姜黃素與銀杏內酯b配伍組合物及其應用的制作方法
【專利摘要】姜黃素與銀杏內酯B配伍的組合物及其應用，屬于醫藥領域，姜黃素與銀杏內酯B配伍的組合物由下列重量比的藥物均勻混合制成：姜黃素1-8份，銀杏內酯B1份。該藥物組合物治療多囊腎病具有協同作用，優于單一用藥。
【專利說明】姜黃素與銀杏內酯B配伍組合物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及姜黃素與銀杏內酯B配伍的藥物組合物的制備及應用。
【背景技術】 [0002]多囊腎病是一種常見的單基因遺傳性疾病，分為常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)與常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)，發病率分別為1/1000 - 1/400和1/40000-1/10000 (Jin He, Jianhua Ye, Qiuyan Li, et al.Construction of atransgenic pig model overexpressing polycystic kidney disease 2 (PKD2) gene.Transgenic Res, 2013, DO1: 10.1007/sll248-012-9686_z.)。其中 ADPKD 發病率高、危害大，以雙腎出現多發性進行性大小不一的囊泡為主要特征，還引起肝囊腫、胰腺囊腫、心瓣膜病等腎外病變，常在成人期導致腎功能衰竭甚至死亡，目前除腎移植和透析外，尚無特效藥物，給患者、家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。
[0003]多囊腎病的發病機制主要包括:囊泡上皮細胞的過度增殖與囊液的分泌兩方面。囊泡上皮細胞的過度增殖主要涉及EGFR的過度表達與異常定位(Aguiari G, CatizoneL, Del Senno L.Multidrug therapy for polycystic kidney disease: a review andperspective.Am J Nephrol, 2013, 37(2): 175-182.)，以及下游的 Ras-MAPK 信號通路(Xu T, Wang NS, Fu LL, et al.Celecoxib inhibits growth of human autosomaldominant polycystic kidney cyst-lining epithelial cells through the VEGF/Raf/MAPK/ERK signaling pathway.Mol Biol Rep, 2012， 39(7): 7743-7753.)和m-T0R 信號通路(Jardine MJ, Liyanage T, Buxton E, et al.mTOR inhibition inautosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD): the question remainsopen.Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(2): 242-244.)，此外，cAMP信號通路、Wnt 信號通路和JAK-STAT信號通路等也參與了囊泡上皮細胞過度增殖這一病理過程。囊液的分泌主要涉及囊性纖維化跨膜轉導調節因子(CFTR) (Yang B, Sonawane ND, Zhao D, et al.Smal1-molecule CFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease.JAm Soc Nephrol, 2008，19:1300-1310.)、水通道(Aquaporin, AQP)(高晉生，李囿松.姜黃素體外調控AQP2表達抑制MDCK囊泡生成的實驗研究.山西中醫.2012，28(8):47-48，53.)、Na+-K+-ATP酶(許書添，姚小丹.多囊腎病發病機制和治療.腎臟病與透析腎移植雜志.2010，19(4): 367-372.)等。這兩個病理過程由基因突變引起，ADPKD致病基因為PKDl和PKD2。如圖2所示，PKDl與PKD2基因編碼的蛋白分別稱為多囊蛋白I (polycystin-1, PCI)和多囊蛋白 2 (polycystin-2, PC2)。PCl 是上皮細胞膜受體,PC2具有鈣離子通道的作用，兩者相互作用，可以維持腎上皮細胞內Ca2+的正常濃度。當PKDl或PKD2基因發生突變時，細胞內Ca2+濃度降低，cAMP水平增高，后者通過影響細胞內相關信號傳導通路，引起囊泡細胞的過度增殖和囊液的分泌，促進囊泡的形成與生長(高晉生，楊寶學.常染色體顯性遺傳多囊腎病的治療研究進展.中國藥理學通報2009，25(2):141-144.)。[0004]姜黃素(curcumin, Cur)是從天然植物姜黃等的根莖中提取的一種多酹類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、抗血管生成等多種藥理作用。銀杏內酯(ginkgolides)是從銀杏中提取得到的一種萜類內酯類化合物，包括銀杏內酯A、B、C、J、K、L和M，銀杏內酯是血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)抑制劑，其中，銀杏內酯B(ginkgolideB, GB)是銀杏內酯中藥理活性最強的一種。研究表明，銀杏內酯B具有抗炎、抗氧化、抗過敏、神經保護等作用(Xia SH, Fang DC.Pharmacological action andmechanisms of ginkgolide B.Chin Med J, 2007, 120 (10): 922-928.)。
[0005]我們研究發現了姜黃素(JinshengGao, Hong Zhou, Tianluo Lei, et al.Curcumin inhibits renal cyst formation and enlargement in vitro by regulatingintracellular signaling pathways.European Journal of Pharmacology, 2011,654(1): 92-99.)、銀杏內酯B (Hong Zhou, Jinsheng Gao, Li Zhou, et al.GinkgolideB inhibits renal cyst development in in vitro and in vivo cyst models.AJP RenalPhysiology, 2012，302(10): F1234-1242.)的抗囊泡生成作用，并發現兩者均可通過調控Ras/MAPK信號通路抑制體外囊泡上皮細胞的過度增殖。其中B_raf與Raf-1是這條信號通路的關鍵調控點，Ras/B-raf/MEK/ERK信號通路的激活促進了囊泡上皮細胞的過度增殖，而Ras/Raf-1/MEK/ERK信號通路的激活使囊泡上皮細胞的增殖恢復正常。多囊腎病發病過程中，B-raf過表達，而Raf-1被抑制，我們研究發現二者可下調B_raf表達，上調Raf-1表達，從而使囊泡細胞增殖恢復正常。
[0006]盡管姜黃素、銀杏內酯B均具有抑制囊泡生長的作用，但單用二者效果并不令人滿意，目前，姜黃素與銀杏內酯B配伍治療多囊腎病是否具有協同作用，即實現1+1>2的作用國內外尚未見報道。應用MDCK囊泡模型，我們發現姜黃素、銀杏內酯B單獨用藥均抑制囊泡的形成，二者作用后囊泡形態明顯不同，姜黃素作用后的囊泡呈厚壁小囊泡或圓形的細胞集落，銀杏內酯B作用后的囊泡呈薄壁小囊泡或不規則細胞集落，提示二者作用機制存在不同。應用PKDl基因敲除小鼠，我們發現姜黃素、銀杏內酯B單獨用藥均抑制腎囊泡的生長，二者作用后小鼠精神狀態`不同，姜黃素作用后小鼠精神狀態良好，銀杏內酯精神狀態較差，提示姜黃素可能同時具有抗抑郁作用。因此我們通過姜黃素配伍銀杏內酯B進行體內外的囊泡抑制研究，發現兩者配伍重量之比在1:1-8:1時具有協同作用，作用后MDCK囊泡多呈小的圓形的細胞集落(MDCK囊泡抑制率高達90.46%)，小鼠腎囊泡減少變小(小鼠腎囊泡抑制率高達87.93%)，精神狀態良好，生存時間明顯延長(小鼠生存期延長率61.40%)。

【發明內容】

[0007]本發明涉提供治療效果更好的一種姜黃素與銀杏內酯B配伍的藥物組合物。
[0008]姜黃素與銀杏內酯B配伍的藥物組合物，姜黃素與銀杏內酯B重量份之比為I~8:1。
[0009]姜黃素與銀杏內酯B配伍的藥物組合物用于治療多囊腎病。
[0010]姜黃素與銀杏內酯B配伍的藥物組合物可直接藥用，或添加合適的輔料制成片齊?、膠囊、□服液、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、注射劑、栓劑、貼劑、滴劑、噴霧劑、霜劑、混懸劑、酊劑、乳劑、滴丸或粉劑進行使用。
[0011]本發明所述姜黃素與銀杏內酯B配伍藥物組合物的成人(60kg)用量為:每日姜黃素為528~4224mg (注射)，銀杏內酯B為264~528mg (注射)，姜黃素與銀杏內酯B配伍重量之比在1:1~8:1，分早晚兩次用藥。
[0012]本發明通過姜黃素配伍銀杏內酯B進行體內外的囊泡抑制研究，發現兩者具有協同作用，MDCK囊泡抑制率高達90.46% (單用姜黃素、銀杏內酯B分別僅為63.82%,66.73%)；小鼠腎囊泡抑制率高達87.93% (而單用姜黃素、銀杏內酯B分別僅為41.22%,46.43%);小鼠生存期延長率61.40% (而單用姜黃素、銀杏內酯B分別僅為20.18%,7.02%)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0013]圖1為姜黃素的化學結構式。
[0014]圖2為銀杏內酯B的化學結構式。
[0015]圖3為MDCK囊泡與細胞集落。
[0016]圖4為姜黃素聯合銀杏內酯B對MDCK囊泡形成的抑制作用表。
[0017]圖5為MTT檢測姜黃素對MDCK細胞的細胞毒性圖。
[0018]圖6為MTT檢測銀杏內酯B對MDCK細胞的細胞毒性圖。
[0019]圖7為姜黃素聯合銀杏內酯B對PKDl基因敲除小鼠腎囊泡生長的抑制作用表。
[0020]圖8為姜黃素聯合銀杏內酯B對PKDl基因敲除小鼠生存期的影響圖。
[0021]圖9為姜黃素對MDCK細胞信號轉導通路的作用圖。
[0022]圖10為銀杏內酯B對MDCK細胞信號轉導通路的作用圖。
【具體實施方式】
[0023]下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0024]實施例1:姜黃素聯合銀杏內酯B對MDCK囊泡形成的抑制作用
犬腎細胞(MDCK)在三維基質膠中培養時受cAMP刺激形成囊泡，并可持續生長。forskolin是腺苷酸環化酶的激活劑,腺苷酸環化酶可介導cAMP的生成，因此forskolin可促進MDCK囊泡形成和生長，其囊泡特性與多囊腎囊泡的特性相似，是篩選評價化合物治療多囊腎藥理活性的最佳體外模型。
[0025]將MDCK細胞(北京大學醫學部藥理系贈送)分別培養于含不同藥物的三維基質膠24孔板中，其中含有IOmM forskolin (FSK，佛司可林，購自美國Sigma公司)和姜黃素(購自美國Sigma公司，商品目錄號C1386，濃度分別為0mM、0.4mM、2mM、IOmM)聯合銀杏內酯B(購自Sigma公司，商品目錄號G6910,濃度分別為0.125mM、0.5mM、2mM)的不同配伍方案,每孔大約400個細胞，每組設3個平行孔。培養4-5天后，在含有IOmM forskolin的培養孔中形成MDCK細胞的囊泡。培養第6天時，計數圓形囊泡(直徑大于50mm)和非囊泡細胞的集落，計算囊泡占總細胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分率。實驗設三次重復，囊泡占總細胞集落的百分率為39.82 ±0.75%。囊泡與非囊泡細胞的形態如圖3所示。姜黃素聯合銀杏內酯B對MDCK囊泡形成的抑制作用如圖4所示。從圖4、圖5中可以看出，姜黃素、銀杏內酯B作用后囊泡形態明顯不同，姜黃素作用后的囊泡大多呈厚壁小囊泡，銀杏內酯B作用后的囊泡大多呈薄壁小囊泡，姜黃素配伍銀杏內酯B作用后MDCK囊泡大多呈小的圓形的細胞集落，提示二者作用機制存在不同。從圖5中可以看出，中低劑量姜黃素聯合銀杏內酯B對MDCK囊泡形成抑制具有協同作用。
[0026]姜黃素聯合銀杏內酯對MDCK囊泡抑制作用，通過金氏公式判斷，即Q=EA+B/(EA+EB—EAXEB)，其中 EA+B為姜黃素聯合銀杏內酯B的抑制率，EA、EB分別為姜黃素、銀杏內酯B的抑制率，Q為0.85~1.15之間為單純相加( + )，Q為1.15~20之間為增強(++)，Q大于20為顯著增強(+++)，Q為0.85~0.55之間為拮抗(一)，Q小于0.55為明顯拮抗( )。
[0027]實施例2:通過MTT法確定姜黃素、銀杏內酯B的細胞毒性
將對數期的MDCK細胞懸液接種于96孔培養板中，每孔含有4X IO3個細胞，每孔給予200 μ L MDCK細胞培養液(由DMEM培養基(購自美國sigma公司)和F12培養基(購自美國Invitrogen公司)等體積混合而成)，置于37°C的5% CO2培養箱中培養24小時。然后在細胞培養板中加入終濃度分別為1 X10-4、1X 10_5M、1 X 10_6M、1 X1O-7M的姜黃素和銀杏內酯B各20 μ L，繼續培養24小時。除去上清，加入200 μ L MDCK細胞培養液和20 μ L濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續培養3小時。除去上清，每孔加入150 μ L 二甲基亞砜，置搖床上100轉/分振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長為492nm)，設置調零孔(培養基、MTT和二甲基亞砜)和對照孔(細胞、相同濃度的姜黃素的溶解介質、培養基、MTT和二甲基亞砜)，每組設定5個復孔。按照下述公式計算抑制率:抑制率=[(對照孔-調零孔)_(給藥孔-調零孔)]/(對照孔-調零孔)χ100%。實驗設三次重復，加入姜黃素、銀杏內酯B后細胞的MTT結果如圖5、圖6所示。其中，control表示用不含姜黃素、銀杏內酯B的培養液培養。結果表明，1X10_5 M以下濃度的姜黃素、1X 10_4 M以下濃度的銀杏內酯B對MDCK細胞均無細胞毒性作用。
[0028]實施例3:通過PKDl基因敲除小鼠評價姜黃素聯合銀杏內酯B對小鼠腎囊泡生長的抑制作用
本課題組將應用多囊腎病PKDl腎臟組織特異性敲除小鼠模型進行研究，普通PKDl基因敲除小鼠具有腎臟、胰腺、血管發育異常，在胚胎期/新生期死亡，而PKDl腎臟組織特異性敲除小鼠可保持其他組織器官正常，只在腎臟發生囊泡，囊泡迅速生長(圖7)，在兩周內導致腎功能衰竭，死于20天齡。該模型小鼠將用于研究姜黃素聯合銀杏內酯B是否抑制多囊腎病小鼠腎囊泡的形成和生長，同窩雜合子小鼠表現為野生型表型，將被用作正常對照。野生型小鼠、多囊腎病小鼠分別分為生理鹽水組、姜黃素組(分別為80、160、320mg/kg)、銀杏內酯B組(分別為20、40、80mg/kg)、姜黃素聯合銀杏內酯B組，每組至少3只小鼠以上保證結果統計學分析的可靠性。腹部皮下注射給藥，每天2次。每次給藥前觀察小鼠的一般狀態。7天齡時每組處死小鼠，取腎組織，檢查腎臟組織學特征。通過測定腎內囊泡面積大小觀察腎囊泡的生長率，通過記錄小鼠壽命觀察生存期，從而評價姜黃素聯合銀杏內酯B治療多囊腎病PKDl基因敲除小鼠的藥理學作用。獲得最佳配伍方案:160mg/kg姜黃素聯合80mg/kg銀杏內酯B，進一步研究其對多囊腎病小鼠生存期的影響，當小鼠表現為衰竭垂死狀態時處死，統計生存期(如圖8所示，*P〈0.05，***P〈0.001)，計算生存期延長率=(給藥組生存期-空白組生存期)/空白組生存期X 100%。
[0029]囊泡發展程度的定量分析:囊泡的發展程度以腎臟指數，腎囊泡大小作為評價指標。腎囊泡大小測定:在光學顯微鏡下觀察系列腎臟組織切片(0.1 mm間隔)，應用Image-Pro Plus 6.0測量囊泡總面積、腎臟面積,計算囊泡大小抑制率=(生理鹽水組囊泡面積一給藥囊泡面積)/生理鹽水組囊泡面積X 100%。結果如圖1所示。
姜黃素聯合銀杏內酯對小鼠腎囊泡抑制作用，通過金氏公式判斷，即Q=EA+B/(EA+EB —EAXEB)，其中EA+B為姜黃素聯合銀杏內酯B的抑制率，EA、EB分別為姜黃素、銀杏內酯B的抑制率，Q為0.85~1.15之間為單純相加( + )，Q為1.15~20之間為增強(++)，Q大于20為顯著增強(+++)，Q為0.85-0.55之間為拮抗(一)，Q小于0.55為明顯拮抗(一一)。
[0030]實施例4:姜黃素、銀杏內酯B的作用靶點和機制
利用Western印跡技術，檢測姜黃素對囊泡上皮細胞信號轉導通路的影響。具體實驗過程如下:
將MDCK細胞培養至70%的細胞密度，換無血清培養液培養24小時，然后加入含IOMforskolin的培養液，同時分別給予姜黃素、銀杏內酯B,以不含有forskolin的培養液培養的MDCK細胞作為control組，上述各組細胞均刺激60min。
[0031]提取上述各組細胞的總蛋白，用BCA法作蛋白定量。SDS-PAGE電泳、轉膜，加相應一抗和二抗。化學發光，顯影、定影。結果如圖9、圖10所示:
隨著forskolin刺激MDCK細胞不同時間，通過Western檢測ρ-ERK的水平，發現p_ERK水平在60min左右時達到高峰。因此選擇forskolin作用MDCK細胞60min時的蛋白進行一系列 Western 檢測，結果發現:在 forskolin 作用下，H-Ras、B_raf、p-MEK、p_ERK、Egr-1、c-fos、p-CREB表達增加，Raf-U NAB2表達減少；姜黃素可以下調細胞內H_Ras、B-raf,p-MEK, p-ERK, Egr-1, c-fos的表達，同時上調Raf_l、NAB2的表達；而銀杏內酯B可以下調細胞內H-Ras、B-raf、p-MEK、p-ERK、p-CREB的表達，上調Raf-1的表達；提示兩者作用機制存在一定差異，兩者聯合可能具有協同作用。
【權利要求】
1.姜黃素與銀杏內酯B配伍的組合物，其特征在于重量份配比為姜黃素I~8份，銀杏內酯B 1份。
2.根據權利要求1所述的姜黃素與銀杏內酯B配伍的組合物，其特征是它的用途是治療多囊腎病。
3.根據權利要求1所述姜黃素與銀杏內酯B配伍的組合物，其特征是組合物均勻混合制成片劑、膠囊、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、注射劑、栓劑、貼劑、滴劑、噴霧劑、霜劑、混懸劑、酊劑、乳劑、滴丸或粉劑進行使用。
【文檔編號】A61P13/12GK103599098SQ201310568288
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】高晉生, 李囿松, 楊寶學, 王晞星, 鄭建忠, 李廷荃, 劉光珍, 郝旭亮, 劉麗坤, 李宜放 申請人:山西省中醫藥研究院