Mica結合劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于使用特異性結合MICA的抗體、抗體片段及其衍生物治療由MICA表達細胞介導的障礙的方法。本發明還涉及抗體，產生此類抗體的細胞；制造此類抗體的方法；這些抗體的片段、變體以及衍生物；包括其的藥物組合物。
【專利說明】MICA結合劑
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年2月7日提交的美國臨時申請號61/595,902和于2012年 4月18日提交的美國臨時申請號61/625, 841的權益；將其全部通過引用以其全文結合在 此，包括任何附圖。
[0003] 對序列表的引用
[0004] 本申請將與電子格式的序列表一起提交。將該序列表提供為標題為"PCT Seq list MICA_ST25"、創建于2013年2月7日、大小為77KB的文件。電子格式的序列表中的 信息通過引用以其全文結合在此。 發明領域
[0005] 本發明提供了能夠與MICA多肽結合的抗原結合蛋白。這些抗原結合蛋白在由 MICA表達細胞--特別是腫瘤細胞--表征的障礙的治療方面具有增加的活性。
[0006] 背景
[0007] 免疫受體NKG2D正常表達于人類T細胞（例如⑶8+T細胞、Y S T細胞）和NK細 胞上。在預激活的⑶8+細胞上，NKG2D經由DAPlO締合作為⑶28和TCR信號傳導的協同共 刺激物起作用，而在NK細胞中，它作為直接激活劑起作用。連接配體后，NKG2D因此經由成 對的DAPlO銜接蛋白傳達直接激活或共刺激信號，由此提升癌癥和感染性疾病免疫力。
[0008] 已經鑒定并表征了人類NKG2D (hNKG2D)的不同配體，包括主要組織相容性復合體 I類相關鏈A和B多肽（MICA和MICB)、UL16結合蛋白（ULBP)家族以及視黃酸早期轉錄 物I(RAETl)家族。MICA經常與由微生物感染誘導的上皮腫瘤相關，并且異常表達于某些 自身免疫性疾病損害中。MICA的結構類似于MHC I類的蛋白質折疊，具有一個a Ia 2平 臺結構域和一個近膜端（membrane-proximal) Ig樣a 3結構域（Li (李）等人2001Nat. Immunol.(自然免疫學）2:443)。MICA及其近親MICB(還作為NKG2D的配體）兩者都 是多態的并且已經顯示這種多態性影響對NKG2D的親和力（Steinle (施泰因勒）等人 2001Immunogenetics (免疫遺傳學）53:279)。
[0009] 在缺乏MHC I類鏈（MIC)基因的小鼠中，結構上與ULBP相關的蛋白質家族視黃酸 早期（RAE-I)分子作為NKG2D的配體起作用。已經顯示RAE-I表達是由致癌物誘導的并且 刺激T細胞的抗腫瘤活性。然而，鼠類NKG2D識別人類MICA多肽（Wiemann (威曼尼）（2005) J. Immunol.(免疫學雜志）175:820-829)。
[0010] MICA在癌癥生物學中的作用由于以下事實復雜化，MICA作為可溶態從腫瘤 細胞的細胞表面（例如， #〇19等位基因）并且在外來體的表面0)8等位基因）上被釋 放（Ashiru(阿斯苑）等人（2010)Cancer Res?(癌癥研究）70(2) :481-489))。可溶性 MICA(sMICA)可以例如在罹患胃腸道惡性腫瘤的患者的血清中以高水平檢測到（Salih(薩 利赫）等人，2002J. Immunol.(免疫學雜志）169:4098)。已經報道 MMPs ADAMlO 和 ADAM17 連同二硫化物異構酶Erp5在MICA的裂解和脫落方面具有作用（Waldhauer (瓦爾德豪 爾）（2008) Cancer Research (癌癥研究）68 (15) 6368-76 ;Kaiser (凱澤）等人（2007) Nature (自然）；已經 Salih (薩利赫）（2002) J. Immunol (免疫學雜志）169:4098-4102)。已 經報道膜結合MICA下調NKG2D在NK和/或T細胞上的表達（Von Lilienfeld-Toal (馮利 林菲爾德-托爾）等人（2010)Cancer Immunol. Immunother.(癌癥免疫學，免疫療法））。 值得注意地，Wiemann(威曼尼）（2005)(同上）檢查了 MICA Tg小鼠并且總結到表面NKG2D 在非轉基因脾細胞上的下調在與來自MICA轉基因小鼠的脾細胞體外共培養后是最明顯 的，并且在用來自H2Kb-MICA小鼠的血清處理后僅是少量的，然而分別用對照細胞和來自 nontgLM的血清溫育沒有影響并且總結到整體數據說明在H2-K-MICA NK細胞上的減少的 表面NKG2D導致NKG2D功能異常并且總結到NKG2D下調主要由向細胞結合MICA的持續體 內暴露導致。
[0011] 報道還透露NK細胞上的NKG2D被sMICA下調（Groh (格羅）等人（2002) Nature (自 然）；Arreygue_Garcia(阿萊伊格-加西亞）（2008)BMC;Jinushi (基納施）等人（2005) J. Hepatol.(肝病學雜志）），導致更小反應性的NK細胞。因為已經在其他蛋白質家族（如 Ig樣和TNF超家族）中觀察到類似的系統，所以可以出現這一基本原理，其他蛋白質家族已 經顯示作為可溶態而被釋放并且這些分子的釋放通過減少配體密度影響細胞間相互作用 并且調節攜帶各自的受體的NK細胞（Salih (薩利赫）2002)。因此，用于產生抗MICA抗體 的嘗試已經聚焦于抑制MICA脫落的抗體的研發。
[0012] 還已經報道NKG2D配體MICA和MICB在健康細胞上的表達可以打破免疫激活與耐 受之間的平衡，并且觸發自身免疫。遺傳連鎖研究已經顯示一些MICA等位基因與1型糖尿 病呈正相關，并且疾病在其胰島細胞上表達Rael的前糖尿病NOD小鼠中的發展可以通過用 NKG2D阻斷mAb進行治療而被完全阻止，這些NKG2D阻斷mAb減少自身反應性⑶8+T細胞的 膨脹和功能。MICA和MICB分子在RA滑膜細胞中還被顯著上調并且以一種NKG2D依賴性方 式激活T細胞。此外，已經報道類風濕性關節炎患者在血清和發炎的關節中具有高水平的 IL-15和TNF-a，這誘導NKG2D在T細胞的⑶4+⑶28-亞群上的表達。在乳糜瀉中，已經報 道上皮內NKG2D+⑶8+cd T淋巴細胞大量浸潤在腸中，并且MIC蛋白在罹患活動性疾病的患 者中的上皮細胞的表面上變得強烈表達。在炎性腸障礙中，可以在腸道上皮細胞上發現增 加水平的MIC表達，并且發現表達NKG2D的腸道上皮⑶4+T細胞的數目與腸道炎癥相關聯。
[0013] 迄今，基于NKG2D系統的用于治療炎癥的途徑已經聚焦于NKG2D自身而非其 配體的阻斷（Ogasawara (小笠原）等人（2004) Immunity (免疫力）20 (6) : 757-767 ; Andersson (安德森）等人（2011) Arthritis. Rheum?(關節炎與風濕病）63(9) :2617-2629 ; Steigerwald (斯泰格沃德）等人（2009)MAbs 1 (2) : 115-127)。這一焦點在 NKG2D 而非其 配體上的一種可能性歸因于靶向NKG2D配體系統的感知到的難度，該配體系統包括多種配 體并且在一些情況下包括大量的等位基因。
[0014] 對于MICA和MICB而言，存在超過50個MICA等位基因以及至少13個識別的MICB 等位基因。跨越a I a 2結構域（該結構域被包含在NKG2D界面中）中的MIC多肽僅存在 43%氨基酸同一性，并且80%的氨基酸取代是非保守的（Steinle(施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遺傳學）53:279-287 ;Steinle (施泰因勒）等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci? U. S. A?(美國科學院院刊）95:12510-12515)，說明獲得對一個群體中的大部分 個體而言有效的抗體將是不太可能的。另外，MICA中的位置129處的甲硫氨酸/纈氨酸雙 同態決定了 NKG2D結合方面的差異，并且盡管殘基129的側鏈被部分掩埋并且與谷氨酰胺 136、丙氨酸139以及甲硫氨酸140在第一 a 2螺旋延伸（helical stretch)中形成疏水相 互作用，但是與MICA的纈氨酸129形式相比，它可能與這一結構域中的構象方面的差異相 關（Steinle (施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遺傳學）53:279-287)。
[0015] 總之，對用治療劑靶向MICA的新途徑存在需要。
[0016] 發明概述
[0017] 在一個方面中，本發明尤其源自跨越人類MICA等位基因（以及在非人靈長類MICA 上）發現具有高親和力的抗體。
[0018] 這些抗體值得注意地結合來自兩個主要MICA類群中每一個的一個或多個MICA等 位基因，這兩個主要MICA類群被確定代表MICA的主要家族：強烈結合NKG2D的類群1等 位基因（包括MICA #001、#002、#007、#012、#017以及 #018)和微弱結合NKG2D的類群2等位 基因（MICA*004、*006、*008、*009 以及 *019)。通過與存在于亞群 MICA*001、*004、*007 以及 #008或#001、#004、#007、 #008以及#019上的表位結合，這些抗體覆蓋存在于幾乎全部個體 中的兩個類群的等位基因。任選地，這些抗體對于與在其表面表達 #〇〇1的細胞、與在其表 面表達#004的細胞、與在其表面表達#007的細胞以及與在其表面表達 #008的細胞的結合 而言具有至多5 y g/ml，任選地至多3 y g/ml、至多2 y g/ml、至多I y g/ml或至多0. 5 y g/ ml 的 EC50。
[0019] 對于有效介導CDC和ADCC的抗體而言，高親和力結合是尤其有利的。本發明提供 了位于a 1和/或a 2結構域內的MICA上的表位，這些結構域對于誘導高ADCC和/或⑶C 活性而言是最佳抗體結合區，然而仍跨越主要MICA等位基因發現了這些表位。這些表位通 常在a 1和/或a 2結構域的側面上并且整個在NKG2D結合表面外面或部分與NKG2D結合 表面重疊。另外，鑒定a 3表位展示出增強的ADCC/⑶C和多等位基因結合特征。
[0020] 還鑒定抗體的亞組阻斷MICA與NKG2D的相互作用。除了當包括被Fe Y受體結合 的Fc結構域誘導ADCC和CDC活性或當包括基本不被Fe Y受體結合的Fc結構域阻斷前炎 性活性之外，這些抗體由于其能夠阻斷sMICA誘導的NKG2D的下調的能力是有用的。
[0021] 還鑒定抗體的其他亞組不阻斷細胞（例如腫瘤細胞、轉染子）的表面上的MICA在 NKG2D表達免疫細胞中誘導NKG2D活性的能力，該免疫細胞在抗MICA抗體的存在下與所述 MICA表達細胞進行接觸。除了誘導ADCC和⑶C活性以外，這些抗體由于其避免抑制NKG2D， 這樣使得NKG2D表達免疫效應細胞仍能夠經由NKG2D溶解靶細胞的能力是有用的（例如， 除了任何Fe Y受體介導的機制以外）。
[0022] 重組體和細胞表面結合MICA似乎能夠具有不同構象并且結合細胞結合MICA 對MICA蛋白可以具有遠程效應。特別出人意料地，當使用重組蛋白時，細胞（例如腫瘤 細胞、轉染子）的表面上的MICA通過NKG2D誘導信號轉導的能力的阻斷不經常與阻斷 MICA-NKG2D相互作用的能力相關聯（Biacore studie)。還特別出人意料地，雖然發現全等 位基因抗體未完全位于a Ia 2結構域的平臺（plateau)上的NKG2D結合區域內，但是MICA 通過NKG2D阻斷細胞（例如腫瘤細胞、轉染子）的表面上的MICA誘導信號轉導的能力不與 結合表位的位置相關聯。一些遠離NKG2D交互區的抗體能夠阻斷NKG2D活性的誘導，而一 些靠近NKG2D結合區或與其部分重疊的抗體不阻斷NKG2D活性的誘導。抗體此外在隨其表 位而變的介導CDC的能力方面存在不同。
[0023] MICA的類群1等位基因通常在殘基129處具有M，而類群2等位基因在殘基129 處具有V。在一個實施方式中，MICA類群的特征在于該MICA多肽的位置129處的甲硫氨酸 (M)或纈氨酸（V)殘基的存在，其中M與強烈結合NKG2D的MICA形式相關并且V與較低的 結合NKG2D相關。
[0024] 在一個實施方式中，本發明提供了以下抗體，這些抗體與在位置129處具有甲硫 氨酸的MICA等位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位基因交叉反應。在一個方 面中，本發明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體與在位置129處具有甲硫氨酸的人類 MICA多肽和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽特異性結合。任選地，這些抗體對于 與在其表面表達在位置129處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽的細胞以及與在其表面表達 在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽的細胞的結合而言具有至多5 ii g/ml，任選地至 多 3 y g/ml、至多 2 y g/ml、至多 I y g/ml 或至多 0? 5 y g/ml 的 EC50。
[0025] 在一個實施方式中，該抗體進一步與在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽結合 (例如，與SEQ ID NO:6的MICB多肽結合）。
[0026] 發現的這些結合區仍存在于糖基化的MICA上，值得注意地是由人類腫瘤細胞優 先表達的具有糖基化作用的MICA。
[0027] 在一個實施方式中，本發明尤其源自在阻斷MICA與NKG2D的相互作用的同時在體 外和體內有效誘導MICA表達腫瘤細胞的效應細胞（例如NK細胞和/或T細胞）溶解的抗 體的發現。阻斷NKG2D-MICA相互作用的抗體是有利的，因為此類抗體可以阻止sMICA誘導 的NKG2D的下調，如在此所示。此類阻斷抗體對于具有高水平的可溶性MICA(例如在循環 中）的患者的治療而言可以是特別有用的。在另一個實施方式中，本發明提供了以下抗體， 這些抗體在體外和體內有效誘導MICA表達腫瘤細胞的效應細胞（例如NK細胞和/或T細 胞）溶解并且抑制sMICA誘導的NKG2D在免疫效應細胞的表面上的表達的下調而不實質阻 斷MICA自MICA表達細胞（例如腫瘤細胞）脫落。此類抗體可以通過抑制MICA與NKG2D的 相互作用來抑制sMICA誘導的NKG2D表達的下調。任選地，該抗體包括9C10、19E9、12A10、 18E8、14B4或10F3的輕鏈和重鏈⑶R，任選地在⑶R中具有一個或多個氨基酸修飾。
[0028] 在另一個實施方式中，本發明提供了以下抗體，這些抗體在體外和體內有效誘導 MICA表達腫瘤細胞的效應細胞（例如NK細胞和/或T細胞）溶解而不實質阻斷MICA自 MICA表達細胞（例如腫瘤細胞）脫落并且不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用。任選地， 該抗體包括6E4、20C6、16A8、15F9、10A7或14B4的輕鏈和重鏈CDR，任選地在CDR中具有一 個或多個氨基酸修飾。
[0029] 在一個實施方式中，提供了與a I a 2結構域（該結構域被包含在NKG2D界面中） 結合的抗體，這些抗體與多個MICA等位基因（例如在位置129處具有甲硫氨酸的MICA等 位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位基因；MICAsnOOI、#004、#007以及#008等位 基因）交叉反應并且以高親和力與此類MICA等位基因結合（例如對于與在其表面表達人 類MICA多肽的所述等位基因的細胞的結合而言至多5 ii g/ml，任選地至多3 ii g/ml、至多 2 ii g/ml、至多I ii g/ml或至多0. 5 ii g/ml的EC50)。任選地，這些抗體結合至以下區域，這 些區域在a I a 2結構域上，位于或部分位于NKG2D界面的外面，但是未完全在NKG2D界面 內。
[0030] 可以根據在此的實施例3的方法，使用例如流式細胞術評價與MICA等位基因的結 合以及相關的EC50值。
[0031] 在另一個實施方式中，本發明源自以下抗體的發現，這些抗體結合MICA的a 1和/ 或a 2結構域而不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表 達在細胞的表面）。任選地此類抗體的特征可以在于不與hNKG2D競爭與MICA的結合。任 選地，這些抗體不抑制MICA在NKG2D表達細胞中誘導NKG2D活性的能力。任選地此類抗體 的特征可以在于不降低或阻斷NKG2D表達效應細胞（例如CD16負效應細胞）溶解MICA表 達靶細胞的能力。這些抗體將任選地不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。
[0032] 在一個實施方式中，非阻斷a Ia 2結構域抗體結合在SEQ ID NO: 1的MICA多肽上 的表位，該表位包括一個或兩個選自由K81和D82組成的組的殘基，一個或兩個選自由Q83 和K84組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由H109、Ylll和Ll 16 (任選地殘基Dl 13)組 成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由Q131、S132和Q136組成的組的殘基，一個、兩個或 三個選自由S133、R134和T137組成的組的殘基，和/或1個、2個、3個或4個選自由M140、 N141、R143和N144組成的組的殘基（例如抗體20C6和10A7)。
[0033] 在一個實施方式中，非阻斷a I a 2結構域抗體結合這樣的表位，該表位包括一個 或兩個選自由R6和N8組成的組的殘基，一個或兩個選自由E97和H99組成的組的殘基，一 個、兩個或三個選自由E100、D101和N102組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由S103、 T104和R105 (任選地殘基E115)組成的組的殘基，和/或一個、兩個或三個選自由L178、 R179和R180組成的組的殘基（例如抗體15F9)。
[0034] 在一個實施方式中，非阻斷a I a 2結構域抗體結合這樣的表位，該表位包括一個 或兩個選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的Q48和W49組成的組的殘基和/或1個、2個、3 個或4個選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的E51、D52、V53和L54組成的組的殘基（例如 抗體6E4)。
[0035] 在另一個實施方式中，本發明尤其源自以下抗體的發現，這些抗體結合MICA的 a 3結構域，其中這些抗體不抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各 自表達在細胞的表面）。任選地，這些抗體不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。任選地，這樣 的抗體的特征可以在于不與hNKG2D競爭與MICA的結合。
[0036] 在一個實施方式中，非阻斷a 3結構域抗體結合這樣的表位，該表位包括一個、兩 個或三個選自由S224、H225和D226組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由T227、Q228 和Q229組成的組的殘基，和/或一個或兩個選自由W230和D232組成的組的殘基（例如抗 體 16A8)。
[0037] 在另一個實施方式中，本發明源自以下抗體的發現，這些抗體結合MICA的a 1和 /或a 2結構域并且抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表達 在細胞的表面）。任選地這樣的抗體的特征可以在于不與hNKG2D競爭與MICA的結合。這 些抗體將任選地抑制sMICA誘導的NKG2D在免疫效應細胞的表面上的表達的下調而不實質 阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。
[0038] 在一個實施方式中，阻斷a I a 2結構域抗體結合這樣的表位，該表位包括一個、 兩個或三個選自由E100、D101和N102組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由S103、T104 和R105組成的組的殘基，一個或兩個選自由N121和E123組成的組的殘基，和/或一個或 兩個選自由T124和E126組成的組的殘基（例如抗體19E9、18E8以及10F3)。
[0039] 在一個實施方式中，阻斷a I a 2抗體結合這樣的表位，該表位包括1個、2個或3 個選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的N56、K57和T58組成的組的殘基，和/或一個或兩個 選自由SEQ ID N0:1的MICA多肽的R61和R64組成的組的殘基（例如抗體9C10和12A10)。
[0040] 在另一個實施方式中，本發明尤其源自以下抗體的發現，這些抗體結合MICA的 a 3結構域，其中這些抗體抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自 表達在細胞的表面）。任選地，這些抗體不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。任選地，這樣的 抗體可以任選地被表征為與hNKG2D競爭與MICA的結合。這些抗體將任選地抑制sMICA誘 導的NKG2D在免疫效應細胞的表面上的表達的下調。這些抗體可以實質阻斷MICA自腫瘤 細胞脫落或可以任選地阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。
[0041] 在一個實施方式中，阻斷a 3結構域抗體結合這樣的表位，該表位包括一個、兩個 或三個選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基（抗體14B4)。
[0042] 不希望被理論束縛，相信盡管科學文獻假定在MICA(例如，sMICA或膜結合MICA) 和NKG2D下調與效應細胞的損傷之間存在因果關系，但是腫瘤情形（tumor settings)中 的MICA自身不總是導致效應細胞的實質損傷。具體而言，雖然sMICA可以導致NKG2D的下 調，但是在許多情況下出現在體內的sMICA的濃度太低以至于自身不能導致顯著的NKG2D 下調（參見實施例9)。此外，在腫瘤情形中（例如確立的疾病或晚期疾病），患者經由多種 非MICA組分（例如TGF-P)通常處于免疫抑制狀態，這些組分在其他效應之間具有導致 NKG2D的下調的潛力。因此，阻斷或不阻斷NKG2D-MICA相互作用并且不抑制MICA脫落的 試劑在癌癥的治療方面是有效的，只要它們能夠誘導CDC和/或ADCC。不阻斷NKG2D-MICA 相互作用的抗體是有利的，因為MICA表達腫瘤細胞具有保留可被存在的免疫活性效應細 胞上的NKG2D識別的潛力（例如由于在治療過程中或隨后重建免疫活性，對于具有較長持 續時間、重復給予或以高劑量給予的治療而言）。阻斷NKG2D-MICA相互作用的抗體是有利 的，因為此類抗體可以阻止MICA誘導的NKG2D的下調（參見實施例9)。此類阻斷抗體對于 具有高水平的可溶性MICA(例如在循環中）的患者的治療而言可以是特別有用的。
[0043] 在一個實施方式中，本發明提供了 MICA結合化合物，優選與MICA多肽特異性結合 的抗體（抗MICA抗體），而不可檢測地減少MICA與NKG2D之間的結合（例如，腫瘤細胞上 的表面MICA與效應細胞上的表面NKG2D的相互作用），例如，而不實質阻斷MICA與NKG2D 的相互作用。在一個實施方式中，本發明提供了 MICA結合化合物（例如MICA結合多肽）， 該化合物與MICA多肽結合而不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。在一個實施方式中，本發 明提供了 MICA結合化合物，該化合物與MICA多肽結合而不實質阻斷MICA與NKG2D的相互 作用并且不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。
[0044] 在另一個實施方式中，本發明提供了以下抗體，這些抗體結合人類MICA(特別是 在a 1和/或a 2結構域中）、識別主要的MICA等位基因MICA*001、MICA*004、MICA*008并 且任選地進一步識別MICA #007和/或MICAsnO 19。在一個實施方式中，這些抗體任選地進一 步識別非人靈長類物種（例如食蟹猴）的MICA。在一個實施方式中，這些抗體任選地進一 步識別以下MICB多肽，該多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。任選地，在另一個實施方 式中，這些抗體不進一步識別MICB。任選地，這些抗體不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落。 任選地，這些抗體不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用。
[0045] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與由人類腫瘤細胞表達的糖 基化MICA多肽特異性結合。
[0046] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與由非人靈長類細胞表達的 MICA多肽特異性結合。
[0047] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合（抗 MICA抗體），其中該抗體結合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽 (MICA*008)。在一個實施方式中，該抗體進一步結合SEQ ID NOl的多肽（MICA*001)。在一 個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合，其中該抗體結合 SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一個實施方式中，該抗體進一步結合SEQ ID NO 3的 多肽（MICA#007)。在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性 結合，其中該抗體結合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4的多肽（MICA*008)以 及SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與 MICA多肽特異性結合，其中該抗體結合SEQ ID NO 1的多肽（MICA*001)、SEQ ID NO 2的多 肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4 的多肽（MICA*008)以及 SEQ ID NO 5 的多肽（MICA*019)，任選 地進一步其中該抗體結合SEQ ID NO 3的多肽（MICA*007)。通過與跨越MICA等位基因的 類群1和類群2兩者的等位基因MICA#001、- #004和#008結合（并且有利地進一步#007和 #〇19)，幾乎整個人類群體都將適于用本發明的這樣的抗MICA劑的治療。在任一實施方式 中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括0-聚糖（連接至絲氨酸或蘇氨酸的N-乙酰乳糖胺）。 在任一實施方式中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括核心20-聚糖（包括連接至N-乙酰半 乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）和/或N聯聚糖。在一個實施方式中，該抗體與 MICA多肽結合而不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或不實質阻斷MICA自腫瘤細 胞脫落。在一個實施方式中，該抗體結合MICA的a 1和/或a 2結構域。在一個實施方式 中，該抗體結合MICA的a 3結構域。
[0048] 優選地，該化合物是一種抗體，任選地包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗 體。優選地，針對人類MICA多肽，該抗體具有小于10_ 9M，優選小于KTwM或優選小于KT11M 的結合親和力（Kd)，任選地其中結合親和力是二價的。優選地，該抗體是一種消耗性抗體， 任選地其中該抗體針對MICA表達腫瘤細胞誘導ADCC和/或⑶C。
[0049] 在一個【具體實施方式】中，本發明提供了一種抗體，該抗體通過NK或T細胞介導 MICA表達腫瘤細胞的消耗（例如在體外或在體內）而不實質抑制NKG2D介導的hNKG2D表 達NK或T細胞的細胞毒性。
[0050] 在一個【具體實施方式】中，本發明的抗體不與hNKG2D競爭與MICA的結合。
[0051] 在一個【具體實施方式】中，當本發明的抗體結合至MICA表達細胞上的MICA時，該 MICA表達細胞經由例如刺激hNKG2D的下調和/或內化而在結合后不實質減少細胞表面 hNKG2D的量，具有高親和力和緩慢的解離率，與食蟹猴和/或恒河猴MICA交叉反應，并且具 有消耗性同種型（如例如人類IgGl)。
[0052] 在一個方面中，本發明提供了特異性結合MICA的抗體，其中該抗體具有以下特性 中的一個或多個（包括其任何組合，或全部特性）：
[0053] (a)針對與MICA多肽的結合而言，具有小于KT8M,優選小于KT9M,或優選小于 KTiciM的Kd ;
[0054] (b)與對應于以下結構域的殘基的區段中的至少一個殘基結合，該結構域選自下 組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88、89-181和182-274和/或與 如在此所描述的表位（MICA上的一個或多個氨基酸殘基）結合；
[0055] (c)與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個、三個、四個或五個結合， 分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0056] (d)不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落；
[0057] (e)不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如，腫瘤細胞上的表面MICA與效應 細胞上的表面NKG2D的相互作用）；
[0058] (f)不導致由效應細胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細胞）溶解的MICA表達細胞的實 質降低；
[0059] (g)針對在其表面表達MICA的細胞，誘導補體依賴性細胞毒性（CDC)和/或抗體 依賴性細胞毒性（ADCC);以及
[0060] (h)與抗體 6E4、20C6、16A8、15F9 以及 10A7 競爭結合 MICA 多肽。
[0061] 在本文實施方式的任一個中，本發明抗體的特征可以在于以上（a)-(h)中的任何 一個或多個特征。
[0062] 在一個實施方式中，提供了一種測試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：（i)評價 該抗體是否阻斷MICA自MICA表達細胞脫落和/或（ii)評價該抗體是否阻斷MICA與NKG2D 的相互作用。步驟（i)可以任選地包括使結合MICA多肽的該抗體與表達MICA多肽的細胞 接觸。步驟（ii)可以任選地包括使結合MICA多肽的該抗體與MICA多肽（例如分離的多 肽或表達于細胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分離的多肽或表達于細胞的表面上 的多肽）的存在下接觸。
[0063] 在另一個實施方式中，提供了一種產生抗體的方法，該抗體結合哺乳動物對象體 內的MICA多肽，任選地用于癌癥的治療，所述方法包括以下步驟：a)提供多個抗體，任選地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳動物；并且b)進行一個選擇步驟以從該多個抗體 中選擇抗體，該步驟包括：
[0064] (i)測試抗體是否與人類MICA多肽結合，任選地SEQ ID NO 1-5的多肽中的一個、 兩個、三個、四個或所有，并且如果該抗體與這一種或多種人類MICA多肽結合，則選擇該抗 體；和/或
[0065] (ii)測試抗體是否阻斷MICA自MICA表達細胞脫落，并且如果該抗體不阻斷脫落， 則選擇該抗體；和/或
[0066] (iii)測試抗體是否阻斷MICA (例如表面MICA)與NKG2D的相互作用，優選地測試 其中該抗體是否導致由效應細胞（例如，NKG2D+CD16-NK細胞）溶解的MICA表達細胞的實 質降低，并且如果該抗體不阻斷MICA (例如表面MICA)與NKG2D的相互作用，優選地其中該 抗體不導致MICA表達細胞的溶解的實質降低，則選擇該抗體。
[0067] 在一個方面中，本發明尤其源自阻斷性抗MICA抗體的發現，這些抗體跨越來自兩 個主要類群的MICA等位基因的主要人類MICA非人靈長類（以及在非人靈長類MICA和MICB 上）具有高親和力。在一個實施方式中，MICA類群的特征在于該MICA多肽的位置129處 的甲硫氨酸（M)或纈氨酸（V)殘基的存在，其中M與強烈結合NKG2D的MICA形式相關并且 V與較低的結合NKG2D相關。在一個實施方式中，本發明提供了以下阻斷抗體，這些阻斷抗 體與在位置129處具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位 基因交叉反應。在一個方面中，本發明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體與在位置129 處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽特異性結 合，其中所述抗體抑制MICA介導的hNKG2D活性。在一個實施方式中，該抗體進一步與在位 置152處具有纈氨酸的MICB多肽結合（例如，與SEQ ID NO: 1的MICB多肽結合）。優選 地，所述抗體抑制MICB介導的hNKG2D活性。報道在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽顯 示出與可溶性NKG2D的強烈結合。結合在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽以及在位置 129處具有甲硫氨酸的MICA多肽的抗體在以下個體中可以是有利的，這些個體具有較大的 敏感性或由與NKG2D強烈結合的等位基因引起的嚴重疾病。
[0068] 本發明的阻斷性抗MICA抗體還與來自兩個主要MICA類群中的每一個的一個或多 個高普遍性等位基因交叉反應（結合），這兩個主要MICA類群被確定代表MICA的主要家 族：強烈結合NKG2D的類群1等位基因（包括MICA*001、*002、*007、*012、*017以及*018)和 微弱結合NKG2D的類群2等位基因（MICA*004、*006、*008、*009以及*019)。通過與存在于 亞群MICAsnOOI、#004、#007、#008以及 #019上的表位結合，這些抗體覆蓋存在于幾乎全部個體 中的兩個類群的等位基因。MICA的類群1等位基因通常在殘基129處具有M，而類群2等 位基因在殘基129處具有V。
[0069] 在另一個方面中，本發明尤其源自以下發現，跨越MICA(以及在非人靈長類MICA 和MICB上）針對某些表位的抗體在NKG2D阻斷方面比其他抗MICA抗體或抗NKG2D抗體顯 著更有效，并且還比由其結合MICA的能力預期的更有效地阻斷NKG2D介導的細胞毒性。具 體而言，具有皮摩爾范圍內的親和力的抗MICA抗體在抑制方面比具有2-log較少親和力 (Kd)的抗MICA抗體好4-log。
[0070] 本發明的阻斷性MICA抗體可以由阻止與NKG2D的任何競爭、被其置換、或其殘留 結合的能力表征。其他高親和力NKG2D或MICA抗體可以通過其配體（例如分別為MICA/ ULPBs/RAETl或NKG2D)留下一些開放的置換。而且，如由NKG2D-MICA相互作用的晶體結 構所觀察到的，NKG2D作為同源二聚體起作用并且具有兩個對稱表面（每條NKG2D鏈上一 個），這些表面與MICAa I a 2平臺結構域的頂部相互作用。這兩條NKG2D鏈通過結合至不 對稱MICA平臺結構域的明顯不同的表面都有助于該相互作用（參見例如，Li(李）等人 (2001)Nature Immunol.(自然免疫學）2(5):443-450)。本發明的這些抗體因此可以任選 地完全阻斷MICA-NKG2D相互作用，例如通過阻斷（例如干擾、競爭）NKG2D同源二聚體中的 兩個NKG2D單體與MICA多肽的結合。其他MICA抗體（或NKG2D抗體）可以僅完全阻斷兩 個NKG2D結合位點中的一個。
[0071] 除了當被用作消耗性抗體（例如IgGl或IgG3同種型）其用于消耗MICA表達細 胞的用途以外，用本發明的阻斷性抗MICA抗體進行治療為靶向相信由MICA和/或B介導 的NKG2D的激活驅動的炎性病癥中的MICA(和MICB)提供了一種手段，而不減少引起不想 要的更寬的免疫系統抑制，通過減少可供與其他配體（例如ULBP)的結合使用的NKG2D受 體的數目以及隨后的激活。此類完全阻斷性抗MICA抗體的可能性還打開了向炎癥位點局 部遞送抗MICA抗體的可能性（例如，遞送進關節炎患者的炎癥的關節或其他位點），而不導 致由NKG2D抗體的給予引起的泛發性免疫抑制效應。
[0072] 在一個實施方式中，本發明提供了以下抗體，這些抗體在體外和體內抑制MICA表 達細胞的效應細胞（例如NK細胞和/或T細胞）溶解方面是有效的并且實質阻斷MICA與 NKG2D的相互作用。
[0073] 在一個實施方式中，特別是當用于治療炎性障礙或自身免疫性障礙時，本發明的 抗體是一種非消耗性抗體，該非消耗性抗體實質減少或抑制NKG2D激活、NKG2D信號轉導、 NKG2D表達NK或T細胞的激活、或效應細胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細胞）對MICA表達細 胞的溶解。
[0074] 在一個實施方式中，本發明提供了一種MICA結合化合物，優選與MICA多肽特異性 結合并且減少（例如基本消除）MICA與hNKG2D之間的結合（例如，細胞上的表面MICA與 效應細胞的表面NKG2D的相互作用）的抗體（抗MICA抗體）。
[0075] 在一個實施方式中，抗MICA抗體或結合化合物進一步與MICB多肽特異性結合并 且減少（例如基本消除）MICB與hNKG2D之間的結合。
[0076] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與hNKG2D競爭與MICA(以及 任選地MICB)結合并且阻止hNKG2D與MICA (以及任選地MICB)結合。
[0077] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體抑制或阻斷MICA(以及任選 地MICB)多肽與hNKG2D同源二聚體的兩條hNKG2D鏈的相互作用。任選地，該抗體阻斷 MICA多肽（以及任選地MICB多肽）的a 1結構域和MICA多肽（以及任選地MICB多肽） 的a 1結構域兩者與hNKG2D同源二聚體的相互作用（例如，該抗體抑制MICA a I a 2平臺 與hNKG2D同源二聚體的兩條hNKG2D鏈的相互作用）。
[0078] 在一個實施方式中，本發明的抗體不實質與HCMV、UL18、ULBP 1、ULBP2、ULBP 3、 ULBP 4、ULBP 5或ULBP 6多肽結合（參見Champsaur (沙姆普斯勞）等人（2010) Immunol. Rev.(免疫學評論）235:267-285)。
[0079] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與在位置129處具有甲硫氨 酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）和在位置129處具有纈氨酸的人類 MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）上的共同決定子特異性結合，任選地進一步與 在位置152處具有纈氨酸的人類MICB多肽（例如天然存在的MICB等位基因）上的共同決 定子特異性結合，其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間（以及任選地MICB 與NKG2D之間）的結合。
[0080] 在另外的實施方式中，本發明尤其源自以下抗體的發現，這些抗體結合人類MICA， 優選在a la2平臺結構域（即a 1和/或ci2結構域）中，并且識別主要的MICA等位基 因MICA*001、MICA*004、MICA*008并且任選地進一步識別MICA*007和/或MICA*019,并且任 選地進一步識別非人靈長類物種（例如食蟹猴）的MICA，并且任選地進一步識別MICB。在 一個實施方式中，這些抗體進一步識別以下MICB多肽，該多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸 序列。任選地，這些抗體此外不實質抑制MICA自腫瘤細胞脫落。
[0081] 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合（抗 MICA抗體），其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間的結合并且該抗體結合 SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)。在一個實施方式中， 該抗體進一步結合SEQ ID NO: 1的多肽（MICAsnOOI)。在一個實施方式中，本發明提供了一 種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合，其中該抗體結合SEQ ID NO: 5的多肽（MICA#019)。 在一個實施方式中，該抗體進一步結合SSEQ ID N0:3的多肽（MICA#007)。在一個實施方式 中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合，其中該抗體結合SEQ ID NO: 2 的多肽（11〇六*004)、5￡〇10勵:4的多肽（]\0〇六*008)以及5￡〇10勵:5的多肽（]\0〇六*019)。 在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結合，其中該抗體 結合 SEQ ID N0:1 的多肽（MICA*001)、SEQ ID N0:2 的多肽（MICA*004)、SEQ ID N0:4 的 多肽（MICA*008)以及SEQ ID N0:5的多肽（MICA*019)，任選地進一步其中該抗體結合SEQ ID NO: 3的多肽（MICA*007)。通過與跨越MICA等位基因的類群1和類群2兩者的等位基 因MICA#001、- #004和#008結合（并且有利地進一步#007和#019)，幾乎整個人類群體都將 適于用本發明的這樣的抗MICA劑的治療。在一個實施方式中，該抗體結合MICA的a 1和 /或a 2結構域。
[0082] 優選地，該化合物是一種抗體，任選地包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗 體。
[0083] 優選地，針對人類MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或MICB等 位基因中的任何一個或多個或所有），該抗體具有小于KT 9M,優選小于KTwM,優選小于 KT11M,優選小于KT12M,或優選小于KT 13M的結合親和力（Kd)，任選地其中結合親和力是單 價的或二價的。優選地，該抗體是包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗體并且K d是 二價的。任選地，對于與表達具體的MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或 MICB等位基因中的任何一個或多個或所有）的細胞的結合而言,該抗體具有至多IOii g/ ml、5ii g/ml或Iii g/ml的EC50。適合的細胞的實例是ClR-MICA細胞。
[0084] 在一個實施方式中，特別是當該抗體被用于治療或預防炎性疾病或自身免疫性疾 病時，該化合物是非消耗性抗體（不消耗結合至其上的細胞的抗體）。優選地，該抗體是嵌 合抗體、人源化抗體或人類抗體。優選地，該抗體不包括能夠被Fcy3A受體（CD16)結合的 恒定區，例如人類IgG4亞型的抗體或缺少Fc結構域的抗體片段。優選地，該抗體包括人類 IgG4同種型的重鏈恒定區。
[0085] 在一個實施方式中，該抗體與由非人靈長類細胞表達的MICA多肽特異性結合。在 一個【具體實施方式】中，本發明的抗體對于結合人類MICA而言具有高親和力和緩慢的解離 率，并且與食蟹猴（cynomolgus，Macaca fascicularis)和/或恒河猴（稱猴）MICA交叉反 應。
[0086] 在一個方面中，本發明提供了特異性結合MICA的抗體，其中該抗體具有以下特性 中的一個或多個（包括其任何組合，或全部特性）：
[0087] (a)對于與MICA多肽的結合而言，具有小于KT9M,優選小于KTkiM,優選小于 KT11M,優選小于10_12M，或優選小于KT13M的K D，優選地其中針對每個MICA多肽等位基因 MICA#001、#004和#008,優選地進一步針對#007和/或 #019,該抗體具有所述Kd的親和力； [0088] (b)與對應于以下結構域的殘基的區段中的至少一個殘基結合，該結構域選自下 組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88或89-181，和/或與如在此所 描述的表位（MICA上的殘基）結合；
[0089] (c)與在位置129處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位 基因）和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）結 合，其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間的結合；和/或與在位置152處具 有纈氨酸的人類MICB多肽（例如天然存在的MICA等位基因）結合；
[0090] (d)與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個、三個、四個或五個結合， 分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0091] (e)不實質阻斷MICA自腫瘤細胞脫落；
[0092] (f)抑制和/或實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如，腫瘤細胞上的表面 MICA與效應細胞上的表面NKG2D的相互作用），任選地其中這些抗體阻斷MICA與NKG2D同 源二聚體內的兩條NKG2D鏈的相互作用；
[0093] (g)能夠減少或抑制MICA介導的NKG2D激活、NKG2D信號轉導、NKG2D表達NK或 T細胞的激活、或效應細胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細胞）對MICA表達細胞的溶解；
[0094] (h)針對在其表面表達MICA的細胞，實質誘導或不實質誘導（例如，取決于該mAb 是否被CD16發現，取決于該抗體的Fc區的性質）補體依賴性細胞毒性（CDC)和/或抗體 依賴性細胞毒性（ADCC);
[0095] (i)能夠減少或抑制sMICA介導的NKG2D在NKG2D表達細胞（例如T細胞或NK細 胞）的表面上的表達的下調；
[0096] 以及
[0097] (j)與抗體 9C10、19E9、12A10、18E8 或 10F3 競爭與 MICA 多肽的結合。
[0098] 在本文實施方式的任一個中，本發明抗體的特征可以在于以上（a)-(j)中的任何 一個或多個特征。
[0099] 在一個實施方式中，提供了一種測試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：（i)評價 該抗體是否以商未和力與在殘基129處具有甲硫氣酸的MICA多膚和在殘基129處具有繳 氨酸的MICA多肽兩者（以及任選地進一步，在殘基152處具有甲硫氨酸的MICB多肽）結 合，并且（ii)評價該抗體是否阻斷MICA (以及任選地MICB)與NKG2D的相互作用。在一個 實施方式中，提供了一種測試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：⑴評價該抗體是否以高 親和力與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個、三個、四個或五個結合，這些多 肽分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列并且（ii)評價該抗體是否阻斷MICA與NKG2D的相互作 用。步驟（i)可以任選地包括使結合MICA多肽的該抗體與表達MICA多肽的細胞接觸。步 驟（ii)可以任選地包括使結合MICA多肽的該抗體與MICA多肽（例如分離的多肽或表達 于細胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分離的多肽或表達于細胞的表面上的多肽） 的存在下接觸。在步驟（i)中結合所述MICA多肽并且在步驟（ii)中阻斷MICA與NKG2D 的相互作用的抗體可以被鑒定和/或選擇為用于炎性障礙或自身免疫性障礙的候選治療。
[0100] 在另一個實施方式中，提供了一種產生抗體的方法，該抗體結合哺乳動物對象體 內的MICA多肽，任選地用于癌癥的治療，所述方法包括以下步驟：a)提供多個抗體，任選地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳動物或產生抗體的噬菌體展示文庫；并且b)進行 一個選擇步驟以從所述多個抗體中選擇抗體，該步驟包括：
[0101] ⑴測試抗體是否以高親和力與人類MICA多肽，任選地MICA*001、*004、*007、*008 以及*019等位基因中的一個、兩個、三個或所有，例如分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列的多 肽結合，并且如果抗體以高親和力與所述MICA多肽結合，則選擇該抗體；和/或
[0102] (ii)測試抗體是否阻斷MICA(例如，表面MICA，MICA*001、*004、*007、*008 #&*019 等位基因中的任何一個、兩個、三個或所有）與hNKG2D的相互作用，和/或是否減少或抑制 NKG2D激活、NKG2D信號轉導、NKG2D表達NK或T細胞的激活、或效應細胞（例如，NKG2D+T 細胞、NKG2D+CD16+NK細胞、NKG2D+CD16-NK細胞）對MICA表達細胞的溶解，并且如果抗體 阻斷MICA與hNKG2D的相互作用，則選擇該抗體；和/或。
[0103] (iii)當NKG2D表達細胞與可溶性MICA多肽在抗體的存在下進行接觸時，測試該 抗體是否減少或抑制所述NKG2D表達細胞中的NKG2D下調（降低細胞表面表達），并且如果 抗體減少或抑制NKG2D下調，則選擇該抗體。
[0104] 該方法可以任選地包括選擇步驟（iv)，其包括測試抗體是否阻斷MICA自MICA表 達細胞脫落，并且如果該抗體不阻斷脫落，則選擇該抗體。
[0105] 在一個實施方式中，本發明的抗體結合表位，該表位包括選自以下組的人類MICA 多肽的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232(參照 SEQ ID NO 1-5 中的任一個的 MICA)。
[0106]在一個實施方式中，本發明提供了 MICA結合化合物（優選抗MICA抗體），該化合 物至少部分地、或任選地完全地結合在MICA多肽的a 1和/或a 2結構域內。a 1和a 2 結構域分別位于氨基酸殘基1至88 (任選地1-85)和89至181 (任選地86-181)內，參照 SEQ ID NO 1的MICA多肽。任選地，在本文實施方式的任一個中，該抗體與在MICA多肽的 a 1結構域內的氨基酸殘基（SEQ ID NO 1的殘基氨基酸殘基1至88 (任選地1-85))結合。 任選地，在本文實施方式的任一個中，該抗體與在MICA多肽的a 2結構域內的氨基酸殘基 (SEQ ID NO 1的殘基氨基酸殘基89至181 (任選地86-181))結合。任選地，在本文實施方 式的任一個中，該抗體與MICA多肽的a 1和a 2結構域內的氨基酸殘基結合。
[0107] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一個或兩個選自由Q48和W49組成 的組的殘基，和/或1個、2個、3個或4個選自由E51、D52、V53和L54組成的組的殘基（抗 體 6E4)。
[0108] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括1個、2個或3個選自由N56、K57和 T58組成的組的殘基，和/或一個或兩個選自由R61和R64組成的組的殘基（抗體9C10和 12A10)。
[0109] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一個或兩個選自由K81和D82組成 的組的殘基，一個或兩個選自由Q83和K84組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由H109、 Ylll和L116 (任選地殘基D113)組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由S133、R134和 T137組成的組的殘基，和/或1個、2個、3個或4個選自由M140、N141、R143和N144組成 的組的殘基（抗體20C6)。
[0110] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一個或兩個選自由K81和D82組成 的組的殘基，一個或兩個選自由Q83和K84組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由H109、 Ylll和L116(任選地殘基D113)組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由Q131、S132和 Q136組成的組的殘基，和/或1個、2個、3個或4個選自由M140、N141、R143和N144組成 的組的殘基（抗體10A7)。
[0111] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一個、兩個或三個選自由E100、 DlOl和N102組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由S103、T104和R105組成的組的殘 基，一個或兩個選自由N121和E123組成的組的殘基，和/或一個或兩個選自由T124和E126 組成的組的殘基（抗體19E9和18E8)。
[0112] 在一個實施方式中，這些抗體結合表位，該表位包括一個或兩個選自由R6和N8 組成的組的殘基，一個或兩個選自由E97和H99組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由 E100、DlOl和N102組成的組的殘基，一個、兩個或三個選自由S103、T104和R105 (任選地 殘基E115)組成的組的殘基，和/或一個、兩個或三個選自由L178、R179和R180組成的組 的殘基（抗體15F9)。
[0113] 在一個實施方式中，本發明提供了 MICA結合化合物（優選抗MICA抗體），該化合 物至少部分地結合在MICA多肽的a 3結構域內。a 3結構域分別位于氨基酸殘基182至 274內，參照SEQ ID NO 1的MICA多肽。在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一 個、兩個或三個選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基（抗體14B4和16A8)。在一個 實施方式中，抗體結合表位，該表位包括一個、兩個或三個選自由S224、H225和D226組成的 組的殘基，一個、兩個或三個選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基，和/或一個或兩個 選自由W230和D232組成的組的殘基（抗體16A8)。
[0114] 任選地，與SEQIDNO: 1的野生型MICA多肽的結合相比，該抗體與在a1和/或 a2結構域內的上述殘基中的任一個處具有突變的MICA多肽的結合被實質減少。
[0115] 本發明提供抗MICA抗體的使用對于例如人類對象的癌癥、炎性障礙以及自身免 疫性障礙的治療而言可以是有用的。
[0116] 在一個方面中，不抑制NKG2D與MICA之間的相互作用的抗體、或抑制NKG2D與 MICA之間的相互作用的抗體將是消耗性抗體。此類抗體在癌癥的治療方面是特別有用的， 但是也可以用于炎癥和自身免疫性障礙。抗體可以在或不在偶聯至毒劑或其他試劑的情況 下使用，取決于這些抗體的所希望的效果或用途。在一個實施方式中，該抗MICA抗體是"裸 抗體"并且未被偶聯至毒劑，任選地該裸抗體包括被修飾以增加與Fe Y受體（例如CD16) 的結合的Fc區。在一個實施方式中，裸抗體或偶聯抗體包括重鏈，該重鏈包括結合Fcy受 體（例如⑶16)的人類Fc區（例如IgGl)。任選地，針對在其表面表達MICA的細胞，這樣 的抗體誘導補體依賴性細胞毒性（CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。
[0117] 任選地，在任一實施方式中，該抗體（例如IgGU抗體片段等）進一步包括對細胞 有毒的毒劑（例如化療劑）。
[0118] 在一個方面中，抑制MICA誘導的NKG2D在效應細胞中的活性的抗體將是非消耗性 抗體（不消耗結合至其上的細胞的抗體）。在一個方面中，該抗體是嵌合抗體、人源化抗體 或人類抗體。在一個方面中，該抗體不包括能夠被Fcy3A受體（CD16)結合的恒定區，例如 人類IgG4亞型的抗體或缺少Fc結構域的抗體片段。在一個實施方式中，該抗體包括IgG4 重鏈，根據EU索引（EU-index)，該重鏈在殘基228中包含絲氨酸至脯氨酸突變。優選地，該 抗體包括人類IgG4同種型的重鏈恒定區。此類抗體在炎癥和自身免疫性障礙的治療方面 是特別有用的。
[0119] 本披露進一步提供了特異性結合人類MICA的抗體、抗體片段以及衍生物。本發明 提供了此類抗體組合物，同樣提供了它們在本發明的這些方法的任一個中治療、預防以及 診斷癌癥、炎性障礙以及自身免疫性障礙的用途。
[0120] 在一個實施方式中，針對人類MICA多肽（例如，SEQ ID NO 1-5的MICA*001、*004、 *007、*008以及*019等位基因中的一個、兩個、三個或所有的多肽，優選地針對MICA*001、 #004以及#008中的每一個）而言，這些抗體具有小于10_8M，優選小于10_ 9M，或優選小于 KT10M的結合親和力（Kd)。
[0121] 在本發明的實施方式的任一個的一個方面中，該抗體可以具有重鏈和/或輕鏈， 該重鏈和/或輕鏈具有一個、兩個或三個選自下組的抗體的對應的重鏈和/或輕鏈的 CDR,該組由以下各項組成：6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 以及 14B4。
[0122] 在本發明的實施方式的任一個的一個方面中，該抗體與以下單克隆抗體中的任 一個或任何組合競爭與MICA多肽的結合，這些單克隆抗體是6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、 12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4。在一個實施方式中，本發明的抗體與選自下組的 抗體競爭與MICA多肽的結合，該組由以下各項組成：
[0123] (a)分別具有SEQ ID NO: 7和8的VH和VL區的抗體（6E4);
[0124] (b)分別具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL區的抗體（20C6);
[0125] (c)分別具有SEQ ID NO: 33和34的VH和VL區的抗體（16A8);
[0126] (d)分別具有SEQ ID NO:46和47的VH和VL區的抗體（19E9);
[0127] (e)分別具有SEQ ID NO: 57和58的VH和VL區的抗體（9C10);
[0128] (f)分別具有SEQ ID NO:68和69的VH和VL區的抗體（12A10);
[0129] (g)分別具有SEQ ID NO: 79和80的VH和VL區的抗體（10A7);
[0130] (h)分別具有SEQ ID NO:90和91的VH和VL區的抗體（18E8);
[0131] ⑴分別具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL區的抗體（10F3);
[0132] (j)分別具有SEQ ID NO: 112和113的VH和VL區的抗體（15F9);以及
[0133] (k)分別具有 SEQ ID NO: 123 和 124 的 VH 和 VL 區的抗體（14B4)。
[0134] 在一個實施方式中，該抗體是適合人類的。在一個實施方式中，該抗體是嵌合的， 例如包含非鼠類（優選人類）恒定區。在一個實施方式中，該抗體是人類的或人源化的。 在本發明的實施方式的任一個的一個方面中，該抗體的同種型是人類IgG，任選人類IgGU 1 862、1863或1864。在一個實施方式中，該抗體包括人類？(3結構域或具有被？(：￥1?(例如 Fe YRIIIA)結合的同種型，例如IgGl或IgG3同種型的抗體。
[0135] 在本發明的實施方式的任一個的一個方面中，該抗體是選自以下各項的抗體片 段：Fab、Fab' 4&13'-3114(&13'）2、？1雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多個不同抗體片段的多 特異性抗體。任選地，本發明的抗體此外是四聚體的（兩條重鏈和兩條輕鏈）并且因此是 二價的（例如IgG抗體）。
[0136] 在某些實施方式中，本發明的這些抗體進一步包括毒劑。在一個實施方式中，這些 抗體包括能夠直接導致表達MICA的細胞死亡的毒劑。在一個實施方式中，例如在體外測定 中，這些抗體能夠直接誘導（例如不存在免疫效應細胞時）至少20%、30%、40%或50% MICA表達細胞的細胞死亡。
[0137] 在一個方面中，本發明提供了使用本發明的抗MICA抗體進行治療的方法。這些抗 體可以被用作預防性或治療性治療；在本文實施方式的任一個中，治療有效量的該抗體可 以與預防有效量的抗體交換。在一個方面中，本發明提供了一種治療罹患癌癥、自身免疫 性障礙或炎性障礙的患者的方法，該方法包括向該患者給予藥學有效量的根據本發明的與 MICA多肽特異性結合的抗原結合化合物。
[0138] 本發明的治療方法以及根據本發明的抗MICA抗體可以被用于與第二治療劑組合 治療個體，該第二治療劑包括當用于治療癌癥時的抗癌劑（例如化療藥物、腫瘤疫苗、與腫 瘤細胞上的腫瘤特異性抗原結合的抗體、針對腫瘤細胞誘導ADCC的抗體、增強免疫應答的 抗體等），或用于治療自身免疫或炎癥的試劑。在一個實施方式中，該第二治療劑是結合并 激活活化受體或結合并阻斷效應細胞（例如NK細胞、T細胞）上的抑制性受體的試劑（例 如抗體）。在一個實施方式中，該第二治療劑是上調NKG2D配體在腫瘤細胞上的表達的試 劑（例如化療劑）。例如，可以使用組蛋白脫乙酰酶抑制劑。例如，丙戊酸鈉和肼酞嗪增加 MICA/B表達并且降低脫落。（Chavez-Bianco (查韋斯-布蘭科）2011Int J Oncol(國際腫 瘤學雜志）39 (6) : 1491-1499)。
[0139] 循環中增加水平的sMIC的存在與預后不良和/或MIC表達腫瘤相關。本發明進 一步涉及用于選擇罹患對使用本發明的抗MICA劑（例如與MICA多肽結合的抗體）的治療 應答的癌癥的對象的方法，該方法包括確定所述對象體內的腫瘤細胞是否放出（shed)MICA 多肽（例如，如通過循環中的sMIC的水平所評價的），MICA多肽自腫瘤細胞脫落的存在是 應答對象的指征。
[0140] 本發明進一步涉及一種用于選擇摧患對使用本發明的抗MICA劑（例如與MICA多 肽結合的抗體）的治療應答的障礙（例如，癌癥、自身免疫性障礙、炎性障礙）的對象的方 法，該方法包括確定所述對象體內的細胞（例如腫瘤細胞、前炎性細胞等）是否表達MICA 多肽，MICA多肽的表達是應答對象的指征。在一個實施方式中，該方法包括確定所述對象 體內的細胞（例如腫瘤細胞、前炎性細胞等）是否表達選自由SEQ ID NO 1-5組成的組的 MICA多肽。在一個實施方式中，該方法包括確定所述對象體內的細胞是否表達選自下組的 MICA多肽，該組由以下各項組成：MICA #001、#004、#007、#008以及#019多肽，這些多肽分別 包括SEQ ID NO: 1-5的序列，其中MICA多肽的表達是應答對象的指征。在一個實施方式 中，確定所述對象體內的細胞是否表達MICA多肽的步驟包括使來自該對象的生物樣品（例 如，通過進行活檢和/或獲得癌細胞細胞、血液或任何組織樣品等）與本發明的抗MICA抗 體（例如與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的一個、兩個、三個、四個或所有結 合的抗體）接觸。在一個實施方式中，該方法包括確定所述對象是否包括脫落的MICA(例 如檢測循環中的sMICA或檢測外來體（例如，等位基因 #008)的表面上的MICA的存在）。
[0141] 任選地，在這些方法的任一個中，該方法進一步包括向應答對象給予與MICA多肽 結合的抗體（例如本發明的抗MICA抗體）。
[0142] 在一個優選實施方式中，使用MICA特異性配體確定MICA多肽在疾病相關細胞中 的表達。優選地，該配體是抗體或其片段或衍生物。
[0143] 在另一個方面中，本發明包括一種方法（例如，一種進行診斷測定、應答測定等的 方法），該方法包括評價患者是否具有表達MICA多肽（例如被本發明的抗體結合的MICA多 肽（一個或多個MICA等位基因））的疾病相關細胞（例如，腫瘤細胞）。所述方法可以包括 例如從包括疾病相關細胞的患者獲得生物樣品，使所述疾病相關細胞與這樣抗體接觸并且 評價該抗體是否與疾病相關細胞結合。疾病相關細胞表達MICA的發現表明該患者罹患由 MICA表達細胞表征和/或適于用本發明的抗MICA抗體治療的病癥。可以進一步用適于由 MICA表達細胞表征的具體疾病的療法治療該患者。任選地，用該抗MICA抗體治療該患者。 在一個實施方式中，該方法用于選擇罹患癌癥的對象，并且這些疾病相關細胞是癌細胞。
[0144] 本發明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括：
[0145] a)確定該患者是否具有致病的MICA表達細胞，并且
[0146] b)如果確定該患者具有致病的MICA表達細胞，則給予本發明的抗原結合化合物 (例如，抗體）。
[0147] 本發明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括：
[0148] a)確定該患者體內脫落的MICA的水平，并且
[0149] b)如果確定該患者具有升高水平的脫落的MICA，則給予本發明的抗原結合化合 物（例如，抗體），該化合物抑制sMICA導致NKG2D在免疫效應細胞上的下調的能力。
[0150] 可以在別處進一步描述本發明的這些以及另外的有利方面和特征。
[0151] 附圖簡述
[0152] 圖IA和IB示出了獲得自第一、第二以及第三免疫系列的抗體與MICA表達CRl轉 染子細胞 C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007 以及 C1R-MICA*008 的結合，如通過流 式細胞術所分析。
[0153] 圖2A-2G示出了 MICA多肽的視圖，包括處于黑暗陰影中的突變的氨基酸殘基，這 些突變的氨基酸殘基導致（以不同組合）抗體結合的損失。NKG2D結合位點示于中等陰影 的MICA多肽的頂部（并且還在結合至MICA的帶狀圖（ribbon diagram)中）。
[0154] 圖3示出了疊合的傳感圖，示出了單獨在NKG2D-FC芯片上注射MICAWl-BirA或 與同種型對照或嵌合的抗MICA抗體一起預溫育。在注射結束時，將傳感圖在Y軸歸一化并 且在X軸對齊。傳感圖代表兩個獨立的實驗。
[0155] 圖4示出了針對MICA-NKG2A阻斷的功能測定的結果，示出了抗MICA抗體減少或 抑制NKG2D+CD16-NK92細胞介導的MICA*019轉染的BaF/3的殺傷的能力，如通過測量靶細 胞釋放的 51Cr所確定。
[0156]圖 5A、5B 和 5C 示出了疊合的傳感圖，示出了在 ULBP-l-Fc(Fcl)、MICB-Fc(Fc2)、 ULBP-2-Fc (Fc3)以及ULBP-3-Fc (Fc4)上注射抗MICA抗體。在注射開始時，將傳感圖在X 軸對齊。
[0157] 圖6示出了抗MICA抗體與食蟹猴MICA的結合。
[0158] 圖7示出了在針對阻斷MICA脫落的能力的測定中，由抗a 3結構域BAM03而非由 16A8介導的MICA脫落的抑制，如通過在將MICA表達細胞與抗MICA抗體溫育過夜后測量上 清液中可溶性MICA濃度所評價。
[0159] 圖8顯示NKG2D在增加劑量的重組體二價MICA#019 #Fc蛋白（R&D系統）的存在下 被下調了其初始水平的30%至40%，并且顯示在實施例5B的細胞毒性測定（表E)中阻斷 NKG2D-MICA相互作用的抗MICA抗體阻斷表達于NK細胞上的NKG2D與MICA*019-Fc的相互 作用，從而逆轉由MICA #019-Fc蛋白誘導的NKG2D下調。
[0160] 圖9示出了指示Raji-MICAWl細胞在人類補體的存在下的生活力。結果顯示抗 MICA(同種型匹配的）導致死細胞數目增加并且能夠以表位依賴性方式誘導CDC。
[0161] 圖IOA顯示與陰性對照（人類IgGl同種型對照抗體）相比，抗MICA各自通過人 類KHYG-Ih⑶16V NK細胞系誘導C1R-MICA*008細胞的特異性溶解，由此顯示這些抗體針對 MICA#008表達靶細胞誘導ADCC。圖IOB示出了結合至細胞的抗體的水平。
[0162]圖11示出了在小鼠長期RAJI-MICA#01腫瘤模型中的測試的結果。用嵌合的抗 MICA或 IC(300iig IP 2x/周，持續3 周）或PBS 處理植入 Raji-MICAOl Highl5M IV 的 Nod SCID小鼠的存活。本發明的抗MICA抗體增加存活。
[0163] 發明詳述
[0164] 介紹
[0165] 本發明的抗體能夠直接并特異性靶向MICA表達細胞，值得注意地是腫瘤細胞以 及在炎性或自身免疫過程中涉及的細胞。本發明提供了多種具有這樣的特性的抗體，這些 抗體結合類群1和類群2等位基因兩者并且此外跨越這些類群內的主要人類MICA等位基 因。進一步提供了用于具體途徑的不同抗體。一些抗體阻斷MICA-NKG2D相互作用并且阻 止可溶性MICA(sMICA)誘導的NKG2D表面表達的下調；這些抗體由此用于重建患者體內 的NKG2D表達。此類抗體還可以由于其阻斷由被淋巴細胞上的NKG2D結合MICA而導致的 NKG2D激活的能力而被使用并且在炎癥和自身免疫性障礙的治療方面將是特別有利的。其 他抗體不與NKG2D競爭與MICA的結合并且在其中希望維持NKG2D對效應細胞的功能的情 況下的癌癥的治療方面將是有利的。任選地，這些抗體將不阻斷MICA自MICA表達腫瘤細 胞脫落。任選地，這些抗體結合MICA的a I a 2結構域（由a 1結構域和a 2結構域形成 的MICA蛋白的部分）。進一步提供了跨MICA等位基因存在的a Ia 2結構域和a 3結構域 上的表位并且可以被抗體以高結合親和力靶向。
[0166] MICA(PERB11. 1)是指MHC I 類多肽相關序列 A (參見例如，UniProtKB/Swiss-Prot Q29983)，其基因和cDNA及其基因產物，或其天然存在的變體。MICA基因和蛋白的命名 法連同參照不同等位基因的序列的登錄號描述于Frigoul (弗里洛爾）A.和Lefranc (勒 弗朗），M-P. Recent Res. Devel. Human Genet.(人類遺傳學的最新研究與進展）， 3(2005) :95-145ISBN:81-7736-244-5中，將其公開內容通過引用結合在此。MICA基因和蛋 白質序列（包括在蛋白質和DNA水平的多態性）還可獲得自由巴赫拉姆博士（Dr. Bahram) 的實驗室維護的 http://mhc_x. u-strasbg. fr/human. htm。
[0167] MICA的氨基酸序列首先被描述于Bahram (巴赫拉姆）等人（1994) Proc. Nat. Acad. Sci.(科學院院刊）91:6259-6263 和 Bahram(巴赫拉姆）等人（1996) Immunogenetics (免疫遺傳學）44:80-81中，將其公開內容通過引用結合在此。MICA基因是 多態的，在其細胞外a 1、a 2以及a 3結構域中展示出多種變體氨基酸的不尋常分布。為 了進一步定義MICA的多態性，Petersdorf (彼得斯多夫）等人（1999)在275個具有常見 和稀有HLA基因型的個體之間檢查了其等位基因。人類MICA的細胞外a 1、a 2以及a 3 結構域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。完整的MICA序列進一步包括具有23個氨 基酸的前導序列連同跨膜結構域和胞質結構域。所選的人類MICA等位基因的細胞外a 1、 a 2以及a 3結構域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。MICA*001的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1中，對應于Genbank登錄號AAB41060。人類MICA等位基因MICA*004的氨基酸序 列示于SEQ ID N02中，對應于Genbank登錄號AAB41063。人類MICA等位基因MICA*007的 氨基酸序列示于SEQ ID NO 3中，對應于Genbank登錄號AAB41066。人類MICA等位基因 MICA*008的氨基酸序列示于SEQ ID NO 4中，對應于Genbank登錄號AAB41067。人類MICA 等位基因MICA*019的氨基酸序列示于SEQ ID NO 5中，對應于Genbank登錄號AAD27008。 人類MICB的氨基酸序列示于SEQ ID NO 6中，對應于Genbank登錄號CAI18747。
[0168] 該MICA基因編碼屬于MhcSF并且屬于IgSF的蛋白質。該蛋白質是跨膜 MHC-I-a -樣（I-a -樣）鏈，該鏈包括三個細胞外結構域-兩個遠端G-樣結構域，G-a -樣 (也被稱為"D1"或" a 1"）和G-a 2-樣（也被稱為"D2"或" a 2"），以及臨近細胞膜的 C-樣-結構域（也被稱為"D3"或" a 3"），以及三個區--連接區、跨膜區及胞質區（標 記是根據頂GT(國際免疫遺傳學信息系統? )的頂GT科學圖表，http://imgt. org以及 LeFranc (勒弗朗）等人In Silico Biology (電子生物學），2005;5:45-60)。包括前導區、 E⑶、TM以及CY結構域的MICA成熟蛋白由360至366個氨基酸組成，差異是由跨膜區中的 微衛星多態性引起的。可以根據任何適合的編號系統（例如，頂GT編號系統）定義a 1、 a 2以及a 3。在一個實施方式中，a 1結構域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置 1至88 ; a 2結構域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置89至181 ;并且a 3結構域 包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置182至274。a 1和a 2結構域各自包括A、B、C 和D鏈、AB、BC和⑶轉角以及螺旋。a 3結構域包括A、B、C、D、E、F和G鏈、BC環、⑶鏈、 DE轉角以及FG環。MICA蛋白的八個潛在糖基化位點被高度糖基化，兩個在a 1中，一個 在a2中并且五個在a3結構域中，包括0-聚糖（連接至絲氨酸或蘇氨酸的N-乙酰乳糖 胺）和/或N-聚糖。雖然MICA在某些細胞中組成性地表達，但是低水平的MICA表達通 常不引起宿主免疫細胞貼附。然而，MICA在迅速增殖的細胞（例如腫瘤細胞）中被上調。 MICA是所有NKG2D配體中被最高度表達的，并且已經跨寬范圍的腫瘤類型被發現（例如 一般癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、前列腺癌、一般血液惡性腫瘤、急 性髓系白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓系白血病以及慢性淋巴細胞白血病）。最近， Tsuboi (坪井）等人（2011) (EMBO J: 1-13)報道0-聚糖分支酶核心2 P -1，6-N-乙酰葡糖 胺轉移酶（C2GnT)在MICA表達腫瘤細胞中是有活性的并且報道來自腫瘤細胞的MICA包含 核心20-聚糖（包括連接至N-乙酰半乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）。
[0169] Bauer(鮑爾）等人 Science(科學）285:727-729, 1999 提供了 MICA 作為 NKG2D 的應激-可誘導的配體的作用。如在此使用，"MICA"是指任何MICA多肽，包括適用于其的 MICA基因或編碼的一種或多種蛋白質任何變體、衍生物或同種型。MICA基因是多態的，在 其細胞外a 1、a 2以及a 3結構域中展示出多種變體氨基酸的不尋常分布。已經針對MICA 多肽（例如MICA)報道了不同等位基因變體，這些中的每一個都被對應的術語涵蓋，包括例 如人類 MICA 多肽 MICA*001、MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*006、MICA*007、MICA*008、 MICA*009,MICA*010,MICA*01UMICA*012,MICA*013,MICA*014,MICA*015,MICA*016,MICA*017, MICA*018,MICA*019,MICA*020,MICA*022,MICA*023,MICA*024,MICA*025,MICA*026,MICA*027, MICA*028、MICA*029、MICA*030、MICA*031、MICA*032、MICA*033、MICA*034、MICA*035、MICA*036、 MICA*037,MICA*038,MICA*039,MICA*040,MICA*04UMICA*042,MICA*043,MICA*044,MICA*045, MICA*046,MICA*047,MICA*048,MICA*049,MICA*050,MICA*05UMICA*052,MICA*053,MICA*054, MICA #055以及MICA#056。還涵蓋與野生型全長MICA分別享有一種或多種生物學特性或功 能，并且享有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸 同一性的任何核酸或蛋白質序列。
[0170] 如在此使用，除非另外說明或與上下文矛盾，否則"hNKG2D"以及術語"NKG2D"、 "疆62-0"、"〇)314"、"01252489￡"、"此服1"、"殺傷細胞類凝集素受體亞家族1(，成員1"或 "KLRK1"是指一種人類殺傷細胞活化受體基因、其cDNA (例如，Genbank登錄號NM_007360) 及其基因產物（Genbank登錄號NP_031386)，或其天然存在的變體。在NK和T細胞中， hNKG2D可以與蛋白質（例如DAPlO (Genbank登錄號AAG29425, AAD50293))形成異源二聚 體或高階復合物。在此歸于hNKG2D的任何活性（例如，細胞激活、抗體識別等）也可以歸 于處于異源二聚體（例如hNKG2D-DAP10)或具有這兩種（和/或其他）組分的高階復合物 形式的hNKG2D。
[0171] 已經確定了與NKG2D復合的MICA的3D結構（參見例如，Li(李）等人，Nat. Immunol.(自然免疫學）2001 ;2:443-451 ;code lhyr，以及在 MGT/3D 結構-DB (Kaas (卡 斯）等人燦(：1.六(^(18 1^8.(核酸研究）2004;32:0208-0210)中）。當]\〇〇六與疆620同源 二聚體復合時，MICAa 2的殘基63至73 (IGMT編號）被順序化，從而添加幾乎兩圈螺旋。 NKG2D的兩個單體同等地有助于與MICA的相互作用，并且每個NKG2D單體中的七個位置與 MICAa 1或a 2螺旋結構域之一相互作用。
[0172] 本發明提供了使用本發明的抗原結合化合物的方法；例如，本發明提供了用于抑 制細胞增殖或活性，用于向細胞遞送分子（例如毒性分子、可檢測的標記物等），用于靶向、 鑒定或純化細胞，用于消耗、殺死或消除細胞，用于減少細胞增殖的方法，該方法包括將細 胞（例如表達MICA多肽的腫瘤細胞）暴露于本發明的結合MICA多肽的抗原結合化合物。 將領會的是，出于本發明的目的，"細胞增殖"是指細胞的生長或增殖的任何方面，例如細胞 生長、細胞分裂、或細胞周期的任何方面。細胞可以在細胞培養物中（體外）或在哺乳動 物中（體內），例如罹患MICA表達病理學的哺乳動物。本發明還提供了一種用于誘導表達 MICA多肽的細胞死亡或抑制表達MICA多肽的細胞的增殖或活性的方法，該方法包括將該 細胞暴露于處于有效誘導該細胞死亡和/或抑制其增殖的量的抗原結合化合物，該抗原結 合化合物結合連接至毒劑的MICA多肽。因此，本發明提供了一種用于治療罹患增生性疾病 以及由表達MICA多肽的細胞的致病性擴增表征的任何病癥的哺乳動物的方法，該方法包 括向該哺乳動物給予藥學有效量的在此披露的抗原結合化合物，例如用于癌癥的治療。
[0173] 定義
[0174] 如在本說明書中所使用，"一個（種）（a或an)"可以意指一個（種）或多個（種）。 如在權利要求（書）中所使用，當與單詞"包括"結合使用時，單詞"一個（種）（a或an)" 可以意指一個（種）或多個（種）而非一個（種）。如在此使用，"另一個（種）"可以意 指至少第二個（種）或更多。
[0175] 在使用"包括"的情況下，這可以優選地被"主要由...組成"，更優選地被 "由...組成"替換。
[0176] 無論何時在該整個說明書內，"增生性疾病的治療"或"腫瘤的治療"或"癌癥的治 療"等參照抗MICA結合劑（例如抗體）而提及，意指：(a)增生性疾病的治療方法，所述方 法包括向需要這樣的治療的溫血動物（尤其是人）給予（用于至少一個治療）抗MICA結 合劑（優選在藥學上可接受的載體材料中），處于允許所述疾病的治療的劑量（治療有效 量），優選處于如在上文和在下文指定為優選的劑量（量）；(b)抗MICA結合劑用于治療增 生性疾病的用途，或抗MICA結合劑用于在所述治療（尤其在人中）使用；(c)抗MICA結合 劑用于生產治療增生性疾病的藥物制劑的用途，使用抗MICA結合劑用于生產治療增生性 疾病的藥物制劑的方法，該方法包括將抗MICA結合劑與藥學上可接受的載體或包括有效 劑量的適合治療增生性疾病的抗MICA結合劑的藥物制劑混合；或（d)根據可允許在該申請 提交的國家取得專利權的主題，a)、b)、和c)的任何組合。
[0177] 如在此使用，術語"癌癥"和"腫瘤"被定義為細胞或組織的新生長，包括不受控制 的并且進行性的增殖。在一個【具體實施方式】中，在自然病程中，癌癥是致命的。在具體定實 施方式中，癌癥是侵入性的、轉移性的、和/或退行發育的（損失了分化和定向至彼此以及 至它們的軸向框架）。
[0178] 如在此使用，術語"活檢"被定義為為了檢查的目的，例如為了建立診斷，從器官移 除組織。活檢類型的實例包括通過應用抽吸，例如通過附接至注射器的針；通過組織片段的 器械移除；通過用適當器械借助內窺鏡移除；通過手術切除，例如全病變的手術切除；等。
[0179] 如在此使用，術語"抗體"是指多克隆的和單克隆的抗體。取決于重鏈中恒定域的 類型，將抗體分為五個主要類別之一 ：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。這些中的若干個被進一 步分為多個小類或同種型，例如1861、1§62、1 §63、1§64、等。示例性免疫球蛋白（抗體）結 構單元包括四聚體。每個四聚體由兩個相同對的多肽鏈組成，每個對具有一個"輕"鏈（約 25kDa)和一個"重"鏈（約50-70kDa)。每個鏈的N端限定了主要負責抗原識別的約100 至110個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈（\)和可變重鏈（V h)分別是指這些輕 鏈和重鏈。對應于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別被稱為" a "、" S "、" e "、" Y " 和" U "。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是熟知的。IgG和/或IgM是本發 明中采用的優選類別的抗體，其中IgG是特別優選的，因為它們是生理學情況下最常見抗 體并且因為它們在實驗室環境下最容易制造。優選地，本發明的抗體是單克隆抗體。特別 優選的抗體是人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體、或另外適合人類的抗體。"抗體"還包括任 何在此描述的抗體的片段或衍生物。
[0180] 術語"特異性結合"是指在競爭性結合測定中，如使用重組形式的蛋白、其中的表 位、抑或在分離的靶細胞表面上存在的天然蛋白進行評價，抗體可以優選地結合至結合配 偶體，例如MICA。競爭性結合測定和用于確定特異性結合的其他方法將在以下進一步描述 并且是本領域熟知的。
[0181] 當抗體被稱為與具體單克隆抗體（例如6E4、20C6或16A8)"競爭"，這是指在使用 重組MICA分子或表面表達的MICA分子的結合測定中，抗體與單克隆抗體競爭。例如，如果 在結合測定中，測試抗體減少了 6E4、20C6或16A8與MICA多肽或MICA表達細胞的結合，那 么該抗體被稱為分別與6E4、20C6或16A8 "競爭"。
[0182] 如在此使用，術語"親和力"是指抗體與表位的結合的強度。由離解常量K d給出抗 體的親和力，定義為[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗體-抗原復合物的摩爾濃度。 [Ab]是未結合抗體的摩爾濃度，并且[Ag]未結合抗原的摩爾濃度。由1/Kd定義親和力常 數1^。在 Harlow(哈洛）等人，Antibodies:A Laboratory Manual (抗體：實驗室手冊）， Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實驗室出版社），Cold Spring Harbor(冷 泉港），N. Y?(紐約州），（1988) ,Coligan(科利根）等人編輯，Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南），Greene Publishing Assoc?(格林出版協會）和Wiley Interscience (威利國際科學），N. Y.(紐約州），（1992,1993)，和 Muller (穆勒），Meth. Enzymol?(酶學方法）92:589-601 (1983)中可以發現用于確定mAbs親和力的優選方法，將 這些參考文獻通過引用完整結合在此。本領域熟知的用于確定mAbs親和力的一個優選并 且標準的方法是使用表面等離子共振（SPR)篩選（例如通過用BIAcore? SPR分析裝置進 行分析）。
[0183] 在本發明的上下文內，"決定子"是指在多肽上相互作用或結合的位點。
[0184]術語"表位"是指抗原決定子，并且是抗原上結合抗體的區或區域。蛋白表位可以 包括在結合中直接涉及的氨基酸殘基連同由特異性抗原結合抗體或肽有效阻斷的氨基酸 殘基，即抗體的"足跡"內的氨基酸殘基。它是可以與例如抗體或受體結合的復合抗原分子 上的最簡單形式的或最小結構的區。表位可以是線性的或構象的/結構的。術語"線性表 位"被定義為氨基酸的線性序列（一級結構）上連續的氨基酸殘基組成的表位。術語"構 象的或結構的表位"被定義為由不是都連續的氨基酸殘基組成的表位，并且因此代表通過 分子折疊（二級、三級和/或四級結構）而變得彼此接近的氨基酸線性序列的分開的部分。 構象表位取決于3維結構。因此，術語'構象的'通常與'結構的'可互換地使用。
[0185] 關于MICA表達細胞，術語"消耗"是指可以殺死、消除、溶解或誘導磁力誒殺死、消 除或溶解，以便負面影響樣品或對象中存在的多個MICA表達細胞的過程、方法、或化合物。
[0186] 根據本發明的"劑"或"化合物"包括小分子、多肽、蛋白、抗體或抗體片段。在本 發明的上下文中，小分子在一個實施方式中是指具有小于1000道爾頓、特別是小于800道 爾頓、更特別是小于500道爾頓的分子量的化學制劑。術語"治療劑"是指具有生物活性的 齊U。術語"抗癌劑"是指具有針對癌細胞的生物活性的劑。
[0187]關于抗體，術語"適合人類的"是指用于例如在此所描述的治療方法，可以在人體 內安全使用的任何抗體、衍生化抗體、或抗體片段。適合人類的抗體包括所有類型的人源化 抗體、嵌合抗體、或完全人類抗體、或其中抗體的至少一部分衍生自人類或另外被修飾的任 何抗體，以便避免當使用天然非人類抗體時通常激起的免疫應答。
[0188] 出于本發明的目的，"人源化抗體"或"人類抗體"是指其中一個或多個人類免疫球 蛋白的恒定或可變結構區與結合區（例如動物免疫球蛋白的CDR)融合的抗體。設計此類 抗體來維持從其衍生結合區的非人類抗體的結合特異性，而且用來避免針對非人類抗體的 免疫反應。可以從已經"工程化"用來響應抗原激發產生特定人類抗體的轉基因小鼠或其他 動物獲得此類抗體（參見例如Green (格林）等人（1994)Nature Genet (自然遺傳）7:13; Lonberg(倫貝格）等人（1"4)Nature(自然）368:856;Taylor(泰勒）等人（1"4) Int Imrnun(國際免疫學）6:579,將它們的完整教授內容通過引用結合在此）。可以通過遺傳的 或染色體的轉染方法連同噬菌體展示技術構建完全人類抗體，所有這些都是本領域已知的 (參見例如McCafTerty (麥考夫迪）等人（1990)Nature (自然）348:552-553)。還可以通 過體外激活B細胞產生人類抗體（參見例如美國專利號5, 567, 610和5, 229, 275,將它們通 過引用以其全文結合在此）。
[0189] "嵌合抗體"是一種抗體分子，其中（a)恒定區或其一部分被改變、替換或交換，這 樣使得抗原結合位點（可變區）連接至不同的或改變的類別、效應子功能和/或種類的恒 定區，或賦予嵌合抗體新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物、等；或 (b)用具有不同的或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換可變區或其一部分。
[0190]術語"Fc結構域"、"Fc部分"、和"Fc區"是指抗體重鏈的C末端片段，例如從人 類Y (gamma)重鏈的約氨基酸（aa) 230至約aa450,或其他類型的抗體重鏈（例如對于 人類抗體是a、6、e和中的它的配對序列或其天然存在的同種異型。除非另外說 明，貫穿本公開內容使用針對免疫球蛋白的普遍接受的Kabat(卡巴）氨基酸編號（參見 Kabat(卡巴）等人（1991)Sequences of Protein of Immunological Interest(具有免疫 性興趣的蛋白序列），第5版，United States Public Health Service (美國公共衛生署）， National Institute of Health(國立衛生研究院），Bethesda(貝塞斯達），馬里蘭州，也 稱為 "Kabat (卡巴）EU"）。
[0191] 術語"抗體依賴的細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"是本領域普遍理解的術語，并 且指細胞介導的反應，其中表達Fc受體（FcR)的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結 合抗體，并且隨后導致靶細胞溶解。介導ADCC的非特異性細胞毒性細胞包括自然殺傷（NK) 細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性細胞、和嗜酸性細胞。
[0192] 術語"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"是本領域普遍理解的術語，并且指在補體存 在下，分子溶解靶的能力。通過補體系統的第一組分結合至與同源抗原復合的分子（例如 抗體）引發了補體激活通路。
[0193] 當提及MICA時，術語"脫落"是指MICA的可溶性細胞外結構域（ECD)片段從表 達MICA的細胞的細胞表面釋放。細胞表面MICA的蛋白酶剪切（例如通過基質金屬蛋白酶 (MMP)(例如ADAMlO和/或ADAM17)的作用），致使ECD片段從細胞表面釋放，可以導致此 類脫落，或者可溶性ECD或其片段可以由替代轉錄物編碼。
[0194] 術語"分離的"、"純化的"或"生物學純的"是指實質上或基本上不含有在其天然 狀態發現時正常伴隨它的組分。典型地使用分析化學技術，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高 效液相色譜法確定純度和同質性。為制劑中存在的超優勢種的蛋白是實質上純化的。
[0195] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白"在此可互換地使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語 應用至其中一個或多個氨基酸殘基是對應的天然存在的氨基酸的人造化學模擬物的氨基 酸聚合物，連同應用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0196] 當引用例如細胞、或核酸、蛋白、或載體使用時，術語"重組"表明該細胞、核酸、蛋 白或載體已經通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白進行修飾，或該細胞衍生自 如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表達在天然（非重組）形式的細胞內未發現的基因 或表達另外異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。
[0197] 如在此使用，術語"NK細胞"是指在非常規免疫中涉及的淋巴細胞亞群。可以借助 某些特征和生物學特性，例如表達特異性表面抗原（包括針對人類NK細胞的⑶56和/或 ⑶16)、在細胞表面上不存在a / 0或Y / S TCR復合物、通過激活特定細胞溶解機構而結合 并且殺死不能表達"自我"MHC/HLA抗原的細胞的能力、殺死腫瘤細胞或表達針對NK活化受 體的配體的患病細胞的能力、以及釋放稱為刺激或抑制免疫應答的細胞因子的蛋白分子的 能力來鑒定NK細胞。使用本領域熟知的方法，任何這些特征和活性可以用于鑒定NK細胞。 術語NK細胞還將涵蓋NK細胞的任何亞群。在本發明的上下文內，"活性"NK細胞是指生物 活性的NK細胞，包括具有溶解靶細胞或增強其他細胞的免疫功能的能力的NK細胞。例如， "活性"NK細胞可以能夠殺死表達針對活化NK受體的配體和/或不能表達NK細胞上的KIR 識別的MHC/HLA抗原的細胞。可以通過本領域已知的不同技術，例如從血樣、細胞單采術、 組織或細胞收集進行分離而獲得NK細胞。對于涉及NK細胞的測定有用的實驗方案可以發 現于Natural Killer Cells Protocols (天然殺傷細胞實驗方案）（Campbell (坎貝爾）KS 和 Colonna (科隆納）M 編輯），Human Press (人類出版社），219-238 頁（2000)。
[0198] 如在此使用，"T細胞"是指在胸腺中成熟的，并且在其細胞表面上展示T細胞受體 等分子的淋巴細胞亞群。可以借助某些特征和生物學特性，例如表達特異性表面抗原（包 括TCR、CD4或CD8)、某些T細胞殺死腫瘤細胞或感染細胞的能力、某些T細胞激活免疫系 統的其他細胞的能力、以及釋放稱為刺激或抑制免疫應答的細胞因子的蛋白分子的能力來 鑒定T細胞。使用本領域熟知的方法，任何這些特征和活性可以用于鑒定T細胞。在本發 明的上下文內，"活性"或"激活的" T細胞或NK細胞是指生物活性的T細胞或NK細胞，更 具體地，是指具有通過例如分泌細胞因子來溶解細胞或刺激免疫應答的能力的T細胞或NK 細胞。可以按多種熟知方法，包括功能測定和基于表達的測定（例如表達細胞因子）中的 任一種檢測活性細胞。
[0199] 在本發明的上下文內，術語"結合"多肽或表位的抗體是指具有特異性和/或親和 力來結合所述決定子的抗體。
[0200] 抗體
[0201] 本發明的抗體是結合跨越不同等位基因的人類MICA的抗體。在一個實施方式中， 抗體結合MICA多肽（抗MICA抗體），而不實質阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如在腫 瘤細胞上表面MICA與效應細胞上表面NKG2D的相互作用）。在另一個實施方式中，抗體結 合MICA多肽（抗MICA抗體）并且抑制MICA與NKG2D的相互作用；優選地，抗體抑制免疫 細胞表面上由sMICA導致的NKG2D下調。在一個實施方式中，抗體結合細胞表面上的MICA 多肽而不實質阻斷MICA從細胞表面（例如腫瘤細胞的細胞表面）脫落。在一個實施方式 中，抗體結合MICA的a 1和/或a 2結構域。在一個實施方式中，抗體結合MICA的a 3結 構域。在一個實施方式中，抗體具有針對人類MICA等位基因*001、*004和*008、任選地另 外*007和/或*019的親和力，任選地其特征在于小于1(T 9M、優選小于KTiqM的KcL
[0202] 在一個實施方式中，對于結合MICA多肽，該抗體與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9和14B4中的任意一個或多個競爭。優選地，對于MICA 多肽上實質上或基本上相同的、或相同的表位或"表位位點"，抗體識別它、結合它、或對其 具有免疫特異性。
[0203] 抗體表位
[0204] 在另一個實施方式中，這些抗體結合與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、 10A7、18E8、10F3、15F9和14B4實質上相同的表位。在另一個實施方式中，這些抗體與以下 項至少部分重疊、或包括其中至少一個殘基：對應于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的殘基1-88、殘基89-181、或殘基182-274的區段。在一個實施方式中，該表位的 所有關鍵殘基是在對應于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的殘基1-88、 殘基89-181、或殘基182-274的區段中。在一個實施方式中，抗體結合橫跨（a) a 1和/或 a 2結構域以及（b) a 3結構域的連接的表位，其中該表位的所有關鍵殘基在對應于包括 SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的殘基1-181 (例如殘基1-88 (任選地1-85) 或89-181(任選地86-181))的區段中。在一個實施方式中，抗體結合包括區段中的1、2、 3、4、5、6、7個或更多個殘基的表位，該區段對應于包括SEQ ID N0:1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的殘基1-88 (任選地1-85)或殘基89-181 (任選地86-181)。優選地，抗體結合 的殘基存在于MICA多肽的表面上，例如細胞表面上表達的MICA多肽中。
[0205] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、6、7個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D23 (參照 SEQ ID NO 1-5中任一個的MICA)。
[0206] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括：
[0207] (a)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：R6和N8;
[0208] (b)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58;
[0209] (c)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：R61和R64 ;
[0210] (d)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82 ;
[0211] (e)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：Q83、K84 ;
[0212] (f)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：E97、H99 ;
[0213] (g)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102;
[0214] (h)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：S103、T104、R105;
[0215] (i)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：Dl 13、El 15 ;
[0216] (j)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：N12UE123;
[0217] (k)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：T124和E126;
[0218] (1)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：H109、YllULl 16;
[0219] (m)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：H109、YllULl 16;
[0220] (n)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：S133、R134、T137 ;或
[0221] (〇)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：M140、N141、R143和 N144 ；
[0222] (p)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225和D226 ;
[0223] (q)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：T227、Q228和Q229;和/ 或
[0224] (r)選自下組的一個或多個殘基，該組由以下各項組成：W230和D232。
[0225] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括（a)至（r)中2、3或4個的任何組 合。
[0226] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54。
[0227] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58、R61和R64。
[0228] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5或6個或更 多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、S133、R134、 T137、M140、N141、R143 和 N144。
[0229] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5或6個或更 多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、Q131、S132、 Q136、M140、N141、R143 和 N144。
[0230] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：￡100、0101川102、5103、1'104、1?105川1213123、1'124和 E126。
[0231] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 E115、L178、R179 和 R180。
[0232] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或 更多個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232。在 一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個或更多個殘基， 該組由以下各項組成：T227、Q228和Q229。
[0233] 在一個實施方式中，抗體結合表位，該表位包括：
[0234] (a)選自下組的1個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82,和選自下組的 1個或更多個殘基，該組由以下各項組成：Q83、K84;
[0235] (b)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116;
[0236] (c)殘基D113,和選自下組的1、2、3或4個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、 Q83、K84;
[0237] (d)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：Q131、S132、Q136;
[0238] (e)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：S133、R134、T137;
[0239] (f)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：M140、N141、R143和N144;
[0240] (g)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116 ;任選地D113 ;和 選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：Q131、S132、Q136;
[0241] (h)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116 ;任選地D113 ;和 選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：S133、R134、T137;
[0242] (i)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116;任選地D113;和 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：M140、N141、R143和N144;
[0243] (j)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116;任選地D113;選 自下組的1、2或3個殘基，該組由以下各項組成：S133、R134、T137;和選自下組的1、2、3或 4個殘基，該組由以下各項組成：M140、N141、R143和N144;
[0244] (k)選自下組的1個或更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8,和選自下組的1、 2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102、S103、T104、R105;
[0245] (1)選自下組的1、2、3或4個殘基，該組由以下各項組成：N121、E123、T124和 E126,和選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105;或
[0246] (m)選自下組的1、2或3個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225和D226;選自 下組的1、2或3個殘基，該組由以下各項組成：T227、Q228和Q229,和選自下組的一個或兩 個殘基，該組由以下各項組成：W230和D232。
[0247] 任選地，本發明的抗體的表位可以完全地在MICA的a 1和/或a 2結構域內。任 選地，另外，這些抗體可以特征為實質上結合MICA脫落所需的a 3結構域區。
[0248] 在一個實施方式中，本發明的抗體結合MICA多肽等位基因*001、*004和*008(以 及任選的另外的*007和*019)的表面上存在的一個或多個氨基酸。
[0249] 可以測量抗MICA抗體結合至MICA突變體轉染的細胞，并且將其與抗MICA抗體結 合野生型MICA多肽（例如SEQ ID NO: 1至5中的任何一個或多個）的能力進行比較。抗 MICA抗體和突變體MICA多肽之間結合的減少意味著存在結合親和力的減少（例如，如通過 已知方法，例如表達具體突變體的細胞的FACS測試，或通過結合突變體多肽的Biacore測 試進行測量），和/或抗MICA抗體的總結合能力減少（例如，如通過抗MICA抗體濃度對比 多肽濃度的圖中的Bmax降低證實）。結合的顯著減少表明當抗MICA抗體結合MICA時，突 變殘基直接涉及結合抗MICA抗體或非常接近結合蛋白。
[0250] 在一些實施方式中，結合的顯著減少意味著相對于抗體和野生型MICA多肽之間 的結合，抗MICA抗體和突變體MICA多肽之間的結合親和力和/或能力減少了大于40%、大 于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于 90%或大于95%。在某些實施方式中，結合減少到低于可檢測極限。在一些實施方式中，當 抗MICA抗體結合突變體MICA多肽小于抗MICA抗體和野生型MICA多肽之間觀察到的結合 的50% (例如小于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)時，證實結合顯著減 少。
[0251] 在一些實施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對突變體MICA多肽的顯著更低 的結合，在該突變體MICA多肽中，對應于野生型MICA多肽（例如包括SEQ ID N0:1至5中 的序列）中的殘基1-88 (任選地1-85)、殘基89-181 (任選地86-181)、或殘基182-274 (或 其子序列）的區段中的殘基被取代為不同的氨基酸。在一些實施方式中，提供了抗MICA抗 體，其展示了對突變體MICA多肽的顯著更低的結合，在該突變體MICA多肽中，對應于野生 型MICA多肽（例如包括SEQ ID NO: 1至5中的序列）中的殘基1-88 (任選地1-85)、殘基 89-181 (任選地86-181)、或殘基182-274(或其子序列）的區段中的殘基被取代為不同的 氨基酸。
[0252] 在一些實施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對突變體MICA多肽的顯著更低 的結合，在該突變體MICA多肽中，與野生型MICA多肽相比，選自下組的殘基被取代為不同 的氨基酸，該組由以下各項組成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D232。
[0253] 在一些實施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對突變體MICA多肽的顯著更低 的結合，在該突變體MICA多肽中：
[0254] (a)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：Q48、W49、E51、 D52、V53 和 L54 ;
[0255] (b)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58、 R61 和 R64 ;
[0256] (c)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0257] (d)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0258] (e)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、 附02、5103、！104、1?105、附21、￡123、1'124和￡126;
[0259] (f)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或
[0260] (g)選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225、 D226、T227、Q228、Q229、W230 和D232 ;
[0261] 與野生型MICA多肽相比，被取代為不同的氨基酸。
[0262] 在一些實施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對突變體MICA多肽的顯著更低 的結合，在該突變體MICA多肽中 ：
[0263] (a)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：R6和N8 ;
[0264] (b)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58 ;
[0265] (c)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：R61和R64 ;
[0266] ⑷選自下組的殘基，該組由以下各項組成：K81、D82 ;
[0267] (e)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：Q83、K84 ;
[0268] (f)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：E97、H99 ;
[0269] (g)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102 ;
[0270] (h)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：S103、T104、R105 ;
[0271] ⑴選自下組的殘基，該組由以下各項組成：D113、E115 ;
[0272] (j)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：N121、E123 ;
[0273] (k)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：T124和E126 ;
[0274] (1)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：H109、Y111、L116 ;
[0275] (m)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：Q131、S132、Q136 ;
[0276] (n)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：S133、R134、T137 ;
[0277] (〇)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：M140、N141、R143和N144 ;
[0278] (p)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：S224、H225和D226 ;
[0279] (q)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：T227、Q228和Q229 ;和/或
[0280] (r)選自下組的殘基，該組由以下各項組成：W230和D232，
[0281] 與野生型MICA多肽相比，被取代為不同的氨基酸。
[0282] 在任一實施方式中，R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、 K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、 L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、 L178、R179、R180、S194、E195、N197、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 或 D232 取 代可以被規定為分別是 R6A、N8A、W14A、Q48A、W49S、E51S、D52A、V53S、L54A、N56A、K57S、 T58A、R61A、R64A、K81A、D82A、Q83A、K84A、E85A、E97A、H99A、E100A、D101S、N102A、S103A、 T104S、R105A、H109A、Y111A、D113A、E115A、L116A、N121A、E123S、T124A、E126A、Q131A、 S132A、S133A、R134S、Q136S、T137A、M140S、N141A、R143S、N144A、L178A、R179S、R180A、 S224A、H225S、D226A、T227A、Q228S、Q229A、W230A 或 D232A 取代。
[0283] 在一些實施方式中，抗MICA抗體特征在于與野生型MICA多肽（除了如實施例4 中所示的具體抗MICA抗體對其具有顯著更低的結合的一個或多個突變體或殘基）相比，對 突變體MICA多肽（例如表D的突變體1-61中的任何一個的突變體）或對具有表D的突變 體1-61中任一個的突變殘基的多肽不展示顯著更低的結合。
[0284] 產生抗MICA抗體
[0285] 可以通過本領域已知的大量技術產生本發明的抗體。典型地，通過用包含MICA多 肽（優選是人類MICA多肽）的免疫原免疫非人類動物（優選是小鼠）來產生它們。MICA 多肽可以包括人類MICA多肽的全長序列，或其片段或衍生物，典型地免疫原片段，即包括 表達MICA多肽的細胞的表面上暴露的表位的多肽的一部分，優選地，由6E4、20C6、16A8、 9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4抗體識別該表位。此類片段典型地包含 成熟多肽序列的至少約7個連續氨基酸，甚至更優選地，包含它的至少約10個連續氨基酸。 片段典型地基本上衍生自受體的細胞外結構域。在一個優選實施方式中，免疫原包含脂膜 中的、典型地在細胞表面上的野生型人MICA多肽。在一個【具體實施方式】中，免疫原包含完 整細胞，特別是完整人類細胞，這些細胞任選地被處理或溶解。在另一個優選實施方式中， 該多肽是重組MICA多肽。在一個【具體實施方式】中，免疫原包含完整腫瘤細胞。
[0286] 可以按本領域熟知的用于刺激小鼠中抗體產生的任何方式進行用抗原免疫非 人類哺乳動物的步驟（參見例如E. Harlow(哈洛）和D. Lane (萊恩），Antibodies:A Laboratory Manual (抗體：實驗室手冊），Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉 港實驗室出版社），Cold Spring Harbor (冷泉港），N. Y.(紐約州），（1988)，將其完整公開 內容通過引用結合在此）。將免疫原懸浮或溶解在緩沖劑中，任選地用佐劑，例如完全或不 完全弗氏佐劑。用于確定免疫原的量、緩沖劑類型和佐劑的量的方法是本領域普通技術人 員熟知的并且不以任何方式限制本發明。對于不同免疫原這些參數可能是不同的，但是都 是容易解釋的。
[0287] 類似地，足以刺激產生抗體的免疫位置和頻率也是本領域熟知的。在典型的免疫 實驗方案中，在第一天用抗原腹膜內注射非人類動物，并且約一周后再注射一次。隨后大約 在第20天進行抗原回憶注射，任選地用佐劑，例如不完全弗氏佐劑。靜脈內進行這些回憶 注射，并且可以重復進行，持續若干個連續天。隨后在第40天進行加強注射，靜脈內注射抑 或腹膜內注射，典型地不用佐劑。該實驗方案導致在約40天后，抗原特異性抗體產生B細 胞的產生。還可以使用其他實驗方案，只要它們導致表達針對免疫中使用的抗原的抗體的 B細胞的產生。
[0288] 對于多克隆抗體制劑，血清獲得自免疫的非人類動物，并且通過熟知的技術分離 其中存在的抗體。可以使用連接至固相支撐體的上述任何免疫原對血清進行親和力純化， 以便獲得與MICA多肽反應的抗體。
[0289] 在一個替代實施方式中，分離來自非免疫的非人類哺乳動物的淋巴細胞，在體外 生長，并且然后暴露于細胞培養物中的免疫原。然后收獲淋巴細胞，并且進行以下描述的融 合步驟。
[0290] 對于優選的單克隆抗體，下一步是從免疫的非人類哺乳動物分離脾細胞，并且隨 后那些脾細胞與無限增殖化細胞融合，以形成產生抗體的雜交瘤。從非人類哺乳動物分離 脾細胞是本領域熟知的，并且典型地涉及從麻醉的非人類哺乳動物移除脾臟，將它切成小 塊并且通過細胞篩的尼龍網將來自脾被膜的脾細胞擠入適當緩沖劑中，以便產生單細胞懸 浮液。洗滌這些細胞，離心并且重新懸浮在溶解任何紅細胞的緩沖劑中。將該溶液再次離 心，并且最終將團塊中的剩余淋巴細胞重新懸浮在新鮮緩沖劑中。
[0291] 一旦分離并且存在于單細胞懸浮液中，可以將淋巴細胞融合進無限增殖細胞系。 這典型地是小鼠骨髓瘤細胞系，雖然對于產生雜交瘤而言有用的許多其他無限增殖細胞系 也是本領域已知的。優選的鼠類骨髓瘤系包括但不局限于衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠 腫瘤的那些（可得自Salk Institute Cell Distribution Center (索爾克研究所細胞分 配中心），San Diego (圣迭戈），美國）和X63Ag8653和SP-2細胞（可得自American Type Culture Collection (美國典型微生物保藏中心），Rockville (羅克維爾），Maryland (馬 里蘭州），美國）。使用聚乙二醇等造成該融合。然后在包含抑制未融合親本骨髓瘤細胞的 生長或存活的一種或多種物質的選擇性培養基中生長生成的雜交瘤。例如，如果親本骨髓 瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基典型 地將包含次黃嘌呤、氨喋呤、和胸苷（HAT培養基），這些物質防止HGPRT缺陷型細胞的生長。
[0292] 典型地在巨噬細胞的飼養層上生長雜交瘤。在平鋪雜交瘤之前，巨噬細胞優 選地來自用于分離脾細胞的非人類哺乳動物的同窩出生仔畜并且典型地用不完全弗 氏佐劑等致敏這些巨噬細胞若干天。融合方法描述于Goding(戈丁）"Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (單克隆抗體：原理和實踐）"，59_103 頁（Academic Press (學術出版社），1986)，將其公開內容通過引用結合在此。
[0293] 允許這些細胞在選擇培養基中生長足夠的時間，以便集落形成和抗體產生。這通 常在約7天和約14天之間。
[0294] 然后針對特異性結合MICA多肽基因產物的抗體的產生測定雜交瘤集落，任選地 由抗體 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4 特異性識別該表 位。該測定典型地是比色ELISA型測定，雖然可以采用能適合生長雜交瘤的孔的任何測定。 其他測定包括放射免疫測定或熒光激活細胞分選術。檢查對于希望的抗體產生呈陽性的 孔，以確定是否存在一個或多個明顯的集落。如果存在多于一個集落，則這些細胞可以重新 克隆并且生長，以確保只有單個細胞已經引起產生希望的抗體的集落。
[0295] 可以在適當培養基，例如DMEM或RPMI-1640中，按更大量逐漸形成確認為產生本 發明的單克隆抗體的雜交瘤。可選地，雜交瘤細胞可以在體內生長為動物中的腹水瘤。
[0296] 在用來產生希望的單克隆抗體的充分生長后，從這些細胞分離走包含單克隆抗 體（或腹水）的生長培養基，并且純化其中存在的單克隆抗體。典型地通過使用蛋白A或 蛋白G瓊脂糖（Sepharose)或連接至固相載體（例如瓊脂糖（agarose或Sepharose)珠 粒）的抗小鼠Ig的凝膠電泳、透析、色譜法實現純化（所有這些都描述于例如Antibody Purification Handbook^ 抗體純化手冊），Biosciences (生物科學），出版號 18-1037-46, AC版中，將其公開內容通過引用結合在此）。典型地通過使用具有含抗體部分的直接中和 作用的低PH緩沖劑（pH 3.0或更小的甘氨酸或乙酸緩沖劑），從蛋白A/G柱洗脫結合的抗 體。按需要，收集、透析并且濃縮這些部分。
[0297] 典型地重新克隆具有單個明顯集落的陽性孔，并且重新測定以確保檢測到并且產 生唯--種單克隆抗體。
[0298] 還可以通過選擇免疫球蛋白組合文庫來產生抗體，如例如披露于（Ward (瓦爾德） 等人，Nature (自然），341 (1989) 544頁，將其完整公開內容通過引用結合在此）。
[0299]結合 MICA，特別是結合與單克隆抗體 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、 18E8、10F3、15F9或14B4實質上或基本上相同的表位的一種或多種抗體的鑒定會是使用其 中可以評價抗體競爭的大量免疫篩選測定中的任意一種容易地確定的。許多此類測定是常 規實踐的并且是本領域熟知的（參見例如美國專利號5, 660, 827,1997年8月26日發布， 將其通過引用確切地結合在此）。將理解，鑒定結合與在此所述的單克隆抗體相同或實質上 相同的表位的抗體不以任何方式需要實際確定在此所述的抗體結合的表位。
[0300] 例如，當待檢查的抗體獲得自不同來源動物，或甚至具有不同Ig同種型時，可以 采用簡單的競爭測定，其中對照抗體（例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、 10F3、15F9或14B4)和測試抗體經過混合（或預吸收）并且應用至含MICA多肽樣品。基于 蛋白質印跡法和BIAC0RE分析的使用的實驗方案是適合用于此類競爭研究的。
[0301] 在某些實施方式中，在應用至MICA抗原樣品之前，將對照抗體（例如6E4、20C6或 16A8)與不同量的測試抗體預混合（例如約1:10或約1:100) -個時段。在其他實施方 式中，可以在暴露于MICA抗原樣品期間，將對照抗體與不同量的測試抗體簡單混合。只要 可以區別來自游離抗體的結合（例如通過使用分離或洗滌技術以消除未結合抗體）和來 自測試抗體的6E4、20C6或16A8 (例如通過使用物種特異性或同種型特異性二抗或通過用 可檢測標記特異性標記6E4、20C6或16A8)，就可以確定測試抗體是否減少了 6E4、20C6或 16A8與抗原的結合，指示測試抗體識別與6E4、20C6或16A8實質上相同的表位。在不存在 完全無關的抗體的情況下，（標記的）對照抗體的結合可以用作對照高值。可以通過將標 記的（6E4、20C6或16A8)抗體與嚴格相同類型的未標記抗體（6E4、20C6或16A8) -起溫 育而獲得對照低值，其中將發生競爭并且減少標記抗體的結合。在測試測定中，在測試抗 體存在下，標記抗體反應性的顯著減少是識別實質上相同的表位的測試抗體（即與標記的 (6E4、20C6或16A8)抗體"交叉反應"或競爭的測試抗體）的指征。減少6E4、20C6或16A8 與MICA抗原的結合至少約50% (例如至少約60%、或更優選至少約80%或90% (例如約 65% -100% ))的、處于約1:10和約1:100之間的6E4、20C6或16A8 :測試抗體的任何比 率的任何測試抗體被認為是結合與6E4、20C6或16A8實質上相同的表位或決定子的抗體。 優選地，此類測試抗體將減少6E4、20C6或16A8與MICA抗原的結合至少約90% (例如約 95% ) 〇
[0302] 還可以通過例如流式細胞術測試評價競爭。在這樣的測試中，例如可以首先將攜 帶給定MICA多肽的細胞與6E4、20C6或16A8 -起溫育，并且然后與用熒光染料或生物素標 記的測試抗體一起溫育。如果當與飽和量的6E4、20C6或16A8預溫育時獲得的結合是用不 與6E4、20C6或16A8 -起預溫育的抗體所獲得的結合（如借助熒光測量）的約80%、優選 約50%、約40%或更少（例如約30%、20%或10% )，則該抗體被稱為與6E4、20C6或16A8 競爭。可選地，如果用與飽和量的測試抗體一起預溫育的細胞上的標記的6E4、20C6或16A8 抗體所獲得的結合是不與測試抗體預溫育所獲得的結合的約80%、優選約50%、約40%、 或更少（例如約30%、20%、或10%)，則抗體被稱為與6￡4、2006或1648競爭。
[0303] 還可以采用其中測試抗體被預吸收并且以飽和濃度被應用至其上固定MICA抗原 的表面上的簡單的競爭測定。簡單的競爭測定中的表面優選是BIACORE芯片（或適合表面 等離子共振分析的其他介質）。然后以MICA飽和濃度使對照抗體（例如6E4、20C6或16A8) 與該表面接觸，并且測量對照抗體的MICA和表面的結合。將對照抗體的結合與不存在測 試抗體時對照抗體與含MICA表面的結合進行比較。在測試測定中，在存在測試抗體時，用 對照抗體的含MICA表面的結合的顯著減少指示測試抗體識別與對照抗體實質上相同的表 位，這樣使得測試抗體與對照抗體"交叉反應"。減少對照抗體（例如6E4、20C6或16A8)與 MICA抗原的結合至少約30%或更多、優選約40%的任何測試抗體可以被認為是結合與對 照抗體（例如6E4、20C6或16A8)實質上相同的表位或決定子的抗體。優選地，這樣的測試 抗體將減少對照抗體（例如6E4、20C6或16A8)與MICA抗原的結合至少約50% (例如至少 約60%、至少約70%、或更多）。將理解，在競爭測定中，對照抗體和測試抗體的順序可以顛 倒：即對照抗體可以首先結合該表面并且此后使測試抗體與該表面接觸。優選地，對MICA 抗原具有更高親和力的抗體首先結合該表面，因為將預期對第二抗體所見的結合下降（假 定這些抗體是交叉反應的）將具有更大幅值。在例如Saunal (薩納爾）（1995) J. Immunol. Meth〇ds(免疫方法期刊）183:33-41中提供了此類測定的另外實例，將其公開內容通過引 用結合在此。
[0304] 優選地，識別MICA表位的單克隆抗體將與按相當大的百分比的或甚至所有的相 關MICA等位基因上存在的表位反應。在一個方面，本發明的抗MICA抗體結合MICA*004和 *008,任選地另外的 MICA*001、*007 和 / 或 *0019。
[0305] 在優選實施方式中，抗體將結合來自患有特征在于MICA陽性細胞的表達的疾病 的一個或多個的個體（即是使用本發明的抗MICA抗體用在此所述的方法之一治療的候選 人的個體）的MICA表達細胞。因此，一旦獲得特異性識別細胞上的MICA的抗體，可以測試 它結合MICA陽性細胞（例如癌細胞）的能力。具體地，在用本發明的抗體之一治療患者之 前，測試該抗體結合取自患者的惡性細胞（例如在血樣或腫瘤活檢中）的能力將是有益的， 以最大化在患者中將是有益的治療的可能性。
[0306] 在一個實施方式中，本發明的抗體是在用來測試它們結合MICA表達細胞（例如惡 性細胞）的能力的免疫測定中驗證的。例如，進行腫瘤活檢并且收集腫瘤細胞。然后使用 本領域普通技術人員熟知的標準方法評價給定抗體結合細胞的能力。發現結合來自顯著百 分比的個體或患者（例如5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多）的相當大的部分（例 如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多）的已知表達[04的細胞（例如腫瘤細 胞）的抗體適合用于本發明，都出于診斷目的，以確定患者中惡性細胞的存在或水平，或適 合用于在此所述的治療方法，例如適合用于增加或減少惡性細胞個數或活性。為了評價抗 體與細胞的結合，直接抑或間接標記這些抗體。當間接標記時，典型地添加第二標記抗體。
[0307] 可以按本領域普通技術人員已知的方式進行抗體結合是否在表位區內的測定。作 為此類作圖/表征方法的一個實例，可以通過使用MICA蛋白中暴露的氨基/羧基的化學 修飾的表位"足跡法"確定抗MICA抗體的表位區。這種足跡法技術的一個具體實例是使 用HXMS (通過質譜法檢測氫-氘交換），其中發生受體和配體蛋白酰胺部分的氫/氘交換、 結合、和回交換，其中參與蛋白結合的主鏈酰胺基團被保護免受回交換并且因此將保留氘 化。可以通過消化性蛋白水解、快速微內徑高效液相色譜分離、和/或電噴霧離子化質譜 法在這一點上鑒定相關區。參見例如Ehring(埃林）H，分析生物化學，卷267 (2) 252-259 頁（1999)￡叩611(恩金），]\1?和3111；[1:11(史密斯），0丄.（2001)六仙1.016111.(分析化學）73, 256A-265A。適合的表位鑒定技術的另一個實例是核磁共振表位作圖（NMR)，其中 典型地，對在游離抗原和與抗原結合肽（例如抗體）復合的抗原的二維NMR圖譜中的信號 的位置進行比較。典型地用15N選擇性地同位素標記抗原，這樣使得在NMR圖譜中只看見 對應于抗原的信號并且沒有來自抗原結合肽的信號。與游離抗原的圖譜相比，源自與抗 原結合肽相互作用所涉及氨基酸的抗原信號典型地在復合物的圖譜中移位，并且可以按 此方式鑒定結合所涉及的氨基酸。參見例如Ernst Schering Res Found Workshop(厄 恩斯特先靈德雅研究基金會研討會）2004 ; (44) :149-67 ;Huang(黃）等人，Journal of Molecular Biology (分子生物學雜志），卷 281 (1)61-67 頁（1988);以及 Saito (齊藤）和 Patterson (帕特森），Methods (方法），1996 年 6 月；9 (3) : 516-24。
[0308]還可以使用質譜法方法進行表位作圖/表征。參見例如Downard(道爾德），J Mass Spectrom(質譜法雜志）2000 年 4 月；35 (4) : 493-503 以及Kiselar (奎萊爾）和 Downard (道 爾德），Anal Chem.(分析化學1999年5月1 ;1 ;71 (9) : 1792-1801。在表位作圖和鑒定的 背景下，蛋白酶消化技術也會是有用的。可以通過蛋白酶消化，例如通過在PH 7-8使用按 與MICA約1:50的比率使用胰蛋白酶或o/n消化，隨后是用于肽鑒定的質譜法（MS)分析， 確定抗原決定子相關區/序列。可以隨后通過比較經受胰蛋白酶消化的樣品和與抗體一起 溫育并且然后經受例如胰蛋白酶消化的樣品，鑒定受抗MICA結合劑保護免受胰蛋白酶切 割的肽（由此揭示該結合劑的足跡）。而且或可選地，其他酶，像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等 可以用于類似表位表征方法。此外，酶消化可以提供用于分析潛在抗原決定子序列是否在 未表面暴露的并且因此在免疫原性/抗原性方面最可能不相關的MICA多肽的一個區內的 快速方法。
[0309] 定點誘變是對解釋結合表位有用的另一技術。例如，在"丙氨酸掃描"中，蛋白 區段內的每個殘基都被替換為丙氨酸殘基，并且測量結合親和力的結果。如果突變導致 結合親和力顯著減少，則它最可能涉及結合。特異性針對結構表位的單克隆抗體（即并 不結合未折疊蛋白的抗體）可以用于驗證丙氨酸替換并不影響蛋白的整體折疊。參見例 如 Clackson(克拉克森）和 Wells(韋爾斯），Science(科學）1995 ;267:383-386 ;以及 Wells (韋爾斯），Proc Natl Acad Sci USA (美國國家科學院院刊）1996;93:1-6。
[0310] 電子顯微鏡還可以用于表位"足跡法"。例如，Wang(王）等人，Nature (自然）1992 ; 355:275-278使用冷凍電子顯微鏡術、三維圖象重構、和X射線結晶學的配合應用來確定在 天然豇豆花葉病毒的衣殼表面上的Fab片段的物理足跡。
[0311] 用于表位評估的其他形式的"無標記"測定包括表面細胞質基因組反響（SPR， BIAC0RE)和反射干涉頻譜法（RifS)。參見例如Fagcrstam(法格爾斯塔姆）等人， Journal Of Molecular Recognition(分子識別雜志）1990 ;3:208_14;Nice(耐斯）等 人，J.Chroma-togr.(色譜法雜志）1993;646:159-168 ;Leipert (萊佩特）等人，Angew. Chem. Int. Ed. (Angewandte Chemie International Edition (應用化學國際版）1998 ; 37:33〇8_3311 ;K丨'6ger (克羅格爾）等人，Biosensors and Bioelectronics(生物傳感器 和生物電子學）2002;17:937-944。
[0312] 還應注意到，可以在本文所述的一種或多種示例性競爭測定鑒定結合與本發明的 抗體相同的或實質上相同的表位的抗體。
[0313] 在脊椎動物或細胞中免疫接種并且產生抗體時，可以進行具體的選擇步驟來分離 要求保護的抗體。在此方面，在一個【具體實施方式】中，本發明還涉及產生此類抗體的方法， 該方法包括：(a)用包含MICA多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；以及（b)制備來自所述 免疫動物的抗體；以及（c)選擇能夠結合MICA的來自步驟（b)的抗體。
[0314] 典型地，由本發明提供的抗MICA抗體具有在約IO4至約IO 11ITi (例如約IO8至約 IOkT1)的范圍中的對MICA多肽的親和力。例如，在一個具體方面中，如通過例如表面細胞 質基因組反響（SPR)篩選（例如通過用BIAcore? SPR分析裝置進行分析）所確定，本發明 提供了具有關于MICA的小于lx KT9M的平均解離常數（Kd)的抗MICA抗體。在一個更具 體的示例性方面中，本發明提供了具有對MICA的約lx KT8M至約lxKTkiI^或約lx KT9M 至約lx KT11M的KD的抗MICA抗體。
[0315] 例如可以用不大于約（即親和力好于）100、60、10、5、或1納摩爾，優選亞納摩爾或 任選地不大于約500、200、100或10皮摩爾的平均KD表征抗體。例如可以通過在芯片表面 上固定重組產生的人類MICA蛋白，隨后應用溶液中的待測試抗體，確定KD。在一個實施方 式中，該方法進一步包括步驟（d)，選擇對于結合MICA，能夠與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19￡9、12八10、1(^7、18￡8、1(^3、15?9或1484競爭的來自〇3)的抗體。
[0316] 在任何實施方式的一個方面中，根據本發明的方法制備的抗體是單克隆抗體。 在另一個方面中，用于產生根據本發明的方法的抗體的非人類動物是哺乳動物，例如嚙 齒動物、牛、豬、禽類、馬、兔、山羊、或綿羊。本發明的抗體涵蓋6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4。額外地，本發明的抗體可以任選地被指定 為除了在Salih(薩利赫）等人（2003) (Blood(血液）102(4) :1389-1396)中描述的抗體 BAMOl 或 BAM03,在 Groh(格羅）等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci USA(美國國家科學院 院刊）93:12445-12450、Groh (格羅）等人（1998) Science (科學）279:1737-1740 或 WO 2008/131406中描述的抗體2C10、3H5、6D4或6G6(這些參考文獻中的每一個的公開內容通 過引用結合在此），或以上內容的衍生物，例如完整或部分地包括這些CDR或抗原結合區的 衍生物中的任一種的抗體。
[0317] 根據本發明的替代實施方式，從本發明的雜交瘤中分離編碼結合存在于MICA多 肽上的表位的抗體的DNA，并且將其放入用于轉染進適當宿主的適當表達載體中。然后將宿 主用于重組產生抗體、或其變體，例如單克隆抗體的人源化版本、抗體的活性片段、包含抗 體的抗原識別部分的嵌合抗體、或包含可檢測部分的版本。
[0318] 可任意容易地分離編碼本發明的單克隆抗體，例如抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4的DNA，并且使用常規程序（例如通過使用能夠 特異性結合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的寡核苷酸探針）對其進行測序。一旦分離，可以將 DNA放入表達載體，然后將這些表達載體轉染進不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞，例如大 腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，以獲得重組宿主細胞中 單克隆抗體的合成。如在本說明書的其他地方所述，此類DNA序列可以被修飾用于大量目 的中的任一個，例如用于人源化抗體，產生片段或衍生物，或用于修飾抗體序列（例如在抗 原結合位點中），以優化抗體的結合特異性。在一個實施方式中，本發明包括編碼抗體（例 如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4)的輕鏈和 / 或重鏈的 分離的核酸序列，連同包含此類核酸（例如在其基因組中）的重組宿主細胞。
[0319] 編碼抗體的DNA的細菌中重組表達是本領域熟知的（參見例如Skerra(斯凱拉） 等人，Curr. Opinion in Immunol.(免疫學當前觀點），5, 256 頁（1993);以及Pluckthun (普 呂克通），Immunol.(免疫學）13〇, I5I 頁（I"2)。
[0320] 評價活性
[0321] 一旦獲得抗原結合化合物，將通常評價它阻斷NKG2D和MICA (例如sMICA或膜結 合MICA)之間的相互作用、阻斷MICA從細胞脫落、抑制sMICA誘導的NKG2D下調、導致MICA 表達細胞的死亡、誘導ADCC或CDC指向、和/或抑制MICA表達靶細胞的增殖和/或導致它 們的消除的能力。
[0322] 可以在本方法的任何適合的階段進行抗原結合化合物的減少MICA和NKG2D之間 的結合或阻斷它們之間的相互作用的能力的評價，例如，如在此提供的實例中。例如，可以 使在它們的表面上表達MICA的腫瘤細胞與在它們的表面上表達NKG2D的細胞（例如效應 細胞）接觸，其中添加或不添加候選抗MICA抗體。可以評價MICA表達細胞和NKG2D表達 細胞之間的結合，并且選擇并不減少結合的抗體。另一種可能性涉及使分離的MICA多肽 與分離的NKG2D多肽接觸，或與在其表面上表達NKG2D多肽的細胞接觸，并且評價MICA和 NKG2D多肽或表達NKG2D的細胞之間的結合。另一種可能性涉及使分離的NKG2D多肽與在 其表面上表達MICA多肽的細胞接觸，并且評價MICA多肽或表達MICA的細胞之間的結合。
[0323] 例如，為了確定一種劑是否阻斷MICA與NKG2D的相互作用，進行以下測試：在增 加濃度的測試抗MICA mAb存在或不存在下，將用MICA轉染的細胞系ClR或RMA與可溶性 NKG2D-FC融合蛋白一起溫育。洗滌這些細胞，然后與識別NKG2D-FC融合蛋白的Fc部分的 二抗一起溫育，再次洗漆，并且在流式細胞儀（FACScalibur，Beckton Dickinson公司）上 用標準方法進行分析。當不存在抗MICA mAb時，NKG2D-FC蛋白很好地結合ClR或RMA細 胞。在阻斷MICA與NKG2D結合的抗MICA mAb存在時，存在NKG2D-FC與細胞的結合的減少。
[0324] 優選地，還可以通過評價抗MICA抗體對NKG2D表達細胞（例如NK或T細胞）的 功能的影響，進行抗原結合化合物的減少MICA和NKG2D之間的結合或阻斷它們之間的相互 作用的能力的評價。優選地，使用表達NKG2D而不表達CD16的NK細胞或T細胞，以便避 免⑶16介導的ADCC作用的任何貢獻。如果抗MICA抗體減少或阻斷了 MICA-NKG2D相互作 用，則它將被預期用于抑制NKG2D介導的NK細胞或T細胞的激活。因此，并不減少MICA和 NKG2D之間的結合或阻斷它們之間的相互作用的抗體將不實質上減少或阻斷NKG2D介導的 NK細胞或T細胞的激活。可以通過典型的細胞毒性測定對此進行評估，本文描述了它的實 例。可以使用多種基于細胞的測定中的任一種來評價NKG2D活性，這些測定包括基于基因 表達的測定，基于細胞毒性的測定，以及增殖測定。在一個方面中，體外測定將使用來自人 類患者的NK細胞或T細胞，例如用NKG2D編碼轉基因轉染的T細胞系，只要受體的表達以 可檢測方式改變細胞活性，例如使它們被NKG2D配體可激活。反映NKG2D活性的任何適合 的生理學變化可以用于評價測試化合物或抗體的功用。例如，可以測量大量作用，例如基 因表達、細胞因子產生、細胞生長、細胞增殖、pH、細胞內第二信使（例如Ca2+、IP3、cGMP、 或cAMP)、活性（例如細胞毒性活性）或激活其他T細胞的能力中的變化。在一個實施方 式中，可以通過檢測疆620響應基因（例如^25、正^￥、或1即-〇)的表達來評價受體 的活性（參見例如Groh(格羅）等人（2003)PNAS(美國國家科學院院刊）100:9452-9457 ; Andr6 (安德烈）等人（2004) Eur. J. Immunol (歐洲免疫學雜志）34:1-11)。在一個實施方 式中，通過在MICA表達細胞和抗MICA抗體存在下溫育NKG2D+T細胞或NK細胞評價NKG2D 活性，并且評價化合物或測試抗體抑制由T細胞或NK細胞釋放TNF- a或IFN- Y的能力。
[0325] 在本文的實施例中也描述了示例性細胞毒測定，其中評價了 NKG2D介導的靶細胞 的殺滅。在此，通過測量51Cr的靶細胞釋放，抗MICA抗體減少或抑制NKG2D+CD16-NK92 細胞的能力被用于評價NK細胞介導的MICA*019轉染的BaF/3的殺滅。通過本領域熟 知的標準方法進行體外細胞毒性測定，例如，如在Coligan(科利根）等人編輯，Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南），Greene Publishing Assoc.(格林出版協 會）和Wiley Interscience (威利國際科學），N. Y.(紐約州），（1992,1993)中所述。在添 加NK細胞之前用51Cr標記MICA表達靶細胞，然后殺滅被估計為與由于殺滅的結果的從細 胞至培養基的 51Cr的釋放成比例。減少MICA和NKG2D之間的結合或阻斷它們之間的相互 作用的劑的添加導致防止了經由NKG2D的活化信號傳遞的引發和蔓延。因此，此類劑的添 加導致靶細胞的NK介導的殺滅減少。
[0326] 不減少或阻斷通過NKG2D的細胞激活（例如細胞因子產生、細胞生長、細胞增殖、 pH、細胞內第二信使、NK介導的MICA表達細胞的殺滅）的抗原結合化合物（例如不減少或 減少小于5%、10%、20%或30%)被稱為"非阻斷"11^13。減少或阻斷通過^?20的細胞激 活的抗原結合化合物被稱為"阻斷" mAb。
[0327] 可以在本方法的任何適合的階段進行抗原結合化合物的阻斷MICA從MICA表達 細胞的脫落的能力的評價，例如，如在此提供的實例中。在一個實例中，提供了細胞樣品并 且使用ELISA方法檢測可溶性細胞外MICA。在一個實例中，將本發明的抗原結合化合物 給予哺乳動物，并且測量循環sMICA的存在或不存在或其水平。體外檢測的實例描述于 Nolting(諾爾廷）等人（2010)Virology(病毒學）406(1) : 12-20中。簡要地，可以使用可 商購的MICAELISA藥盒（Bamomab，慕尼黑，德國）。用PBS中的按2iig/ml的捕獲抗MICA mAb BAM0-1將平板涂覆過夜，然后通過添加100 ill的15% BSA在37°C封閉2h并且洗滌。 添加標準物和樣品并且將平板在37°C溫育2h。洗滌平板并且添加在7. 5% BSA-PBS中的按 5 y g/ml的檢測mAb BAM0-3,在37°C持續2h。然后洗滌平板并且添加抗小鼠IgG2a-HRP (在 7. 5% BSA-PBS中1:8000)，在37°C持續lh。然后洗滌平板并且使用過氧化物酶底物系統 (KPL公司，Gaithersburg (蓋瑟斯堡），馬里蘭州）進行顯影。在450nm測量吸光度。
[0328] 可以在本方法的任何適合的階段進行抗原結合化合物誘導ADCC、CDC或另外（例 如通過遞送毒劑）導致MICC表達靶細胞的活性的消除或抑制的能力的評價，例如，如本文 提供的實施例中。這一評價在為了治療用途涉及的抗體（或其他化合物）的鑒定、產生和 /或開發中涉及的不同步驟中的一個或多個上會是有用的。例如，可以在用來鑒定候選抗 原結合化合物的篩選方法的背景下，或者在其中將抗原結合化合物選擇并制造為適合人類 (例如在抗體的情況下制成嵌合抗體或人源化抗體）的方法中評價活性，其中已經獲得表 達抗原結合化合物的細胞（例如表達重組抗原結合化合物的宿主細胞），并且評價它產生 功能抗體（或其他化合物）的能力，和/或其中已經產生一些抗原結合化合物，并且要評價 其活性（例如至測試批次或大量產品）。通常將已知抗原結合化合物特異性結合MICA多 肽。該步驟可以涉及測試多個（例如使用高通量篩選方法的非常大量的或更小量的）抗原 結合化合物。
[0329] 可以通過包括本文的實驗實施例中所述的那些的不同測定來確定可以進行CDC 和ADCC的測試。典型地，測試ADCC涉及評價細胞介導的細胞毒性，其中由效應細胞（例如 攜帶Fc受體的白細胞）識別具有結合的抗MICA抗體的MICA表達靶細胞（例如癌細胞或 其他MICA表達細胞），而不涉及補體。任選地可以使用不表達MICA抗原的細胞作為對照。 通過測量細胞因子產生（例如IFN-Y產生）或細胞毒性標記物（例如CD107轉移）中的 增加來評價NK細胞的細胞毒性的激活。優選地，與對照抗體（例如不結合MICA的抗體、具 有鼠恒定區的MICA抗體）相比，在靶細胞（例如MICA表達細胞）存在下，本發明的抗體 將誘導至少20 %、50 %、80 %、100 %、200 %或500 %的細胞因子產生、細胞毒性標記物的表 達、或靶細胞溶解中的增加。在另一個實例中，例如在鉻釋放測定中，檢測到靶細胞溶解，優 選地，本發明的抗體將誘導至少10 %、20 %、30 %、40 %或50 %的靶細胞的溶解。
[0330] 抗體CDR序列
[0331]抗體 6E4
[0332] 抗體6E4的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 7,輕鏈可變區的氨基酸 序列被列出為SEQ ID N0:8。融合進人類鏈恒定區（分別是重鏈和輕鏈）的抗體6E4的重 鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID N0:9和10。在一個具體實施 方式中，本發明提供了結合與單克隆抗體6E4基本上相同的表位或決定子的抗體，任選地 該抗體包括抗體6E4的抗原結合區。在本文的任何實施方式中，抗體6E4可以特征在于它 的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括6E4 的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括6E4的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方 式，該單克隆抗體包括6E4的重鏈可變區的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆 抗體進一步包括6E4的可變輕鏈可變區，或6E4的輕鏈可變區的CDR中的一個、兩個或三 個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五 個或更多個氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和 /或重鏈可變區中的任一個包括抗體6E4的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人 類IgG型的免疫球蛋白恒定區，任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0333] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 11-13中列出的氨基酸序列SYYAMS、GFTFSY或 GFTFSYYAMS，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 14-15 中列出的氨基酸序列TISRGGNYIYYIDSVKG或TISRGGNYIY，或它們的至少4、5、6、7、8、9或 10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸； HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 16中列出的氨基酸序列ISDYDGAWLAY，或它的 至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取 代為不同的氨基酸；IXDRl區，該IXDRl區包括如在SEQ ID NO: 17中列出的氨基酸序列 RSSQSIIHTNGNTYLE，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區，該IXDR2區包括如在SEQ ID NO: 18 列出的氨基酸序列KISNRFS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這 些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；LCDR3區，該LCDR3區包括如在SEQ ID NO: 19中列出的氨基酸序列FQGSHVPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的 序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0334] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0335] (a) SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代 為不同的氨基酸；和/或
[0336] (b)SEQ ID N0:8的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代 為不同的氨基酸；和/或
[0337] (c)SEQ ID N0:7的重鏈可變區，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQ ID N0:8的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被 取代為不同的氨基酸；和/或
[0338] (d)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2)氨基酸序 列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0339] (6)如5已0 10勵：17、18和19中所示的輕鏈〇)1?1、2和3(1〇)1?1、1〇)1?2、1〇)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0340] (f)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:17、18和19中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0341] (g)與具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的重鏈可變區，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不 同的氨基酸；和/或
[0342] (h)與具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的輕鏈可變區，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不 同的氨基酸。
[0343] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0344] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0345] 抗體 20C6
[0346] 抗體20C6的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 20,輕鏈可變區的氨基 酸序列被列出為SEQ ID N0:21。融合進重鏈恒定區（分別是重鏈和輕鏈）的抗體20C6的 重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID N0:22和23。在一個具體實 施方式中，本發明提供了結合與單克隆抗體20C6基本上相同的表位或決定子的抗體，任選 地該抗體包括抗體20C6的抗原結合區。在本文的任何實施方式中，抗體20C6可以特征在 于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括 20C6的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括20C6的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個 實施方式，該單克隆抗體包括20C6的重鏈可變區的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該 單克隆抗體進一步包括20C6的可變輕鏈可變區，或20C6的輕鏈可變區的CDR中的一個、兩 個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四 個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可 變區和/或重鏈可變區中的任一個包括抗體16A8的抗原結合區的一部分或全部的抗體被 融合進IgG型的免疫球蛋白恒定區，任選地是人類恒定區，任選地是IgGl或IgG3同種型。
[0347] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID N0:24-26中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 27-28中列出的氨基酸序列HIffffDDDKYYNPSLK或HIWWDDDK，或它們的至少4、5、6、7、8、9 或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸； HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 29中列出的氨基酸序列RTQGYFDY，或它的至少4、 5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同 的氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID N0:30中列出的氨基酸序列RASQSISDYLH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID N0:31列出的氨基酸序列 YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID NO:32中列出的 氨基酸序列QNGHSFPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸，或其中該序列可以包括一個或多個 氨基酸的插入。
[0348] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0349] (a) SEQ ID NO: 20的重鏈可變區，其中⑶R中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可 以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0350] (b)SEQIDNO: 21的輕鏈可變區，其中⑶R中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可 以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0351] (c)SEQIDN0:20的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:21的輕鏈可變區，其中一個或多個氨基酸可以被取代為不同 的氨基酸；和/或
[0352] (d)如 SEQ ID N0:24-29 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0353] (e)如 SEQ ID N0:30、31 和 32 中所示的輕鏈 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0354] (f)如 SEQ ID N0:24 至 29 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:30、31和32中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0355] (g)與具有SEQIDN0:20的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0356] (h)與具有SEQIDN0:21的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0357] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0358] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0359]抗體16A8
[0360] 抗體16A8的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 33,輕鏈可變區的氨基 酸序列被列出為SEQ ID NO:34。融合進重鏈恒定區（分別是重鏈和輕鏈）的抗體16A8的 重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID NO:35和36。在一個具體實 施方式中，本發明提供了結合與單克隆抗體16A8基本上相同的表位或決定子的抗體；任選 地該抗體包括抗體16A8的抗原結合區。在本文的任何實施方式中，抗體16A8可以特征在 于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括 16A8的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括16A8的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個 實施方式，該單克隆抗體包括16A8的重鏈可變區的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該 單克隆抗體進一步包括16A8的可變輕鏈可變區，或16A8的輕鏈可變區的CDR中的一個、兩 個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四 個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可 變區和/或重鏈可變區中的任一個包括抗體16A8的抗原結合區的一部分或全部的抗體被 融合進IgG型的免疫球蛋白恒定區，任選地是人類恒定區，任選地是IgGl或IgG3同種型。
[0361] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 37-39中列出的氨基酸序列RYAMS、GFTFSR或 GFTFSRYAMS，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO:40-41 中列出的氨基酸序列TIFSGGSYTYYPDSV或TIFSGGSY，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連 續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3區， 該HCDR3區包括如在SEQ ID N0:42中列出的氨基酸序列PNWERTFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基 酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID N0:43中列出的氨基酸序列KSSQSLLNSSNQKNYL， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID NO:44列出的氨基酸序列 FASTRES，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID N0:45中列出的 氨基酸序列QQHYSTPPT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸，或其中該序列可以包括一個或多個 氨基酸的插入。
[0362] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0363] (a) SEQ ID NO: 33的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0364] (b) SEQ ID NO: 34的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0365] (c)SEQIDN0:33的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:34的輕鏈可變區，其中一個或多個氨基酸可以被取代為不同 的氨基酸；和/或
[0366] (d)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0367] (6)如5￡〇10勵:43、44和45中所示的輕鏈0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0368] (f)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如 5已〇10勵:43、44和45中所示的輕鏈0?1、2和3仏0)1?1、^：01?2、^：01?3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0369] (g)與具有SEQIDN0:33的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0370] (h)與具有SEQIDN0:34的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0371] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的CDR1、2和3中的任一個可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0372] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0373]抗體19E9
[0374] 抗體19E9的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQIDNO: 46,輕鏈可變區的氨基 酸序列被列出為SEQIDNO:47。
[0375] 在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆抗體19E9基本上相同的表 位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體19E9的抗原結合區。在本文的任何實施方式 中，抗體19E9可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個優選實施方 式中，該單克隆抗體包括19E9的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括19E9的重鏈可變區 的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括19E9的重鏈可變區的三個⑶R。還 提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括19E9的可變輕鏈可變區，或19E9的輕鏈 可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個或多個可 以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選 地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括抗體19E9的抗原結合區 的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區，任選地是人類恒定區， 任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0376] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 48-50中列出的氨基酸序列SDYAWN、GYSITSD或 GYSITSDYAWN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID N0:51-52 中列出的氨基酸序列FVSYSGTTKYNPSLKS或FVSYSGTTK，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區，該HCDR3區包括如在SEQ ID N0:53中列出的氨基酸序列GYGFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基 酸；IXDRl區，該IXDRl區包括如在SEQ ID NO: 54中列出的氨基酸序列SATSSISSIYH1，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID NO:55列出的氨基酸序列 RTSNLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID N0:56中列出的 氨基酸序列QQGTTIPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0377] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0378] (a)SEQIDN0:46的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0379] (b)SEQIDN0:47的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0380] (c)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0381] (d)如 SEQ ID N0S:54、55 和 56 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0382] (e)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重鏈CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:54、 55和56中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個、 兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0383] (f)與具有SEQ ID N0:46的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0384] (g)與具有SEQ ID N0:47的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0385] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0386] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0387]抗體 9C10
[0388] 抗體9C10的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:57,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:58。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆抗 體9C10基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體9C10的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體9C10可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括9C10的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括9C10的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括9C10的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括9C10的可變輕鏈 可變區，或9C10的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體9C10的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0389] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 59-61中列出的氨基酸序列RYWMN、GYSFTR或 GYSFTRYWMN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID N0:62-63 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區，該HCDR3區包括如在SEQ ID N0:64中列出的氨基酸序列GNFFYVMDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的 氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID N0:65中列出的氨基酸序列RASQSIGTSIH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID NO:66列出的氨基酸序列 ASESISG，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID N0:67中列出的 氨基酸序列QQSNFWPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0390] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0391] (a)SEQIDN0:67的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0392] (b)SEQIDN0:68的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0393] (c)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0394] (d)如 SEQ ID N0S:65、66 和 67 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0395] (e)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:65、 66和67中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個、 兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0396] (f)與具有SEQIDN0:57的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0397] (g)與具有SEQIDN0:58的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0398] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的CDR1、2和3中的任一個可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0399] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0400]抗體 12A10
[0401] 抗體12A10的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:68,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:69。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆抗 體12A10基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體12A10的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體12A10可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸 序列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括12A10的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了 包括12A10的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括12A10的 重鏈可變區的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括12A10的可 變輕鏈可變區，或12A10的輕鏈可變區的CDR中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或 重鏈CDR中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾 (例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一 個包括抗體12A10的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白 恒定區，任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0402] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 70-72中列出的氨基酸序列NYWMN、GYSFTN或 GYSFTNYWMN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO:73-74 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列DDFFTMDY，或它的至少4、5、6、 7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨 基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列RASQNIVTSIH，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID NO:77列出的氨基酸序列 YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID N0:78中列出的 氨基酸序列QQSNIWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0403] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0404] (a)SEQ ID N0:68的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0405] (b)SEQIDN0:69的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0406] (c)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0407] (d)如 SEQ ID N0S:76、77 和 78 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0408] (e)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:76、 77和78中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個、 兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0409] (f)與具有SEQIDN0:68的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0410] (g)與具有SEQ ID N0:69的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0411] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0412] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0413]抗體 10A7
[0414] 抗體10A7的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:79,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:80。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆抗 體10A7基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體10A7的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體10A7可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括10A7的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括10A7的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括10A7的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括10A7的可變輕鏈 可變區，或10A7的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體10A7的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0415] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID N0:81-83中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 84-85中列出的氨基酸序列HIffffDDDRYYNPSLKS或HIWWDDDRY，或它們的至少4、5、6、7、 8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨 基酸；HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 86中列出的氨基酸序列RLNGYFDY，或它 的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被 取代為不同的氨基酸山CDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO:87中列出的氨基酸序列 RASQSISDYLH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區，該IXDR2區包括如在SEQ ID N0:88列出的 氨基酸序列YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID NO: 89 中列出的氨基酸序列QNGHSFPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中 這些氨基酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0416] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0417] (a) SEQ ID NO: 79的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0418] (b)SEQ ID N0:80的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0419] (c)如 SEQ ID N0:81-86 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0420] (d)如 SEQ ID N0S:87、88 和 89 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0421] (e)如 SEQ ID N0:81 至86 中所示的重鏈CDR1、2和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:87、 88和89中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個、 兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0422] (f)與具有SEQIDN0:79的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0423] (g)與具有SEQIDN0:80的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0424] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0425] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0426] 抗體1部8
[0427] 抗體18E8的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQIDN0:90,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQIDN0:91。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆抗 體18E8基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體18E8的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體18E8可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括18E8的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括18E8的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括18E8的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括18E8的可變輕鏈 可變區，或18E8的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體18E8的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0428] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 92-94中列出的氨基酸序列SDYSWH、GYSITSD或 GYSITSDYSWH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO:95-96 中列出的氨基酸序列NIHYSGRINYNPSLRS或NIHYSGRIN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區，該HCDR3區包括如在SEQ ID N0:97中列出的氨基酸序列RRTFGNFEDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的 氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列RSSSSVNYMH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸山CDR2區，該LCDR2區包括如在SEQ ID NO:99列出的氨基酸序列 ATSTLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或 多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID NO: 100中列出的 氨基酸序列QQWSSNPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0429] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0430] (a)SEQ ID N0:90的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0431] (b)SEQIDN0:91的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0432] (c)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0433] (d)如 SEQ ID N0S:98、99 和 100 中所示的輕鏈 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0434] (e)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重鏈CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:98、 99和100中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一 個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0435] (f)與具有SEQIDN0:90的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0436] (g)與具有SEQIDN0:91的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0437] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶Rl、2和3中的任一個可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0438] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0439]抗體 10F3
[0440] 抗體10F3的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 101，輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 102。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆 抗體10F3基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體10F3的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體10F3可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括10F3的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括10F3的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括10F3的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括10F3的可變輕鏈 可變區，或10F3的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體10F3的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0441] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID N0:103-105中列出的氨基酸序列SYTMH、GYTFTS或 GYTFTSYTMH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 106-107中列出的氨基酸序列HNPSSGYTEYNQKFKD或HNPSSGYTE，或它們的至少4、5、 6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的 氨基酸；HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 108中列出的氨基酸序列GGDWDVDWFVY， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以 被取代為不同的氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO: 109中列出的氨基酸序 列SASSSISYMH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區，該IXDR2區包括如在SEQ ID NO: 110列 出的氨基酸序列STSKLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些 氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID NO: 111中列出的氨基酸序列QHRSTYPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0442] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0443] (a) SEQ ID NO: 101的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0444] (b) SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0445] (c)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0446] (d)如 SEQ ID N0S:109、110 和 111 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0447] (e)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID 勵：109、110和111中所示的輕鏈0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨基酸序列，其中0)1? 中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0448] (f)與具有SEQIDN0:101的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0449] (g)與具有SEQIDN0:102的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0450] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶Rl、2和3中的任一個可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0451] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0452]抗體 I5F9
[0453] 抗體15F9的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 112,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 113。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆 抗體15F9基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體15F9的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體15F9可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括15F9的Fab或F (ab'）2部分。還提供了包 括15F9的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括15F9的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括15F9的可變輕鏈 可變區，或15F9的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體15F9的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0454] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID NO: 114-116中列出的氨基酸序列SGYSWH、GYSITSG或 GYSITSGYSWH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 117-118中列出的氨基酸序列FIHYSGSTDYNPSLKS或FIHYSGSTD，或它們的至少4、5、6、 7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨 基酸；HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 119中列出的氨基酸序列DYGHWYFDV，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被 取代為不同的氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO: 120中列出的氨基酸序列 KASQSVSYDVA，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區，該IXDR2區包括如在SEQ ID NO: 121列出 的氨基酸序列YASNRYT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨 基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID N0:122中列出的氨基酸序列QQDYSSLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0455] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0456] (a) SEQ ID NO: 112的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0457] (b) SEQ ID NO: 113的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0458] (c)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0459] (d)如 SEQ ID N0S:120、121 和 122 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0460] (e)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:120、121和122中所示的輕鏈CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0461] (f)與具有SEQ ID N0:112的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0462] (g)與具有SEQIDN0:113的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0463] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0464] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0465]抗體 14B4
[0466] 抗體14B4的重鏈可變區的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 123,輕鏈可變區的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 124。在一個【具體實施方式】中，本發明提供了結合與單克隆 抗體14B4基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體14B4的抗原結合區。 在本文的任何實施方式中，抗體14B4可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個優選實施方式中，該單克隆抗體包括14B4的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括14B4的重鏈可變區的單克隆抗體。根據一個實施方式，該單克隆抗體包括14B4的重鏈 可變區的三個CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進一步包括14B4的可變輕鏈 可變區，或14B4的輕鏈可變區的⑶R中的一個、兩個或三個。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個或多個可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或更多個氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區和/或重鏈可變區中的任一個包括 抗體14B4的抗原結合區的一部分或全部的抗體被融合進人類IgG型的免疫球蛋白恒定區， 任選地是人類恒定區，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0467] 在另一個方面，本發明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區，該HCDRl區包括如在SEQ ID N0:125-127中列出的氨基酸序列SYWMN、GYSFTS或 GYSFTSYWMN、或G，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區，該HCDR2區包括如在SEQ ID NO: 128-129中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、 6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被取代為不同的 氨基酸；HCDR3區，該HCDR3區包括如在SEQ ID NO: 130中列出的氨基酸序列EMGPYTLDY，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被 取代為不同的氨基酸；LCDRl區，該LCDRl區包括如在SEQ ID NO: 131中列出的氨基酸序列 RASQNIDTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區，該IXDR2區包括如在SEQ ID NO: 132列出 的氨基酸序列YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，其中這些氨 基酸中的一個或多個可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區，該IXDR3區包括如在SEQ ID NO: 133中列出的氨基酸序列QQSNYWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0468] 在另一個方面，本發明提供了結合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0469] (a) SEQ ID NO: 123的重鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0470] (b) SEQ ID NO: 124的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0471] (c)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0472] (d)如 SEQ ID N0S:131、132 和 133 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0473] (e)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個或多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:131、132和133中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0474] (f)與具有SEQ ID N0:123的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區,其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0475] (g)與具有SEQIDN0:124的氨基酸序列的可變區至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區，其中一個、兩個、三個或更多個氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0476] 在本文的任何實施方式的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個連續氨基酸的序列，和/或特征為具有與對應 SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0477] 在另一個方面，本發明提供了對于MICA結合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競 爭的抗體。
[0478]在本發明的任何抗體，例如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、 15F9或14B4中，指定的可變區和⑶R序列可以包括保守性序列修飾（1、2、3、4、5、6、7、8個 或更多個序列修飾）。保守性序列修飾是指并不顯著影響或改變包含該氨基酸序列的抗體 的結合特征的氨基酸修飾。此類保守性修飾包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通過本領域 已知的標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變，將修飾引入本發明的抗體中。典型地， 保守性氨基酸取代是其中氨基酸殘基被替換為具有側鏈的氨基酸殘基，該側鏈具有類似的 理化特性。指定的可變區和CDR序列可以包括一個、兩個、三個、四個或更多個氨基酸插入、 缺失或取代。當做出取代時，優選的取代將是保守性修飾。在本領域已經限定了具有類似側 鏈的氨基酸殘基的多個家族。這些家族包括具有堿性側鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）， 酸性側鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸），不帶電荷的極性側鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），非極性側鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），3分支側鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）以及芳 香側鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，本發明的抗體的CDR區 內的一個或多個氨基酸殘基可以被替換為來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以 使用在此所述的測定來測試改變的抗體的保留功能（即在此列出的特性）。
[0479] 當在兩個或更多個多肽的序列之間的關系中使用時，術語"同一性"或"同一 的"是指多個多肽之間序列相關性的程度，如通過兩個或更多個氨基酸殘基的鏈之間 的匹配數進行確定。"同一性"測量了具有通過具體的數學模型或計算機程序（即"算 法"）解決的間隙配準（如果有的話）的兩個或更多個序列中的更小的序列之間的同一 性匹配的百分數。可以通過已知方法容易地計算相關多肽的同一性。相關方法包括但不 局限于，在以下文獻中描述的那些！Computational Molecular Biology(計算分子生物 學），Lesk (萊斯克），A. M.，編輯，Oxford University Press (牛津大學出版社），紐約， 1988 ;Biocomputing: Informatics and Genome Projects (生物計算：信息學和基因組工 程），Smith (史密斯），D. W.，編輯，Academic Press (學術出版社），紐約，1993 !Computer Analysis of Sequence Data(序列數據的計算機分析），部分1，Griffin(格里芬），A. M., 和Griffin (格里芬），H. G.，編輯，Humana Press (人類出版社），新澤西州，1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物學中的序列分析），von Heinje (馮海因切）， G.，Academic Press (學術出版社），1987 !Sequence Analysis Primer(序列分析引物）， Gribskov (哥博斯科夫），M?和 Devereux (德弗羅?），J.，編輯，M. Stockton Press (M?斯托 克頓出版社），紐約，1991 ;以及Carillo (卡里羅）等人，SIAM J. Applied Math?(工業與應 用數學學會應用數學雜志）48, 1073(1988)。
[0480] 優選的用于確定同一性的方法被設計為給出所測試序列之間的最大匹配。確定 同一性的方法描述于公開可獲得的計算機程序中。優選的用于確定兩個序列之間同一性 的計算機程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux (德弗羅）等人，Nucl. Acid. Res. (核酸研究）12, 387 (1984) ;Genetics Computer Group (遺傳學計算機組），University of Wisconsin(威斯康星州大學），Madison(麥迪遜），威斯康星州），BLASTP，BLASTN，以及 FASTA (Altschul (阿特休爾）等人，J. Mol. Biol?(分子生物學雜志）215, 403-410 (1990))。 BLASTX程序是從生物技術信息國家中心（NCBI)和其他來源（BLAST手冊，Altschul (阿特 休爾）等人，NCB/NLM/NIH Bethesda (貝塞斯達），馬里蘭州20894 ;阿特休爾等人，同上） 公開可獲得的。還可以使用熟知的史密斯-沃特曼算法確定同一性。
[0481]根據 AbM (Oxford Molecular' s AbM ant ibody model I ing software definition(牛津分子 AbM 抗體建模軟件定義）），Kabat and Chothia definitions systems (卡巴特和喬西亞定義體系），⑶R的序列已經概述于下表A中。雖然可以使用 任何適合的編號體系來指定CDR區，但在任何其他指示不存在的情況下，在此使用的編號 是Abm。已經使用以下指示建立了這樣的編號：⑶R-Ll :起始：大約殘基24,殘基前：總 是 Cys,殘基后：總是 Trp(典型地為 Trp-Tyr-Gln,而且為 Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)，長度：10至17個殘基；CDR-L2 :起始：在Ll的末端之后總是16個殘基，殘基 前：通常為116-171'(并且還有￥&1-1 71'、116-1^8、116-?1^)，長度：總是7個殘基；0)1?-13， 起始：在L2的末端之后總是33個殘基，殘基如：總是Cys，殘基后：總是Phe_Gly-Xaa_Gly， 長度：7至11個殘基；⑶R-H1，起始：大約殘基26(總是在Cys之后4個）（喬西亞/AbM定義， 卡巴特定義開始于5個殘基之后），殘基前：總是Cys-Xaa-Xaa-Xaa,殘基后：總是Trp (典型 地為Trp-Val,并且還有Trp-Ile，Trp-Ala)，長度：10至12個殘基（AbM定義，喬西亞定義排 除最后4個殘基）；CDR-H2,起始：在CDR-Hl的卡巴特/AbM定義的末端之后總是15殘基，殘 基前：典型地為 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但有多個變化，在 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/ Ala-Thr/Ser/Ile/Ala之后的殘基），長度：卡巴特定義16至19個殘基；AbM(和喬西亞）定 義在7個殘基前終止；⑶R-H3,起始：在⑶R-H2末端之后總是33殘基（在Cys之后總是2 個），殘基前：總是Cys-Xaa-Xaa (典型地為Cys-Ala-Arg)，殘基后：總是Trp-Gly-Xaa-Gly, 長度3至25個殘基。
[0482] 根據本發明的抗體可變鏈的序列列于下表B中，前導子序列在每個序列的開始處 加有下劃線（任何抗體鏈可以被指定為在緊隨于前導子序列末端之后的氨基酸位置處起 始），并且每個CDR加有下劃線。在此處的任何實施方式中，VL或VH序列可以被指定或編 號從而使得包含或缺乏信號肽或其任何部分。
[0483] 在一個實施方式中，本發明的抗體具有人類IgGl或IgG3同種型。在一個實施方 式中，本發明的抗體是保持其結合和/或功能特性的抗體片段。
[0484]表 A
[0485]
【權利要求】
1. 一種單克隆抗體，其結合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽。
2. 如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體的特征在于通過流式細胞術確定的下述 EC50:對于與在其表面表達包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽的細胞、在其表 面表達包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽的細胞、以及在其表面表達包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽的細胞的結合而言，該EC50至多5μ g/ml，任選地至多 3 μ g/ml、至多 2 μ g/ml、至多 1 μ g/ml 或至多 0· 5 μ g/ml。
3. 如權利要求1-2所述的抗體，其中所述抗體進一步結合至包括SEQ ID NO:3的氨基 酸序列的MICA多肽；任選地，其中所述抗體的特征在于對于與在其表面表達所述MICA多肽 的細胞的結合而言至多5 μ g/ml，任選地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
4. 如權利要求1-3所述的抗體，其中所述抗體進一步結合至包括SEQ ID N0:6的氨基 酸序列的MICB多肽；任選地，其中所述抗體的特征在于對于與在其表面表達所述MICB多肽 的細胞的結合而言至多5 μ g/ml，任選地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
5. 如權利要求1-4所述的抗體，其中所述抗體結合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α? 和/或α 2結構域。
6. 如權利要求1-5所述的抗體，其中所述抗體不抑制MICA在NKG2D表達細胞中誘導 NKG2D活性的能力。
7. 如權利要求1-5所述的抗體，其中所述抗體阻斷MICA與NKG2D的相互作用。
8. 如權利要求1-5或7所述的抗體，其中所述抗體抑制sMICA誘導的NKG2D在細胞的 表面上的表達的下調。
9. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體結合至表位，該表位包括選自 下組的任何一個或多個氨基酸殘基，該組由以下組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
10. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體具有至突變型MICA多肽的減 少的結合，該突變型MICA多肽在以下各項處包括突變 ： (a) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每種情況下相對于所述抗體與SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之間的結合。
11. 如權利要求1-10中任一項所述的抗體,其中所述抗體結合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 3結構域。
12. 如權利要求1-10中任一項所述的抗體，其中所述抗體結合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 1和/或α 2結構域。
13. -種單克隆抗體，其結合SEQ ID NO: 1的人類MICA多肽，其中所述抗體不阻斷MICA 與NKG2D的相互作用并且不阻斷MICA自MICA-表達細胞脫落。
14. 一種單克隆抗體，其結合SEQ ID NO: 1的人類MICA多肽，其中所述抗體抑制sMICA 誘導的NKG2D在免疫效應細胞的表面上的表達的下調而不阻斷MICA自MICA表達細胞脫 落。
15. -種單克隆抗體，其結合至SEQ ID N0:1的MICA多肽的α 1和/或α 2結構域，其 中所述抗體不阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或不抑制MICA在NKG2D表達細胞中誘導 NKG2D活性的能力。
16. -種單克隆抗體，其結合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α 3結構域，其中所述抗體 阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或抑制sMICA誘導的NKG2D在NKG2D表達細胞中的活 性。
17. 如權利要求16所述的抗體，其中所述抗體抑制sMICA誘導的NKG2D在細胞的表面 上的表達的下調。
18. 如權利要求13-17所述的抗體，其中所述抗體結合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序 列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:4的氨基酸 序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MICA多肽。
19. 如權利要求18所述的抗體，其中所述抗體結合至包括SEQ ID N0:6的氨基酸序列 的MICB多肽和/或包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MICA多肽。
20. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體結合至包括0聯和/或N聯聚 糖的MICA多肽，任選地其中所述抗體結合至由腫瘤細胞表達的糖基化MICA多肽。
21. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體不阻斷MICA自細胞脫落。
22. -種單克隆抗體，其結合SEQ ID NO: 1的MICA多肽，其中所述抗體具有至突變型 MICA多肽的減少的結合，該突變型MICA多肽在以下各項處包括突變： (a) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 選自下組的1、2、3、4個或更多個殘基，該組由以下各項組成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每種情況下相對于所述抗體與SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之間的結合。
23. -種單克隆抗體，其結合至表位，該表位包括選自下組的任何一個或多個氨基酸殘 基，該組由以下各項組成：SEQ ID N0:1 的 MICA 多肽的 R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、 N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、 M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
24. 如前面權利要求中任一項所述的抗體，其中對于與SEQ ID N01的MICA多肽的結 合，所述抗體與選自下組的抗體競爭，該組由以下各項組成： (a) 分別具有SEQ ID N0:7和8的VH和VL區的抗體（6E4); (b) 分別具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL區的抗體（20C6); (c) 分別具有SEQ ID N0:33和34的VH和VL區的抗體（16A8); ⑷分別具有SEQ ID N0:46和47的VH和VL區的抗體（19E9); (e)分別具有SEQ ID N0:57和58的VH和VL區的抗體（9C10); ⑴分別具有SEQ ID N0:68和69的VH和VL區的抗體（12A10); (g) 分別具有SEQ ID N0:79和80的VH和VL區的抗體（10A7); (h) 分別具有SEQ ID N0:90和91的VH和VL區的抗體（18E8); (i) 分別具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL區的抗體（10F3); (j) 分別具有SEQIDN0:112和113的VH和VL區的抗體（15F9);以及 (k) 分別具有SEQ ID NO: 123和124的VH和VL區的抗體（14B4)。
25. 根據以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈 包括： a包括具有式VI的氨基酸序列（SEQ ID N0:266)的輕鏈CDRl(LCDRl); b包括具有式VII的氨基酸序列（SEQ ID N0:267)的輕鏈CDR2(LCDR2);和 c包括具有式VIII的氨基酸序列（SEQ ID N0:268)的輕鏈CDR3(LCDR3); 所述重鏈包括： d包括選自式I、II以及III的氨基酸序列（分別為SEQ ID NO:261、262以及263)的 重鏈 CDR1 (HCDR1);和 / 或 e包括具有式IV的氨基酸序列（SEQ ID N0:264)的重鏈CDR2(HCDR2);和/或 f包括具有式V的氨基酸序列（SEQ ID N0:265)的重鏈CDR3(HCDR3)。
26. 選自下組的單克隆抗體，該組由以下各項組成： (a) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO:7的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:8的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (b) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 20的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:21的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (c) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 33的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:34的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； ⑷單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 46的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:47的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (e)單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 57的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:58的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； ⑴單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO:68的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:69的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (g) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 79的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:80的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (h) 單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 90的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:91的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (i) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 101的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈； (j) 單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 112的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 113的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈；以及 (k) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 123的重鏈可變區的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 124的輕鏈可變區的⑶Rl、2和3的輕鏈。
27. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體包括結合人類Fc γ IIIA受體 的人類重鏈恒定區。
28. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體對于結合至MICA多肽具有小 于1(Γ9Μ的二價Kd。
29. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、人類抗體或人源 化抗體。
30. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是四聚體抗體。
31. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中該抗體是選自以下的抗體片段：Fab、 Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多個不同抗體片段的多特異性 抗體。
32. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體共軛或共價地結合至毒劑。
33. 如以上權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體共軛或共價地結合至可檢測 部分。
34. -種抗體，其通過嵌合化或人源化如權利要求1至28所述的抗體而獲得。
35. -種藥物組合物，其包括根據以上權利要求中任一項所述的抗體以及藥學上可接 受的載體。
36. 如權利要求35所述的組合物，其中所述抗體以約25mg與500mg之間的量存在。
37. -種試劑盒，其包括如以上權利要求中任一項所述的抗體，任選地進一步包括特異 性識別如以上權利要求中任一項所述的抗體的標記的第二抗體。
38. -種雜交瘤或重組宿主細胞，其產生如權利要求1至28所述的抗體。
39. -種用于治療或預防對其有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者 給予有效量的如權利要求1-34所述的抗體或如權利要求35-36所述的組合物。
40. 如權利要求39所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
41. 一種用于在對象中鑒定MICA表達細胞的方法，所述方法包括從對象獲得包括細胞 的生物樣品，使所述細胞與如權利要求1-34所述的抗體接觸并且評價所述抗體是否結合 至所述細胞。
42. -種用于在對象中鑒定MICA表達疾病相關細胞的方法，所述方法包括從對象獲得 包括疾病相關細胞的生物樣品，使所述疾病相關細胞與如權利要求1-34所述的抗體接觸 并且評價所述抗體是否結合至疾病相關細胞，其中所述抗體結合至疾病相關細胞的發現指 示所述對象罹患疾病、所述對象具有疾病相關細胞和/或所述疾病相關細胞表達MICA。
43. -種用于選擇罹患對用如權利要求1-34所述的抗體的治療應答的對象的方法，所 述方法包括確定所述對象中的腫瘤細胞是否表達MICA多肽，任選地腫瘤細胞是否表達升 高水平的MICA多肽，MICA多肽或升高水平的MICA多肽的所述表達是應答對象的指征。
44. 如權利要求43所述的方法，進一步包括向應答對象給予如權利要求1-34所述的抗 體。
45. 如權利要求42-44所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
46. 如權利要求42-45所述的方法，其中所述疾病相關細胞或腫瘤細胞表達糖基化 MICA多肽，任選地是包括一個或多個核心20-聚糖的MICA多肽。
47. 如權利要求41-46所述的方法，其中所述方法在確定所述對象、所述疾病相關細胞 或所述腫瘤細胞是否包括選自下組的MICA等位基因之前沒有另外的步驟，該組由以下各 項組成 ：MICA*001、MICA*004、MICA*007 以及 MICA*008。
【文檔編號】A61K39/395GK104244977SQ201380017820
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月7日 優先權日:2012年2月7日
【發明者】M·布萊瑞, L·高蒂爾, I·佩羅特, C·邦納福斯 申請人:先天制藥公司