本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

姜黃素(Curcumin)是從姜科姜黃屬(Curcuma longa L)植物的根部中提取的一種天然有效成分，屬于多酚類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗微生物等多種作用，且毒副作用小，作為藥物具有廣闊的應(yīng)用前景，目前關(guān)于姜黃素最主要研究還是在于抗癌制劑的開(kāi)發(fā)。

姜黃素結(jié)構(gòu)式為C₂₁H₂₀O₆，分子量：368.37，結(jié)構(gòu)式如下：

姜黃素難溶于水(2.99×10^-8mol/L)，普通口服給藥不吸收，且存在嚴(yán)重的肝臟首過(guò)效應(yīng)，即經(jīng)胃腸道給藥后，在尚未吸收進(jìn)入血循環(huán)之前即由肝臟代謝，而使進(jìn)入血循環(huán)的藥量極度減少；并且姜黃素在體內(nèi)的新陳代謝及清除速率較快，所以一般給藥下，姜黃素的生物利用率(<1％)很低，穩(wěn)定性差(在堿性條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生降解)，并且姜黃素作為一種抗腫瘤藥物，最關(guān)鍵的就是藥物在腫瘤組織達(dá)到最大富集。因此需要制備合適的藥物遞送系統(tǒng)以解決上述問(wèn)題，在有效提高姜黃素水溶性的同時(shí)，也要防止藥物進(jìn)入生物體后被水解、氧化而失活，同時(shí)能夠保證姜黃素在達(dá)到腫瘤部位之前不被清除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷與不足，提供一種包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束及其制備方法和應(yīng)用，該混合膠束能有效地增加姜黃素的溶解度，提高姜黃素的生物利用率，同時(shí)包載姜黃素的聚合物膠束能夠在腫瘤組織達(dá)到最大富集。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明方法采用的技術(shù)方案是：

采用薄膜分散法，以普朗尼克為載體，將姜黃素包載在普朗尼克的疏水內(nèi)核PPO中，制得包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束。

進(jìn)一步地，包括以下具體步驟：

(1)將普朗尼克和姜黃素按質(zhì)量比為(10～100)：1溶于有機(jī)溶劑中，形成均勻的混合溶液；

(2)將混合溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，制得以普朗尼克為載體的姜黃素薄膜；

(3)將以普朗尼克為載體的姜黃素薄膜進(jìn)行溶脹水化，制得包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束。

進(jìn)一步地，步驟(1)中的普朗尼克是普朗尼克F127與普朗尼克P123按任意比例混合得到的；普朗尼克F127是由兩端PEO與中間PPO形成的三嵌段共聚物，分子量為12600；普朗尼克P123是由兩端PEO與中間PPO形成的三嵌段共聚物，分子量為332.48。

進(jìn)一步地，包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束通過(guò)后處理制得姜黃素聚合物膠束凍干劑，后處理步驟具體為：向包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束中加入凍干保護(hù)劑，過(guò)濾除菌；冷凍干燥除去水分，制得姜黃素聚合物膠束凍干劑。

進(jìn)一步地，凍干保護(hù)劑為甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖和聚乙二醇中的一種或者任意兩種以上的混合物，凍干保護(hù)劑的添加量是包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束質(zhì)量的1～5％；過(guò)濾除菌采用0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行。

進(jìn)一步地，步驟(1)中的有機(jī)溶劑為甲醇、四氫呋喃、乙醚、二甲基亞砜或乙腈。

進(jìn)一步地，步驟(1)中普朗尼克和有機(jī)溶劑的比為300mg：4mL。

進(jìn)一步地，步驟(2)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以及步驟(3)中溶脹水化的溫度均為37～60℃；步驟(3)溶脹水化中加入的去離子水和步驟(1)中普朗尼克的比為(2～12)mL：300mg。

一種利用如上所述包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束制備方法制得的包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束。

如上所述的包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明采用的普朗尼克(Pluronic)是一種多功能藥用輔料，由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，具有相似疏水嵌段的聚合物可形成混合膠束。Pluronic系列的分子量均小于15000Da，其單體可由腎臟排泄，具有良好的生物相容性。其PPO鏈可以形成疏水內(nèi)核用于包載難溶性抗腫瘤藥物，增加溶解度、提高體內(nèi)外穩(wěn)定性；PEO鏈可形成親水外殼，具有空間穩(wěn)定作用和滲透滯留效應(yīng)，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，延長(zhǎng)體循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)被動(dòng)靶向能力。本發(fā)明的聚合物膠束能有效地增加姜黃素的溶解度，可以避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，從而提高其在血液中的循環(huán)時(shí)間，有效提高姜黃素的生物利用率；同時(shí)普朗尼克載體可以增強(qiáng)被動(dòng)靶向能力作用，提高姜黃素的抗腫瘤效果。

進(jìn)一步地，本發(fā)明中普朗尼克由普朗尼克P123和普朗尼克F127組成，疏水PPO嵌段數(shù)目非常相似，可以形成同一疏水核心，利于形成混合膠束。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明包載姜黃素的聚合物膠束在小鼠體內(nèi)具有一定的長(zhǎng)循環(huán)性質(zhì)，證明姜黃素的生物利用率得到有效提高；并且能夠在腫瘤組織達(dá)到最大富集。

【附圖說(shuō)明】

圖1為本發(fā)明姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束的粒徑分布圖。

圖2為姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束的透射電鏡照片。

圖3為膠束材料生物相容性考察；

圖4為姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束對(duì)人乳腺癌MD-MBA-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制趨勢(shì)圖。

圖5為姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束在MD-MBA-231細(xì)胞中的藥物攝取圖。

圖6為游離姜黃素與姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束在小鼠中的血液中藥物代謝圖。

圖7為Pluronic F127/P123混合膠束在乳腺癌移植瘤小鼠各組織藥物分布圖。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明采用薄膜分散法，以普朗尼克為載體，將姜黃素包載在普朗尼克的疏水內(nèi)核PPO中，制成包載姜黃素的聚合物膠束，也可以稱為載有姜黃素的普朗尼克F127/P123混合膠束。本發(fā)明包括以下步驟：

(1)將普朗尼克與姜黃素按質(zhì)量比為(10～100)：1溶于有機(jī)溶劑中，使普朗尼克與姜黃素形成均勻的混合溶液Ⅰ，普朗尼克和有機(jī)溶劑的比為300mg：4mL；其中，普朗尼克是普朗尼克F127與普朗尼克P123按質(zhì)量比為100:1～1:100(即任意質(zhì)量比)混合得到的；有機(jī)溶劑為甲醇、四氫呋喃、乙醚、二甲基亞砜或乙腈。

(2)將混合溶液Ⅰ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，制得以普朗尼克為載體的姜黃素薄膜；其中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為37～60℃。

(3)將薄膜置于37～60℃環(huán)境下溶脹后水化，制得包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束；水化中加入的去離子水和步驟(1)中普朗尼克的比為(2～12)mL：300mg；

(4)向包載難溶性抗腫瘤藥物姜黃素聚合物膠束中加入其質(zhì)量1％～5％的凍干保護(hù)劑，經(jīng)過(guò)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌；凍干保護(hù)劑為甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖和聚乙二醇中的一種或者任意兩種以上的混合物；

(5)置于-80℃預(yù)凍過(guò)夜，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干36h，除去水分，制得干燥的姜黃素聚合物膠束凍干劑。

本發(fā)明中采用的普朗尼克F127，即泊洛沙姆407(Poloxamer 407)，由兩端PEO與中間PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO約為100個(gè)重復(fù)單位，PPO約為65個(gè)重復(fù)單位，分子量為12600。

本發(fā)明中采用的普朗尼克P123，即泊洛沙姆403(Poloxamer 403)，由兩端PEO與中間PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO約為20個(gè)重復(fù)單位，PPO約為69個(gè)重復(fù)單位，分子量為332.48。

本發(fā)明包載姜黃素的聚合物膠束是姜黃素的新劑型，具體是姜黃素普朗尼克F127/P123混合膠束，該混合膠束能有效地增加姜黃素的溶解度，并且可以避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，從而提高其在血液中的循環(huán)時(shí)間，同時(shí)普朗尼克作為載體可以增強(qiáng)被動(dòng)靶向能力作用，提高姜黃素的抗腫瘤效果。其中普朗尼克P123具有較強(qiáng)的增溶能力，普朗尼克F127具有良好的生物相容性、長(zhǎng)循環(huán)性質(zhì)。由于P123(PPO，69)與F127(PPO，65)的疏水PPO嵌段數(shù)目非常相似，可以形成同一疏水核心，利于形成混合膠束。

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明

實(shí)施例1

稱取60mg P123、240mgF127、10mg姜黃素，使得普朗尼克與姜黃素按質(zhì)量比為30：1；加入4mL四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于37℃溶脹15min，加入8mL 37℃去離子水水化，攪拌30min,用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例2

稱取80mgP123、220mg F127、8mg姜黃素，加入4ml甲醇，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于37℃溶脹15min，加入6mL 37℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例3

稱取100mgP123、200mg F127、6mg姜黃素，加入4ml丙酮，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于37℃溶脹15min，加入4mL 37℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例4

稱取120mgP123、180mg F127、12mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于45℃溶脹15min，加入10mL 45℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例5

稱取150mgP123、150mg F127、15mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于50℃溶脹15min，加入12mL 50℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例6

稱取180mgP123、120mg F127、15mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于60℃溶脹15min，加入5mL 60℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例7

稱取200mgP123、100mg F127、15mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于50℃溶脹15min，加入5mL 50℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例8

稱取210mgP123、90mg F127、15mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于50℃溶脹15min，加入5mL 50℃去離子水水化，攪拌30min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得到姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束制劑。

實(shí)施例9

稱取150mgP123、150mg F127、3mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于50℃溶脹15min，加入10mL 50℃去離子水水化，攪拌30min，加入1％蔗糖，過(guò)濾除菌，裝于西林瓶中，置于冰箱-80℃預(yù)凍過(guò)夜，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干36h，得到混合膠束凍干劑，凍干劑中加入適量去離子水可在30s內(nèi)完全復(fù)溶。

實(shí)施例10

稱取210mgP123、90mg F127、30mg姜黃素，加入4ml四氫呋喃，水浴超聲10min使載體材料與藥物充分溶解。將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃旋蒸1h，真空干燥過(guò)夜，得到橙黃色薄膜。將薄膜置于60℃溶脹15min，加入2mL 60℃去離子水水化，攪拌30min，加入5％葡萄糖，過(guò)濾除菌，裝于西林瓶中，置于冰箱-80℃預(yù)凍過(guò)夜，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干36h，得到混合膠束凍干劑，凍干制劑加入適量去離子水可在30s內(nèi)完全復(fù)溶。

通過(guò)對(duì)比空白膠束、游離姜黃素和本發(fā)明制得的包載姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束的外觀，游離姜黃素難溶于水，在水中呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，而本發(fā)明混合膠束在水中具有很好的溶解性。

通過(guò)改變旋蒸溫度分別為20℃和70℃，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有在37～60℃內(nèi)所制得的膠束穩(wěn)定性好。

采用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定本發(fā)明制得的混合膠束的粒徑，如圖1所示其粒徑大約為23nm左右。

采用透射電鏡觀察本發(fā)明制得的混合膠束的形態(tài)；如圖2所示，制備的姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束分散均勻，且無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。

實(shí)施例11

采用MTT考察本發(fā)明制得的包載姜黃素的Pluronic F127/P123混合膠束載體對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。

待MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到90％時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化，2×10⁵密度接種在96培養(yǎng)板中，于37℃下，5％CO₂條件下培養(yǎng)12小時(shí)；棄掉培養(yǎng)液，加入一定濃度的姜黃素、包載姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束，繼續(xù)孵育24小時(shí)。待孵育結(jié)束后，加入20μl MTT((5mg/mL)，37℃下繼續(xù)孵育4小時(shí)，孵育完畢后，以酶聯(lián)免疫儀在570nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示：與游離姜黃素相比，包載姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有良好的抑制作用(參見(jiàn)圖4)，且空白膠束顯示具有良好的生物相容性，參見(jiàn)圖3。

實(shí)施例12

采用流式細(xì)胞儀考察包載姜黃素Pluronic F127/P12對(duì)細(xì)胞攝取藥物影響實(shí)驗(yàn)，如圖5所示，結(jié)果表明，包載姜黃素Pluronic F127/P123顯著提高姜黃素的蓄積。

實(shí)施例13

取體重為20g左右的BABL/c小鼠12只，隨機(jī)分為2組，每組6只，分別給予姜黃素注射液以及相同濃度的包載姜黃素Pluronic F127/P123混合膠束，以50mg/kg的劑量尾靜脈注射給藥，分別于給藥后0.5、1、3、6、12、24、48取血，處理血漿后測(cè)定姜黃素的血藥濃度，結(jié)果如圖6所示，混合膠束具有明顯的長(zhǎng)循環(huán)性質(zhì)，且相比于游離的姜黃素，混合膠束明顯提高了姜黃素的藥物濃度。

實(shí)施例14

利用小動(dòng)物活體成像觀察混合膠束在BABL/c小鼠體內(nèi)各組織的富集情況，同時(shí)利用近紅外染料DIR來(lái)作為指示。

取體重為20g左右的BABL/c小鼠6只，分別于小鼠左腋外側(cè)中部皮下接種乳腺癌腫瘤細(xì)胞，待腫瘤直徑達(dá)到4-6mm時(shí)，尾靜脈注射帶有熒光標(biāo)記的Pluronic F127/P123混合膠束，于注射后12h，取小鼠的各組織，利用小動(dòng)物活體成像觀察各組織熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖7顯示，在尾靜脈給藥12h之后，相比于其他各組織，小鼠腫瘤熒光強(qiáng)度最大，藥物在腫瘤中具有較大的富集，說(shuō)明該混合膠束可以通過(guò)滲透滯留效應(yīng)，增強(qiáng)藥物在腫瘤組織中的富集。