齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用。通過實驗以過量給予石膽酸造成小鼠肝損傷為模型，協同給予齊墩果酸5~20mg/kg后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現為小鼠存活率顯著升高，血清中ALT，AST和ALP的活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量，以及肝臟中的總膽汁酸含量也有顯著的降低。肝臟基因與蛋白表達分析證實齊墩果酸能夠顯著上調Mrp2,Mrp3,Mrp4表達，并且激活Nrf2，但對其它的膽汁酸轉運體和代謝酶無顯著影響。結果表明齊墩果酸能夠預防治療石膽酸所誘導的膽汁淤積性肝損傷，機制涉及Nrf2-Mrps通路。
【專利說明】齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體涉及齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]膽汁淤積是一種體內循環或者肝臟滯留過多的毒性膽汁酸而產生肝損傷的臨床癥狀，最終可能發展成為致命性的肝疾病，例如原發性膽汁性肝硬化和硬化性膽管炎等。膽汁淤積的形成可能由于肝細胞膽汁分泌紊亂或者膽管阻塞造成。石膽酸(LCA)是一種毒性較強的疏水性次級膽汁酸，是由腸道細菌將鵝去氧膽酸(CDCA)的7a位去羥基化后生成。 在慢性膽汁淤積性疾病患者的血中可檢測到LCA水平的顯著增加，并且研究發現在患者體循環中累積的LCA被認為能導致肝損害。此外，在動物水平上，給予小鼠過量的LCA能造成膽管部分梗阻以及膽管炎。因此，LCA作為一種膽汁淤積的造模藥物廣泛用于膽汁淤積治療藥物的研發中。
[0003]齊墩果酸作為一個五環三萜類的化合物廣泛存在于一些藥用植物中，在我國齊墩果酸已經成為OTC藥物被用于治療急慢性肝炎。國內外對齊墩果酸藥理作用的報道主要有抗炎，糖尿病治療以及抗腫瘤等，此外齊墩果酸被報道具有顯著的肝保護作用，能夠用于多種肝毒性藥物如對乙酰氨基酚，四氯化碳等所致肝損傷的保護與治療。最近有報道齊墩果酸能夠導致小鼠的膽汁淤積，所用劑量高達90 mg/kg或以上，機制為影響調控膽汁酸穩態的基因表達，但并無特定指出齊墩果酸具體是通過影響哪些基因的表達來導致膽汁淤積， 同時導致膽汁淤積的劑量高于齊墩果酸以往報道的肝保護劑量4倍左右。在低劑量下，齊墩果酸能否預防治療膽汁淤積尚未有報道，本發明旨在通過動物實驗揭示齊墩果酸能否在低劑量下預防和治療LCA所誘導的小鼠膽汁淤積癥，并探討其內在機制。

【發明內容】

[0004]本發明的發明目的在于提供齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用。
[0005]本發明的上述目的通過如下技術方案予以實現:
齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用。
[0006]本發明所述藥物還包括賦形劑和助劑等醫藥領域常規的藥物載體，如填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑，矯味劑、防腐劑等。
[0007]所述填充劑可選自淀粉、蔗糖、甘露醇或乳糖。
[0008]所述黏合劑可選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮。
[0009]所述濕潤劑可選自甘油。
[0010]所述崩解劑可選自瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉。
[0011]所述吸收促進劑為本領域公知的吸收促進劑，可選自季胺類化合物、脂肪酸及其混合物等。優選的，季胺類化合物為烷基二甲基芐基氯化銨或烷基二甲基乙基芐基氯化胺，脂肪酸為葵酸、油酸或其單甘油脂。
[0012]所述表面活性劑可選自滑石粉、硬脂酸鎂或鈣和聚乙二醇。
[0013]所述矯味劑可選自糖精鈉、蔗糖或甜蜜素。
[0014]所述防腐劑可選自苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
[0015]本發明所述藥物可以為醫藥領域常規劑型，包括膠囊劑、顆粒劑、片劑、散劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等。
[0016]根據實際需要，所述藥物的劑型還可以是緩釋劑或控釋劑。
[0017]本發明將齊墩果酸用于制備預防和治療膽汁淤積癥藥物，預防和治療膽汁淤積癥是指通過激動Nrf2,上調膽汁酸外排轉運體Mrp2, Mrp3, Mrp4的表達,從而增加膽汁酸的外排來實現的，而不是通過降低膽汁酸攝入轉運體0atplb2和Ntcp基因表達、增加膽汁酸外排轉運體Bsep基因表達、增加膽固醇外排轉運體Mdr3基因表達、增加膽汁酸代謝相關酶 Cyp3all, Cyp2bl0, Cyp7al, Sult2al和Ugtlal基因表達、以及增加膽汁酸穩態相關核受體Pxr, Car和Fxr基因表達來實現的。
[0018]本發明具有如下有益效果:
本發明實驗以過量給予石膽酸造成小鼠肝損傷為模型，協同給予齊墩果酸5，10，20 mg/kg后，能有效減輕肝損傷和降低膽汁酸水平，具體表現為小鼠存活率顯著升高，血清中 ALTjAST和ALP的活性顯著降低，肝組織壞死程度顯著減輕，同時血清中的總膽汁酸與總膽紅素含量，以及肝臟中的總膽汁酸含量也有顯著的降低，結果表明齊墩果酸能夠預防治療石膽酸所誘導的膽汁淤積性肝損傷。肝臟基因與蛋白表達分析證實齊墩果酸能夠顯著上調 Mrp2, Mrp3, Mrp4表達，并且激活Nrf2，但對其它的膽汁酸轉運體和代謝酶無顯著影響。 結果表明齊墩果酸能夠預防和治療石膽酸所誘導的膽汁淤積性肝損傷， 機制涉及Nrf2-Mrp 通路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為齊墩果酸逆轉石膽酸所致小鼠存活率的下降結果圖；
圖2為齊墩果酸減輕石膽酸所致肝壞死程度結果圖；
圖3為齊墩果酸劑量依賴性逆轉石膽酸所致小鼠血清生化指標的升高結果圖；
圖4為齊墩果酸劑量依賴性逆轉石膽酸所致小鼠血中總膽汁酸和總膽紅素，以及肝中總膽汁酸水平的升高結果圖；
圖5為齊墩果酸對小鼠膽汁酸膽汁酸轉運體基因表達的影響結果圖；
圖6為齊墩果酸對小鼠膽汁酸代謝酶基因表達的影響結果圖；
圖7為齊墩果酸對Nrf2以及膽汁酸穩態調控相關核受體的影響結果圖；
圖8為齊墩果酸對小鼠Mrp轉運體以及核內Nrf2蛋白表達的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0021]實施例1 (一)材料與方法1、主要儀器:
5417-R低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；多功能酶標儀(美國Molecular devices 公司)；Mini_protein3 電泳系統(美國 Bio-Rad 公司)；Mini Trans-Blot 轉移系統 (美國 Bio-Rad 公司);ImageQuant LAS 4000 曝光成像儀(美國 General Electric 公司);梯度 PCR 儀(德國 Eppendorf 公司);7500 Real Time PCR System (美國 Applied Biosystems 公司)。
[0022]2、藥品和試劑
齊墩果酸，石膽酸(純度> 98%，上海阿拉丁試劑有限公司)，玉米油(藥用級，上海阿拉丁試劑有限公司)；Pregnenolone_16 a-Carbonitrile (PCN)(純度> 98%, Sigma 公司)； ALT、AST、ALP、總膽汁酸、總膽紅素檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠Nrf2干擾序列(廣州銳博公司)；Trizol試劑、RT-PCR試劑盒，qRT-PCR試劑盒(Takara公司)；Nrf2、 Mrp2> Mrp3 一抗(Santa cruz公司)；Mrp4—抗(Abeam公司)；RIPA裂解液、核蛋白提取試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);ECL發光液(北京英格恩生物科技公司)；其它試劑均為分析純級別。
[0023](二)實驗動物及給藥方案
C57BL/6小鼠，雄性，周齡8-9周，由中山大學(大學城)實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(粵)2011-0029，正常小鼠用維持飼料喂養。齊墩果酸(5，10，20 mg/kg)溶于含2%吐溫80的生理鹽水；石膽酸(125 mg/kg)與PCN (50 mg/kg)溶于玉米油。小鼠隨機分成7組，每組6-12只，組別為空白對照組、高劑量齊墩果酸組、石膽酸造模組、石膽酸+低劑量齊墩果酸組、石膽酸+中劑量齊墩果酸組、石膽酸+高劑量齊墩果酸組以及石膽酸+PCN 組。齊墩果酸、石膽酸和PCN的給藥方式均為腹腔注射，其中齊墩果酸與PCN連續給藥7天， 每天一次，而石膽酸在第四天開始協同給藥，共給藥4天，每天兩次。最后一次給藥后24h 處理小鼠，計算每組小鼠存活率，解剖后對在體的肝臟及膽囊的形態進行拍照，然后收集血清以及肝臟，每組取三只小鼠部分肝臟置于10%甲醛中固定，其它樣本在_80°C冷凍保存備用。
[0024](三)肝組織與血清化學檢測`肝組織切片與H&E染色由中山大學實驗動物中心病理切片室完成，血清中的ALT，AST, ALP,總膽汁酸，總膽紅素以及肝臟中的總膽汁酸檢測方法按照試劑盒的說明書來完成。
[0025](四)qRT-PCR
按照Trizol試劑的說明書得到小鼠肝細胞總RNA，按照RT試劑盒說明書得到cDNA， 按照qRT-PCR試劑盒說明書檢測特定基因的mRNA表達量。實驗涉及的引物序列如表1所述。
[0026]表1.引物序列
【權利要求】
1.齊墩果酸在制備預防和治療膽汁淤積癥藥物中的應用，其特征在于，所述藥物中齊墩果酸的含量為5~20 mg/kg。
2.根據權利要求1所述應用，其特征在于，所述藥物還包括藥物載體。
3.根據權利要求2所述應用，其特征在于，所述藥物載體選自填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑，矯味劑或防腐劑中的一種或多種。
4.根據權利要求3所述應用，其特征在于，所述填充劑為淀粉、蔗糖、甘露醇或乳糖；所述黏合劑為纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮。
5.根據權利要求3所述應用，其特征在于，所述濕潤劑為甘油；崩解劑為瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉。
6.根據權利要求3所述應用，其特征在于，所述吸收促進劑為季胺化合物或脂肪酸。
7.根據權利要求3所述應用，其特征在于，所述表面活性劑為滑石粉、硬脂酸鎂或鈣和聚乙二醇；所述矯味劑為糖精鈉、蔗糖或甜蜜素。
8.根據權利要求3所述應用，其特征在于，所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
9.根據權利要求1-8中任一項所述應用，其特征在于，所述藥物的劑型包括膠囊劑、顆粒劑、片劑、散劑、溶液劑、乳劑、混懸劑。
10.根據權利要求1-8中`任一項所述應用，其特征在于，所述藥物的劑型包括緩釋劑或控釋劑。
【文檔編號】A61P1/16GK103599108SQ201310585202
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】黃民, 畢惠嫦, 陳攀, 范曉梅, 姜伊鳴 申請人:中山大學