體表現(xiàn)出了尤其強(qiáng)的低變應(yīng)原性特性。
[0064]因此，本發(fā)明還涉及下述I類變應(yīng)原變體，即一任選地，除了上述半胱氨酸已被除去或替代后所獲變體之外---與野生型變應(yīng)原相比，在相應(yīng)于成熟Phl Pl蛋白一級(jí)序列的氨基酸位置1-6，1-30,92-104,115-119，175-185和213-220的至少一個(gè)區(qū)域或多個(gè)區(qū)域的組合缺失后所獲得的I類變應(yīng)原變體。
[0065]此處尤其優(yōu)選的是I類變應(yīng)原Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi和Pha al的相應(yīng)缺失突變體。非常優(yōu)選的是相應(yīng)的Phl pi變體。
[0066]根據(jù)上述特定優(yōu)選性，本發(fā)明同樣涉及下述I類變應(yīng)原變體，即僅缺失相應(yīng)于成熟Phl Pl序列的氨基酸213-220或同時(shí)還缺失氨基酸1_6和115-119后獲得的I類變應(yīng)原變體。此處更優(yōu)選的變應(yīng)原為Phl pU Poa pU Hol p1、Lol pi和Pha al, Phl pi尤其優(yōu)選。[0067]特異性免疫療法的功效所基于的低變應(yīng)原性Phl pi變體的T-細(xì)胞反應(yīng)性是通過采用草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的Phl Pl-特異性T-淋巴細(xì)胞進(jìn)行的增殖試驗(yàn)體外檢驗(yàn)的。該修飾變應(yīng)原顯示基本上保持了 T-細(xì)胞反應(yīng)性，從而使低變應(yīng)原性Phl Pl變體能夠被應(yīng)用于免疫治療中。
[0068]根據(jù)本發(fā)明的變應(yīng)原變體可借助于遺傳工程方法從克隆DNA序列開始制備獲得。但原理上，也可能涉及到對(duì)天然變應(yīng)原提取物的化學(xué)修飾(Fiebig, 1995,Allergo J.4(7),377-382)。
[0069]在本專利申請所述I類變應(yīng)原的變異之外，在不同位置上的進(jìn)一步修飾例如，為了增強(qiáng)低變應(yīng)原性——當(dāng)然也是可能的。這些修飾可以是，例如，氨基酸插入、缺失和交換、蛋白裂解為片段、蛋白或其片段與其它蛋白或肽的融合。本發(fā)明還涉及編碼上述變應(yīng)原變體的DNA分子，含有該DNA分子的重組表達(dá)載體以及由該DNA分子或該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。合適的宿主生物可以是原核或真核、單或多細(xì)胞生物，諸如細(xì)菌或酵母。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選宿主生物為大腸桿菌。
[0070]本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)上述宿主生物并從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的變應(yīng)原變體以制備本發(fā)明所述變應(yīng)原變體的方法。
[0071]本發(fā)明還涉及上述變應(yīng)原變體、DNA分子和表達(dá)載體作為藥物的特性。
[0072]此外，本發(fā)明還涉及被用于治療變態(tài)反應(yīng)，或用于免疫治療接種患有變態(tài)反應(yīng)的患者，和/或預(yù)防這種變態(tài)反應(yīng)的藥物組合物，其中禾本科的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)，該藥物組合物含有至少一種上述變應(yīng)原變體或相應(yīng)的DNA分子或相應(yīng)的表達(dá)載體，并進(jìn)一步任選地含有活性化合物和/或佐劑。
[0073]如果藥物組合物屬于第二種類型(含有至少一個(gè)DNA分子或表達(dá)載體)，這些組合物優(yōu)選地還含有氫氧化鋁或含有免疫刺激性CpG的寡核苷酸，或二者的組合。
[0074]就本發(fā)明的用途 而言，藥物組合物可作為治療劑被應(yīng)用在人類或獸醫(yī)學(xué)中。合適的賦形劑是適合腸胃外給藥并不與本發(fā)明所述I類變應(yīng)原變體反應(yīng)的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)。適合腸胃外應(yīng)用的尤其指溶液，優(yōu)選油或水性溶液，此外還包括懸液、乳濁液或植入物。本發(fā)明的變應(yīng)原變體還可能是凍干的，且所獲得的凍干物被用于，例如制備注射用制劑。所述組合物可能是已滅菌的和/或含有佐劑，諸如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或潤濕劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖物質(zhì)和/或多種其它活性化合物。
[0075]此外，通過例如，使合適配方的本發(fā)明變應(yīng)原變體吸附在氫氧化鋁上，可獲得緩釋制劑。
[0076]最后，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的至少一種變應(yīng)原變體或DNA分子或表達(dá)載體在制備用于治療變態(tài)反應(yīng)或用于免疫治療接種患有變態(tài)反應(yīng)的患者和/或預(yù)防這種變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途，其中禾本科的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)。
[0077]下文以具有上述遺傳工程修飾的低變應(yīng)原性Phl Pl變體為例描述了變體Phl P INoCys,Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 (圖 3)的制備以及它們的免疫學(xué)特征。
[0078]重組Phl pi變體的表達(dá)和純化
[0079]這些重組蛋白是作為組氨酸融合蛋白(表達(dá)載體pProExHT ； Invitrogen,Carlsbad,USA)在大腸桿菌(菌株JM109)中表達(dá)的。rPhlplwt和變體首先是通過N-末端組氨酸殘基與Ni2+螯合基質(zhì)(固定化金屬離子親和層析，IMAC)的特異性結(jié)合并接著通過制備型凝膠過濾(尺寸排阻層析，SEC)而得以純化的。洗脫蛋白的純度是通過SDS-PAGE和分析性SEC監(jiān)測的(圖4a)。純化蛋白的身份是通過與Phl p1-特異性單克隆抗體的結(jié)合證實(shí)的(圖4b)。
[0080]對(duì)重組Phl pi變體降低的IgE結(jié)合性的證實(shí)
[0081]證實(shí)變態(tài)反應(yīng)患者血清來源的特異性IgE在膜結(jié)合試驗(yàn)蛋白上的IgE反應(yīng)性的一種簡單試驗(yàn)方法是條帶檢驗(yàn)。
[0082]為實(shí)現(xiàn)該目的，使試驗(yàn)物質(zhì)在非變性條件下以相同的濃度和量并排結(jié)合在硝酸纖維素膜上。一組這樣的膜條帶可平行地與不同變態(tài)反應(yīng)患者來源的血清一起溫育。完成洗滌步驟后，通過由抗人IgE /堿性磷酸酶偶聯(lián)物促進(jìn)的顯色反應(yīng)，使特異性結(jié)合的IgE抗體顯現(xiàn)在膜上。
[0083]通過以上述修飾Phl Pl分子為例，本文描述了利用各草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的血清針對(duì) Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 進(jìn)行條帶檢驗(yàn)的結(jié)果(圖5)。
[0084]只有從具有抗天然Phl pi的強(qiáng)IgE滴度的變態(tài)反應(yīng)患者來源的血清可被采用。從這些患者獲得的IgE抗體同樣可與重組的相當(dāng)?shù)膔Phl plwt反應(yīng)。
[0085]從結(jié)果清楚可知的是與其同野生型變應(yīng)原Phl pi的結(jié)合程度相比，所有患者血清的Phl Pl特異性IgE抗體與重組變體Phl PlNoCys的結(jié)合程度均降低了。
[0086]正如以變體Phl plNoCysA213-220為例所述的內(nèi)容，通過另外除去某些序列片段，還可進(jìn)一步降低IgE結(jié)合能力。與未經(jīng)修飾的重組野生型蛋白相比，變體PhlPlNoCysA 213-220顯示其與 變態(tài)反應(yīng)患者來源的所有試驗(yàn)血清的IgE結(jié)合能力均非常顯著地降低了。從利用草花粉變態(tài)反應(yīng)患者血清P14，針對(duì)變體Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220試驗(yàn)的結(jié)果清楚可知，將許多缺失修飾組合可進(jìn)一步地使Phl pi與某些血清來源IgE抗體的IgE結(jié)合能力降低(圖5)。
[0087]由上清楚可知取代半胱氨酸和缺失特定序列片段均可降低Phl pi分子的IgE結(jié)合能力。
[0088]與條帶檢驗(yàn)形成對(duì)比，EAST抑制試驗(yàn)(酶變應(yīng)原吸附試驗(yàn))使我們能夠考察溶液中的變應(yīng)原/ IgE相互作用，可通過固定化到膜上以基本上排除試驗(yàn)物質(zhì)的表位被干擾遮蔽的可能性。
[0089]EAST抑制試驗(yàn)以如下方法進(jìn)行。用變應(yīng)原包被微量滴定板，此處的變應(yīng)原為nPhlPi。洗滌除去未結(jié)合的變應(yīng)原分子后，用牛血清白蛋白封閉板以阻斷隨后的非特異性結(jié)合。變態(tài)反應(yīng)患者的個(gè)體血清或代表性的個(gè)體血清集合(血清集合)來源的IgE抗體以合適的稀釋度與變應(yīng)原包被的微量滴定板一起溫育。變應(yīng)原結(jié)合的IgE抗體的量是借助于抗hlgE /堿性磷酸酶偶聯(lián)物與底物的反應(yīng)以生成有色終產(chǎn)物并通過光度測定法而得以確定的。
[0090]IgE抗體的結(jié)合被可溶性變應(yīng)原或待檢驗(yàn)物質(zhì)(重組修飾變應(yīng)原)以底物特異性方式抑制，該抑制與濃度成函數(shù)關(guān)系。
[0091]本文以上述修飾Phl Pl分子為例，對(duì)其與參考分子nPhl pi進(jìn)行比較，顯示了針對(duì) Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的試驗(yàn)結(jié)果O
[0092]圖6所示采用草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的4個(gè)個(gè)體血清進(jìn)行的代表性IgE抑制試驗(yàn)顯示，即使采用高濃度的變體Phl P INoCys (高達(dá)5μ g / ml),也僅實(shí)現(xiàn)未修飾天然變應(yīng)原nPhl pi的最大抑制作用的大約20-50%。該較低的最大抑制作用說明IgE表位喪失。
[0093]與變體Phl plNoCysA213_220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 對(duì)應(yīng)的曲線證實(shí)這些Phl Pl變體甚至具有更低的IgE結(jié)合能力。采用單個(gè)變異不能檢測到抑制作用，或僅檢測到非常低水平的抑制作用(最大抑制作用的0-20% )。
[0094]與條帶檢驗(yàn)的結(jié)果一致，該EAST抑制試驗(yàn)可證實(shí)插入另外的特異性缺失可進(jìn)一步降低Phl pi的IgE結(jié)合能力。
[0095]通過嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)對(duì)重組Phl pi變體的低變應(yīng)原性的測定
[0096]變應(yīng)原性的功能性降低是通過嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)體外測定的。該嗜堿性粒細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)是將草花粉變態(tài)反應(yīng)患者的肝素化全血與多個(gè)濃度的試驗(yàn)物質(zhì)一起溫育。變應(yīng)原性物質(zhì)被嗜堿性粒細(xì)胞的Fe ε Rl結(jié)合的IgE抗體特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致了 Fe ε Rl分子的交聯(lián)。
[0097]該變應(yīng)原誘導(dǎo)的，IgE促進(jìn)的Fe ε RI交聯(lián)導(dǎo)致了嗜堿性粒細(xì)胞的活化。該活化是這些效應(yīng)細(xì)胞的變應(yīng)性反應(yīng)的第一步。后繼的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)致使效應(yīng)細(xì)胞的脫粒，從而觸發(fā)體內(nèi)的變應(yīng)原性反應(yīng)。
[0098]在體外，變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞活化可通過與IgE受體交聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)的表面蛋白(CD203c)的表達(dá)的定量而得以確定(Kahlert et al.,2003, Cl1.，Exp.Allergy33:1266-72)。細(xì)胞上表達(dá)的CD203c蛋白數(shù)量和細(xì)胞集合中活化細(xì)胞的百分比是通過下述方法以高靈敏度測定的`，即借助于熒光標(biāo)記的單克隆抗體與表面標(biāo)記的結(jié)合并接著通過熒光活化的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。此處所應(yīng)用的參考物質(zhì)是純化天然Phlpi (nPhl pi),與試驗(yàn)物質(zhì)平行。本文以上述修飾Phl pi分子為例顯示了與Phl plNoCys、Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果。
[0099]圖7所示曲線顯示了變體Phl plNoCys與4個(gè)臨床確定為變態(tài)反應(yīng)患者來源的嗜堿性粒細(xì)胞的代表性試驗(yàn)結(jié)果。通過該活化曲線中的偏移便可清楚變體Phl plNoCys相對(duì)于野生型nPhl pi的變應(yīng)原性效力的降低。
[0100]與條帶檢驗(yàn)和IgE抑制試驗(yàn)的結(jié)果一致，變體Phl PlNoCys Λ 213-220和PhlPlNoCysA 1-6，115-119，213-220的試驗(yàn)結(jié)果顯示了相對(duì)變應(yīng)原性效力的更大程度的降低，如圖8和9的代表性曲線所示。
[0101]盡管有最大比例的嗜堿性粒細(xì)胞已被試驗(yàn)物質(zhì)濃度范圍為ΙΟΟ-ΙΟΟΟρΜ的天然變應(yīng)原活化，采用修飾變應(yīng)原 Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCysA 1-6，115-119，213-220時(shí)仍未或僅檢測到極低的嗜堿性粒細(xì)胞活化。
[0102]正如根據(jù)曲線的A50值計(jì)算的結(jié)果，與參考nPhl pi (A50:已活化嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到最大數(shù)量的50%時(shí)的變應(yīng)原濃度)相比，變體Phl plNoCys Λ 213-220的變應(yīng)原性效力降低了約100-1000倍，變體Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220的變應(yīng)原性效力則被降低了 1000倍以上。
[0103]低變應(yīng)原性Phl pi變體的T-細(xì)胞反應(yīng)性
[0104]T輔助淋巴細(xì)胞可與特定變應(yīng)原肽片段(大約12-25個(gè)氨基酸)反應(yīng),該變應(yīng)原肽片段通過抗原呈遞細(xì)胞(APCs)中的酶促降解而形成，并在合適的肽被包含進(jìn)APCs表面上的單個(gè)MHC Il類分子之后被呈遞到T-細(xì)胞。T輔助淋巴細(xì)胞的變應(yīng)原特異性活化是增殖和功能性分化(THl和TH2)的前提。在脫敏期間采用變應(yīng)原或變應(yīng)原衍生物的治療對(duì)該變應(yīng)原特異性T-淋巴細(xì)胞的影響被認(rèn)為是治療效力的關(guān)鍵。
[0105]為考察T細(xì)胞反應(yīng)性，通過采用nPhl pi或rPhl plwt分子刺激的常規(guī)方法建立了草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源的寡克隆T-細(xì)胞系。在增殖試驗(yàn)中，采用了參考變應(yīng)原nPhl pi和rPhl plwt和經(jīng)過修飾的重組Phl pi變體刺激多個(gè)T-細(xì)胞系。增殖率是通過常規(guī)方法摻入[3H]-胸腺核苷酸測定的。
[0106]本文以上述修飾Phl pi分子為例顯示了 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220和Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的增殖試驗(yàn)結(jié)果。
[0107]表1所列采用8個(gè)草花粉變態(tài)反應(yīng)患者來源T-細(xì)胞系的試驗(yàn)結(jié)果顯示以重組變應(yīng)原變體刺激T-淋巴細(xì)胞增殖是可能的。與未經(jīng)修飾的天然和重組野生型變應(yīng)原相比，PhlPINoCys, Phl plNoCys Δ 213-220 和 Phl plNoCysA 1-6,115-119，213-220 的 T-細(xì)胞反應(yīng)性僅輕微降低，這證實(shí)了關(guān)鍵T-細(xì)胞表位的保留。
[0108]表1:通過采用Phl pi反應(yīng)性T-細(xì)胞系(TCLs)進(jìn)行的增殖試驗(yàn)對(duì)PhlplNoCys、Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的 T-細(xì)胞反應(yīng)性的測定
【權(quán)利要求】
1.Phl Pl變體，其特征在于與已知野生型變應(yīng)原相比，其IgE反應(yīng)性降低，并基本保持了 T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)性，并且，相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸缺失。
2.權(quán)利要求1的Phlpi變體，其特征在于相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸被另一種氨基酸取代。
3.權(quán)利要求2的Phlpi變體，其特征在于相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸被絲氨酸取代。
4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的Phlpi變體，其特征在于與野生型變應(yīng)原相比，相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi蛋白一級(jí)序列中氨基酸1-6、1-30、92-104、115-119、175-185和213-220的至少一個(gè)區(qū)域或多個(gè)區(qū)域的組合缺失。
5.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的Phlpi變體，其中相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi序列的氨基酸213-220缺失。
6.權(quán)利要求4的Phlpi變體，其中相應(yīng)于圖1中所示成熟Phl pi序列的氨基酸1-6、115-119 和 213-220 缺失。
7.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的Phlpi變體，其特征在于它們通過重組遺傳工程方法獲得。
8.編碼權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的Phlpi變體的DNA分子。
9.重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求8的DNA分子。
10.由權(quán)利要求8的DNA分子或權(quán)利要求9的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主生物，所述宿主生物是細(xì)菌或酵母。
11.制備權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的PhlPl變體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主生物，并從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的Phl pi變體。
12.權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的Phlpi變體在制備藥物中的用途。
13.用于預(yù)防和治療變態(tài)反應(yīng)的藥物組合物，含有至少一種權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的Phl Pl變體，其中禾本科物種的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其含有其它活性化合物和/或佐劑。
15.至少一種權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的Phlpi變體在制備用于預(yù)防和治療變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途，其中禾本科物種來源的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)。
16.權(quán)利要求8的DNA分子在制備藥物中的用途。
17.權(quán)利要求9的重組表達(dá)載體在制備藥物中的用途。
18.用于對(duì)患有變態(tài)反應(yīng)的患者進(jìn)行免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防這種變態(tài)反應(yīng)的藥物組合物，其中禾本科的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)，所述組合物含有至少一種權(quán)利要求8的DNA分子或至少一種權(quán)利要求9的表達(dá)載體。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其含有其它活性化合物和/或佐劑。
20.至少一種權(quán)利要求8的DNA分子或至少一種權(quán)利要求9的表達(dá)載體在制備用于對(duì)患有變態(tài)反應(yīng)的患者進(jìn)行免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防這種變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途，其中禾本科的I類變應(yīng)原參與所述變態(tài)反應(yīng)的觸發(fā)。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103467583SQ201310439265
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2005年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2004年7月21日
【發(fā)明者】H.菲比格, M.沃爾德, A.南迪, H.卡勒特, B.韋伯, O.克羅姆維爾 申請人:默克專利股份公司