可促進皮膚修復與再生的美容護膚品及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品及其制備方法和應用。該方法包括（1）配置培養液；（2）將對數期的干細胞以1x10^4/ml至1x10^6/ml的密度接種于培養液中37℃培養3-72小時；（3）采用共培養的方法，或者向細胞培養液中添加細胞因子的方法，將間充質干細胞激活使其分泌活性物質；（4）去除培養液中的細胞收獲上清液，即得精華液；還包括（5）降解、制劑：將精華液進一步降解，得到適于皮膚吸收的精華液；再將該精華液加入到美容護膚品配方中制成各種不同劑型的美容護膚品。該美容護膚精華液中含細胞培養液中的營養成分，還含活性因子TIMP-1，1.0～5.0mg/L；MCP-1，100～500μg/L；EGF，5～50μg/L。本發明的美容護膚品易于被皮膚吸收，可促進皮膚修復與再生。
【專利說明】可促進皮膚修復與再生的美容護膚品及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物美容化妝品【技術領域】，具體涉及一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]目前市場上常見的美容護膚品有膏、霜、乳、液、凝膠等多種劑型，一般由具有美容功效的成分添加賦形劑(乳化劑、增稠劑等)制成。常用的美容功效成分有:有機小分子(如甘油、丁二醇、水楊酸)、有機大分子(如PEG等聚合物、交聯物)、無機物(如二氧化鈦)、生物制品(如重組表皮生長因子)等，以及植物提取物(如蘆薈、薰衣草)、動物源成分(如蛇油)、礦物成分(如石蠟、滑石粉等)等。
[0003]干細胞是一種具有分化潛能的種子細胞，具有無限的自我更新復制能力，在一定條件下能分化成特定組織。干細胞在生長、增殖、分化過程中會向胞外分泌促進細胞生長及調節周圍環境的細胞因子等活性物質。哺乳動物的干細胞在培養過程中，細胞會向胞外分泌大量的皮膚修復因子和傷口愈合因子等活性物質，進入培養后的細胞培養液中。以哺乳動物的間充質干細胞為例，其在體外培養過程中向培養液中釋放的活性物質主要有IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白I (MCP-1)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、組織基質金屬蛋白酶抑制因子Ι(--ΜΡ-Ι)等，具有調節免疫反應、激活細胞活動的作用。
[0004]間充質干細胞具有自我復制能力和多向分化潛能，并有造血支持和促進干細胞植入、免疫調節等能力；其多向分化潛能表現為，在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、皮膚、肌 肉、神經、肝、心肌、內皮等多種組織的細胞，特別是具有分化為成纖維細胞(皮膚真皮層的主要構成細胞)和表皮細胞的能力。間充質干細胞來源于發育早期的中胚層和外胚層，最初在骨髓中發現，后來發現也可從胎盤、臍帶、脂肪等多種組織中分離到。
[0005]經鑒定體外培養的間充質干細胞能夠向培養液中分泌--ΜΡ-1、MCP-1和EGF三種細胞因子。
[0006]人組織基質金屬蛋白酶抑制因子I (TIMP-1, Tissue Inhibitor ofMetallo-Proteinase I)是一個分子量為28.5kD的糖蛋白，全長約207個氨基酸，其中1-23為信號肽。--ΜΡ-1是--ΜΡ家族中的一員，是基質金屬蛋白酶(MMP，MatrixMetallo-Proteinase)的天然抑制因子，而MMP參與細胞外基質的降解。--ΜΡ-1還具有促進多種類型的細胞增殖的作用，還可能有抗細胞凋亡的功能。--ΜΡ-1可為許多類型的細胞所表達，并存在于多種組織和體液中。TIMP分子中有大量的二硫鍵，因此可抵抗極端溫度、pH和變性等惡劣環境。
[0007]單核細胞趨化蛋白I (MCP-1, Monocyte Chemotactic Protein I)又稱單核細胞趨化和激活因子(Monoctye Chemotactic and Activating Factor, MCAF),人 MCP-1 前體長99個氨基酸，1-23為信號肽，成熟分子長76個氨基酸，非糖基化分子量8.7kD，糖基化后MCP-1分子量13kD，為堿性蛋白。目前已知MCP-1可由單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞在細胞因子或某些病毒刺激下分泌。MCP-1對單核細胞具有趨化活性，激活單核細胞和巨噬細胞，活化的巨噬細胞可抑制腫瘤細胞的生長。MCP-1也是嗜堿性粒細胞的趨化劑和激活劑。
[0008]人表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)由53個氨基酸組成，分子量
6.2kD，無糖基部位，非常穩定，耐熱耐酸，廣泛存在于體液和多種腺體中，主要由頜下腺、十二指腸合成，在人體的絕大多數體液中均已發現，在乳汁、尿液、精液中的含量特異性地增高，但在血清中的濃度較低。EGF可刺激多種細胞的增殖，主要是表皮細胞、內皮細胞。在角膜損傷、燒燙傷及手術等創面的修復和愈合上取得了很好的療效，Montalcini和Cohen教授因為發現表皮生長因子并分析其結構和作用機理，獲得1986年諾貝爾生理學及醫學獎。
[0009]而細胞培養液由氨基酸、維生素、糖、微量元素、抗氧化劑等成分組成，各成分及其濃度和PH系根據細胞生長和增殖的需要按比例添加，具有細胞生長和增殖所需的全部營養成分，并且處于最優濃度。
[0010]將細胞培養液營養成分與培養于其中的離體活細胞在特定條件下分泌的活性物質結合起來，可制成易于被皮膚吸收的美容護膚品的功效成分，具有補充皮膚營養、修復皮膚損傷、激活皮膚細胞更新、減輕炎癥反應的作用。如何將間充質干細胞充分激活，使其分泌更多有助于皮膚修復和增強活力的物質，制成可促進皮膚修復與再生的美容護膚品，是本領域面臨的一大課題。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于提供一種能使間充質干細胞分泌更多皮膚修復活性物質，可促進皮膚修復與再生的美容護膚`品及其制備方法和應用，與現有技術相比更符合皮膚細胞生活和更新、再生對營養的需求。
[0012]本發明的技術方案如下:
[0013]一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品的制備方法，按以下步驟順序進行:
[0014](I)培養液配置:
[0015]配置間充質干細胞無血清培養液，其成分中含有氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細胞生長因子；具體如下:
[0016]間充質干細胞培養液:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-β +PDGF
[0017](2)細胞培養:
[0018]將對數期的間充質干細胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接種于上一步配置的培養液中，37°C培養3-72小時；所述的間充質干細胞是哺乳動物的間充質干細胞，包括骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、胎盤間充質干細胞；
[0019](3)細胞激活:
[0020]采用將另一種類型的細胞與培養液中原來的細胞共培養的方法，或者采用向細胞培養液中添加細胞因子的方法將間充質干細胞激活，使其分泌有助于皮膚修復和增強活力的物質；
[0021](4)去除細胞、收獲上清液:[0022]去除培養液中的所有細胞，收獲細胞培養后的上清液，即得富含細胞活性因子的皮膚修復精華液。
[0023]上述可促進皮膚修復與再生的美容護膚品的制備方法，還可增加如下步驟:
[0024](5)降解、制劑:
[0025]往上一步制得的皮膚修復精華液中添加能夠分解蛋白的物質(優選胰蛋白酶)，將其中的大分子蛋白質降解為短肽，然后去除分子量超過3500道爾頓的物質，得到富含細胞活性因子且適于人體皮膚吸收的皮膚修復精華液；之后，再將該皮膚修復精華液，加入到各種美容護膚品的配方中，制成可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護膚品。(即經添加其它組分，工藝變化后可制成水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產品、粉劑等產品，可起到皮膚修復與再生的同樣功效，同時可提高除菌有效期。)
[0026]上述方法步驟(4)中所述的去除培養液中的細胞的方法是離心和/或過濾。
[0027]上述方法步驟(3)中所述的具體的細胞激活方法如下:
[0028]間充質干細胞激活方法I (共培養法):
[0029]A.配置神經干細胞培養液:StemPro神經干細胞無血清培養液(StemPro NSCSFM,購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01 )+GlutaMax 補充劑(購自 Lifetechnologies公司，貨號35050-061)
[0030]B.將神經干細胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養液中，培養24-72小時，至對數期；
[0031]C.收獲神經干細胞(如采用離心法)，以2:1~1:2的數量比添加到步驟(2)中的間充質干細胞培養物中，共培養12-24小時。
[0032]間充質干細胞激活方法2 (添加含有神經干細胞分泌物的培養濃縮液法):
[0033]A.配置神經干細胞培養液:StemPro神經干細胞無血清培養液(StemPro NSCSFM,購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01 )+GlutaMax 補充劑(購自 Lifetechnologies公司，貨號35050-061)
[0034]B.將神經干細胞以lxl0~5/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養液中，培養24-48小時；
[0035]C.去除神經干細胞(采用離心或過濾的方法)，將剩余的培養液(其中含有神經干細胞分泌物)濃縮至原先體積的1/5~1/20 (這個濃縮比例是與后面的添加比例掛鉤的；如果濃縮到1/5，下一步的體積添加比例就是2-20% ;如果濃縮到1/20，下一步的體積添加比例就是0.5-5% ;如果濃縮到1/10，下一步的體積添加比例就是1-10%)；
[0036]D.將濃縮液以0.5-20%的體積比添加到步驟(2)中的間充質干細胞培養液中，繼續培養6-24小時。
[0037]上述神經干細胞培養液組分中:
[0038]StemPro神經干細胞無血清培養液(StemProNSCSFM)是本領域熟知的培養基試劑盒,可以購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01，試劑盒由 KNOCKOUT DMEM/F12 (貨號 12660-012)、重組人 bFGF (貨號 PHG0024)、重組人 EGF (貨號 PHG0314)、StemPro NeuralSupplement (貨號 A10508-01)組成。
[0039]KN0CK0UTDMEM/F12是Lifetechnologies公司提供的一種不含L-谷氨酰胺或HEPES緩沖液的低滲透壓培養基，貨號12660-012，經過優化，用于人胚胎干細胞和誘導的多能干細胞的生長。
[0040]bFGF (堿性成纖維細胞生長因子)是本領域已知的一種細胞因子，其對成纖維細胞、血管內皮細胞、神經元和神經膠質細胞等多種細胞具有很強的促細胞分裂增殖活性。
[0041]EGF (表皮生長因子)是本領域已知的一種細胞因子，其可刺激上皮細胞和多種細胞增殖。
[0042]StemPro Neural Supplement 是Lifetechnologies 公司提供的一種無血清營養補充劑，貨號A10508-01，可用于人源和鼠源神經干細胞、神經祖細胞的生長和擴增。
[0043]GlutaMax補充劑可以購自Lifetechnologies公司，貨號35050-061,配方是200mML-乙酰-L-谷氨酰胺二肽(溶解于0.85%氯化鈉溶液)。
[0044]一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品，它是通過上述方法中的步驟(1)到步驟(4)使用哺乳動物的間充質干細胞制備而成的皮膚修復精華液；其中含有體外培養的間充質干細胞分泌到胞外的活性物質成分，還含有細胞培養液配置步驟中添加的營養成分(氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細胞生長因子)；經進一步鑒定，這些成分包括細胞分泌到胞外的組織基質金屬蛋白酶抑制因子I (TIMP-1)、單核細胞趨化蛋白I (MCP-1)和表皮細胞生 長因子(EGF)，并且其濃度分別為:
[0045]組織基質金屬蛋白酶抑制因子I (--ΜΡ-1)，1.0~5.0mg/L ；
[0046]單核細胞趨化蛋白1 (MCP-1)，100~500 μ g/L ；
[0047]表皮細胞生長因子(EGF)，5~50 μ g/L ;
[0048]該美容護膚品(即皮膚修復精華液)可用于修復美化表皮破損的皮膚。
[0049]另一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品，它是通過上述方法中的步驟(1)到步驟(5)制備而成，即:它是將上述皮膚修復精華液進一步用胰蛋白酶或其它能夠分解蛋白的物質(如:木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)分解，再將其加入到各種美容護膚品的配方中，制成的可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產品、粉劑；其中的精華液中含有上述濃度的組織基質金屬蛋白酶抑制因子1、單核細胞趨化蛋白I和表皮細胞生長因子經胰蛋白酶或其它能夠分解蛋白的物質分解后產生的短肽；
[0050]該美容護膚品可用于修復美化表皮無破損的皮膚。
[0051]本發明的有益效果:
[0052]本發明將細胞培養液營養成分與培養于其中的干細胞在特定條件下分泌的活性物質結合起來，利用干細胞生長過程中產生的細胞因子(--ΜΡ-1、MCP-1和EGF等)，把干細胞培養液離心去除細胞后的上清液作為皮膚修復美容護膚產品；同時，在干細胞培養過程中，采用特殊的細胞激活方法，使間充質干細胞分泌更多皮膚修復活性物質，從而制得可促進皮膚修復與再生的美容護膚品。有科學研究表明TIMP-1、MCP-1具有促進皮膚創傷愈合作用，可治療皮膚創傷和糖尿病足；bFGF、EGF有皮膚組織修復和促進皮膚細胞增殖的作用，可用于燒燙傷皮膚治療。從哺乳動物干細胞培養液中收集獲得具有細胞生命本性的細胞因子，則成為最適合人體皮膚細胞，乃至其它器官生長的營養源。
[0053]本發明提供了一種從干細胞培養液中制備獲得安全、有效的皮膚修復美容護膚品的方法及其產品，成為人體皮膚修復的新途徑。本發明的方法簡單易行，使用設備簡單，可以利用干細胞培養液，通過進一步改進，獲得一種安全低成本的高科技生物美容護膚產品，其優勢顯著。本發明的美容護膚品具有促進皮膚傷口愈合、修復皮膚受損表面和促進皮膚再生的功效。該美容護膚品與人體有良好的相容性，易于被人體吸收，對皮膚細胞生長有良好的促進作用，能促進皮膚創面愈合，加快細胞新陳代謝，增強皮膚細胞活力。
【具體實施方式】
[0054]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明:
[0055]實施例1:
[0056](一)、本發明的一種美容護膚啫喱制備方法:
[0057](I)培養液配置步驟:
[0058]按以下配方配置間充質干細胞無血清培養液(所用試劑均購自Lifetechnologies
公司):
【權利要求】
1.一種可促進皮膚修復與再生的美容護膚品的制備方法，其特征在于，按以下步驟順序進行:(1)培養液配置:配置間充質干細胞無血清培養液，其成分中含有氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細胞生長因子；(2)細胞培養: 將對數期的間充質干細胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接種于上一步配置的培養液中，37°C培養3-72小時；所述的間充質干細胞是哺乳動物的間充質干細胞，包括骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、胎盤間充質干細胞；(3)細胞激活:采用細胞激活方法將間充質干細胞激活，使其分泌有助于皮膚修復和增強活力的物質；所述的細胞激活方法是:將另一種類型的細胞與培養液中原來的細胞共培養的方法，即共培養法；或者是，采用向細胞培養液中添加細胞因子的方法；(4)去除細胞、收獲上清液:去除培養液中的所有細胞，收獲細胞培養后的上清液，即得富含細胞活性因子的皮膚修復精華液。
2.如權利要求1所述的美容護膚品的制備方法，其特征在于，該方法還包括步驟(5)降解、制劑:往上一步制得的皮膚修復精華液中添加能夠分解蛋白的物質，將其中的大分子蛋白質降解為短肽，然后去除分子量超過3500道爾頓的物質，得到富含細胞活性因子且適于人體皮膚吸收的皮膚修復精華液；之后，將該皮膚修復精華液，加入到各種美容護膚品的配方中，制成可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產品、粉劑。
3.如權利要求1或2所述的美容護膚品的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的間充質干細胞無血清培養液為:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-0 +PDGF。
4.如權利要求1或2所述的美容護膚品的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的去除培養液中的所有細胞的方法是:離心和/或過濾。
5.如權利要求2所述的美容護膚品的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述的能夠分解蛋白的物質是胰蛋白酶。
6.如權利要求1或2所述的美容護膚品的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的共培養法，是將神經干細胞與培養液中原來的間充質干細胞共培養的方法，具體按如下步驟進行:A.配置神經干細胞培養液=StemPro神經干細胞無血清培養液+GlutaMax補充劑；B.將神經干細胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養液中，培養24-72小時，至對數期；C.收獲神經干細胞，以2:1~1:2的數量比添加到步驟(2)中的間充質干細胞培養物中，共培養12-24小時；步驟(3 )中所述的向細胞培養液中添加細胞因子的方法，是向間充質干細胞培養液中添加含有神經干細胞分泌物的培養濃縮液法，具體按如下步驟進行:A.配置神經干細胞培養液=StemPro神經干細胞無血清培養液+GlutaMax補充劑；B.將神經干細胞以lxl0~5/ml至5X10~5/ml的密度接種于上一步配置的神經干細胞培養液中，培養24-48小時；C.采用離心或過濾的方法去除神經干細胞，將剩余的其中含有神經干細胞分泌物的培養液，濃縮至原先體積的1/5~1/20 ；D.將濃縮液以0.5-20%的體積比添加到步驟(2)中的間充質干細胞培養液中，繼續培養6-24小時。
7.一種按權利要求1所述的方法制備得到的可促進皮膚修復與再生的美容護膚品，其特征在于，它是使用哺乳動物的間充質干細胞按所述方法制備而成的皮膚修復精華液；其中含有體外培養的間充質干細胞分泌到胞外的活性物質成分，還含有細胞培養液配置步驟中添加的營養成分氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細胞生長因子；其中，含有的間充質干細胞分泌到胞外的組織基質金屬蛋白酶抑制因子1、單核細胞趨化蛋白I和表皮細胞生長因子的濃度分別為:組織基質金屬蛋白酶抑制因子I, 1.0~5.0mg/L ；單核細胞趨化蛋白1，100~500 μ g/L ；表皮細胞生長因子，5~50 μ g/L。
8.按權利要求7所述的可促進皮膚修復與再生的美容護膚品，其特征在于，它是將所述皮膚修復精華液進一步用能夠分解蛋白的物質分解，再將其加入到各種美容護膚品的配方中，制成的可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產品、粉劑。
9.如權利要求7所述的可促進皮膚修復與再生的美容護膚品在修復美化表皮破損的皮膚中的應用。
10.如權利要求8所述的可促進皮膚修復與再生的美容護膚品在修復美化表皮無破損的皮膚中的應用。
【文檔編號】A61K8/64GK103550117SQ201310493266
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】金宜強, 劉軍, 楊立敏 申請人:上海潤生生物技術有限公司