非人類動物抑郁癥模型及其使用方法
【專利摘要】本公開提供了非人類光遺傳動物抑郁癥模型。具體來說，非人類動物各自在動物神經元中表達光響應性視蛋白。所述動物模型用于鑒定治療抑郁癥的試劑和鑒定治療抑郁癥的治療策略的靶標。描述了使用表達光響應性視蛋白的非人類動物的實例，所述光響應性視蛋白包括光響應性氯泵的鹽細菌視紫紅質家族和光響應性陽離子通道蛋白的視紫紅質通道蛋白家族。
【專利說明】非人類動物抑郁癥模型及其使用方法
[0001] 相關申請案
[0002] 本申請要求2012年3月20日提交的美國臨時專利申請第61/613, 231號的權益， 該申請以引用的方式整體并入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 重性抑郁障礙特征在于情緒低落，有自殺想法、職業倦怠并且無法體驗快樂。盡管 這種使人衰弱的精神疾病普遍，但最常用的治療性干預、選擇性血清素再攝取抑制劑往往 無效并且具有嚴重的不良副作用。
[0005] 當前的非人類動物抑郁癥模型非特異性。本領域需要改進的非人類動物抑郁癥模 型。
[0006] 發明概述
[0007] 本公開提供了非人類光遺傳動物抑郁癥模型。所述動物模型用于鑒定治療抑郁癥 的試劑和鑒定治療抑郁癥的治療策略的靶標。
[0008] 附圖簡述
[0009] 圖IA-E描繪了通過選擇性抑制腹側被蓋區（VTA)多巴胺（DA)神經元對抑郁樣表 現型的誘導。
[0010] 圖2A-E描繪了通過稀疏階段性光激活VTA DA神經元對應激誘導的抑郁樣表現型 的挽救。
[0011] 圖3A-C描繪了介導逃避相關行為對多巴胺，而非谷氨酰胺受體信號序列的需要。
[0012] 圖4A-I描繪了通過階段性激活VTA DA神經元對TH: :Cre大鼠逃避相關行為的 NAc神經編碼的調節。
[0013] 圖5A-E描繪了使用自動化強迫游泳試驗（FST)提供可與同時記錄的神經數據同 步的高時間分辨率讀數。
[0014] 圖6A和6B描繪了 FST中對個體跳動的檢測。
[0015] 圖7A-C描繪了使用磁感應法檢測籠子的固定性。
[0016] 圖8A-G描繪了通過前額神經元活性對FST行為狀態的編碼。
[0017] 圖9A-J描繪了通過光遺傳刺激中縫背核（DRN)中的mPFC軸突而非興奮性內側前 額葉皮質（mPFC)在具有挑戰性的情況下誘導快速可逆的行為激活。
[0018] 圖IOA和IOB描繪了大鼠 mPFC的光遺傳刺激。
[0019] 圖IlA和IlB描繪了 DRN組織學和光極記錄。
[0020] 圖12A-J描繪了光遺傳刺激DRN投射的mPFC神經元對mPFC編碼能力的影響。
[0021] 圖 13A 和 13B 描繪了 THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 小鼠和 THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 小鼠 對條件性位置厭惡試驗的反應。
[0022] 定義
[0023] 如本文所使用，關于核酸的術語"異源"指并非在其自然環境中（即，已經人為改 變）的編碼基因產物的核酸（多肽或核酸）。例如，異源核酸包括從一個物種引入另一物種 的核酸。異源核酸還包括一種生物天然所有的，已經在某些方面改變（例如，突變、添加多 個拷貝、與非天然啟動子或增強子序列連接等）的基因。異源核酸可包含含核酸cDNA形式 的核苷酸序列；cDNA序列可在有義（生成mRNA)或反義方向（生成與mRNA轉錄產物互補 的反義RNA轉錄產物）表達。在一些實施方案中異源核酸可與內源核酸區別之處在于，異 源核酸序列通常與包含調控元件例如啟動子的核苷酸序列連接，未發現啟動子與異源基因 編碼的蛋白質基因或與染色體中的基因序列自然締合，或與自然界中不存在的染色體部分 (例如，在基因一般不表達的基因座中表達的基因）締合。
[0024] 如本文所使用，術語"非人類哺乳動物"指任何非人類哺乳動物，包括但不限于非 人靈長類動物、嚙齒動物（例如，小鼠、大鼠等）等。在一些情況下，非人類哺乳動物為小鼠。 在其它情況下，非人類哺乳動物為大鼠。
[0025] 如本文所使用，"心境障礙"指相當長一段時間個體體驗的情調或情緒狀態混亂。 心境障礙包括但不限于重性抑郁障礙（即，單相障礙）、躁狂、煩躁不安、雙相障礙、心境惡 劣、躁郁癥等。見，例如，Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，第 4 版，（DSM IV)。
[0026] 如本文所使用，"焦慮障礙"指不愉快的情緒狀態，包括表面上由未承認的內心沖 突引起的，對預想不真實或想象的危險的心理生理反應。生理伴隨情況包括心率增加、呼吸 率改變、出汗、發抖、虛弱和疲勞；心理伴隨情況包括感覺危險迫近、無力、憂懼和緊張。焦慮 障礙包括但不限于恐慌癥、強迫癥、創傷后應激障礙、社會恐怖癥、社交焦慮障礙、特定恐懼 癥、廣泛性焦慮障礙。
[0027] "強迫癥"或"0CD"是特征在于足以在個體中引起顯著痛苦的反復出現的困擾或強 迫的焦慮障礙。強迫癥通常耗時，和/或明顯干擾人的正常功能、社交活動或關系。困擾是 進入意識且持續、侵入性且討厭的反復出現的念頭、想法、影象或沖擊。常常，試圖忽略或抑 制所述想法，或用一些其它想法或舉動將其中和。個體可能將困擾視為他或她自己意識的 產物。強迫是響應于困擾進行的反復、有目的性的行為或動作，并且通常設計用于中和或防 止不適或某種可怕事件或情形。例如，常見困擾涉及污染想法；過多、反復且非目的性的洗 手是常見的強迫癥。
[0028] "重性抑郁癥"、"重性抑郁障礙"或"單相障礙"指牽涉下列任何癥狀的心境障礙： 持續性悲傷、焦慮或"空虛"感；感到絕望或悲觀；感到內疚、沒有價值或無助；對曾經喜愛 的嗜好和活動失去興趣或樂趣，包括性；精力減少、疲勞、變得"遲鈍";難以集中精神、記憶 或做決定；失眠、早醒或睡過頭；食欲喪失和/或重量減輕或過食和增重；有死亡或自殺想 法或企圖自殺；坐立不安或煩躁或對治療無反應的持續身體癥狀，例如頭痛消化障礙和慢 性疼痛。例如，在DSM IV中描述了各種抑郁亞型。
[0029] "雙相障礙"是特征在于改變極端心境周期的心境障礙。有雙相障礙的人經歷通 常搖擺不定地嘗試過分高亢或易怒（躁狂）到悲傷和無助（抑郁），然后恢復的心境循環， 期間有正常心境期。例如，在DSM IV中描述了對雙相障礙的診斷。雙相障礙包括雙相障礙 I (有或無重性抑郁的躁狂）和雙相障礙Π (有重性抑郁的輕度躁狂），見，例如，DSM IV。
[0030] 在進一步描述本發明之前，應理解本發明不限于描述的特定實施方案，當然這樣 可能會有所不同。還應理解，本文使用的術語是僅僅是為了描述特定實施方案，而非旨在限 制，因為本發明的范圍將僅受所附權利要求限制。
[0031] 當提供了值的范圍時，應理解除非上下文另外明確指出，該范圍上下限之間以下 限單位十分之一為基準的每個居中值和該規定范圍中任何其它規定值或居中值均涵蓋在 本發明內。這些較小范圍的上下限可能獨立包括在較小范圍內，并且也涵蓋在本發明內，受 規定范圍中任何特別排除的限值限制。當規定范圍包括一個或兩個限值時，排除任一個或 兩個已包括的限值的范圍也包括在本發明中。
[0032] 除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中普通技 術人員通常所理解的相同含義。雖然在本發明的實踐或試驗中也可使用與本文所述相似或 等效的任何方法和材料，但是現在描述了優選方法和材料。本文提到的所有出版物以引用 的方式并入本文公開內容中并且連同引用的出版物一起描述了所述方法和/或材料。
[0033] 必須指出的是，除非上下文另外明確指出，如本文和所附權利要求中所使用，單數 形式"一種"、"一個"和"所述"包括復數個指示物。因此，例如，提到"一種光活化的陽離子 通道"包括多個此類光活化的陽離子通道并且提到"所述抑郁行為"包括提到一種或多種抑 郁行為和本領域技術人員已知的等效行為，等等。應進一步指出，起草權利要求可能是為了 排除任何可選要素。同樣，本聲明旨在用作連同敘述權利要求要素使用諸如"只是"、"僅僅" 等專用術語或使用"否定"限制的"前提"基礎。
[0034] 應認識到，也可能在單個實施方案中組合提供在獨立實施方案的上下文中為清楚 起見描述的本發明的某些特征。相反，也可能單獨或以任何適合子組合提供在單個實施方 案的上下文中為簡潔起見描述的本發明的各種特征。本發明具體包括了屬于本發明的所有 實施方案的組合并且在本文中公開，就如同單獨明確地公開了每個組合一樣。另外，本發明 還具體包括了各實施方案的所有子組合及其要素并且在本文中公開，就如同在本文中單獨 明確地公開了每個此類子組合一樣。
[0035] 提供本文討論的出版物只是為了其在本申請提交日期之前的公開內容。不得將本 文任何內容解釋為承認本發明無權憑借先前發明而先于此類出版物。進一步地，提供的出 版日期可能不同于可能需要獨立確認的實際出版日期。
[0036] 發明詳述
[0037] 本公開提供了非人類光遺傳動物抑郁癥模型。所述動物模型用于鑒定治療抑郁癥 的試劑和鑒定治療抑郁癥的治療策略的靶標。
[0038] 非人類動物抑郁癥模型
[0039] 本公開提供了在動物神經元中表達光響應性視蛋白（例如，光響應性離子通道、 光響應性離子泵等）的非人類動物。通過將光活化視蛋白暴光而活化光響應性視蛋白調節 了動物的行為。在特定實施方案中，光活化光響應性視蛋白誘導動物抑郁。在其它實施方 案中，光活化光響應性視蛋白緩解抑郁。
[0040] 在一些情況下，主題非人類動物抑郁癥模型在活化光響應性視蛋白的光存在下表 現出抑郁癥癥狀。在其它情況下，主題非人類動物抑郁癥模型在活化光響應性視蛋白的光 缺乏時表現出抑郁癥癥狀。
[0041] 主題非人類動物抑郁癥模型可用于分析試驗試劑對多種不良心理和生理狀態的 任一種的影響，包括但不限于煩躁不安、抑郁、快感缺失、自殺、激動、焦慮、藥物成癮戒斷癥 狀等。在一些情況下，將減輕或緩和不良狀態的試驗試劑視為治療心境障礙（例如，重性抑 郁癥（即，單相障礙）、躁狂、煩躁不安、雙相障礙、心境惡劣、躁郁癥等）的候選試劑。因此， 雖然討論了抑郁癥，但是主題篩選方法可用于分析試驗試劑對多種不良狀態的任一種的影 響；并且鑒定的試驗試劑可視為治療多種心境障礙的任一種和其它不良心理和生理狀態的 候選試劑。
[0042] 非人類動物模型中抑郁癥的癥狀包括（例如）逃避相關行為減輕、焦慮和應 激。對抑郁癥和/或焦慮和/或應激的試驗包括強迫游泳試驗（FST)(見，例如，Porsolt 等（1977)Nature 266:730;和 Petit-Demouliere,等（2005)Psychopharmacology 177:245);懸尾試驗（見，例如，Cryan 等（2005)Neurosci. Behav. Rev. 29:571 ;和 Li 等（2〇01)Neuropharmacol.40:l〇28);條件性位置厭惡（見，例如，Bechtholt-Gompf 等 (2〇10)Neuropsychopharmacol. 35:2〇49);新穎節食試驗（Dulawa,等（2〇〇 5)Neurosci. Biobehav. Rev. 29:771);社會失敗應激試驗（見，例如，Blanchard 等（2001)Physiol Behav. 73:261 - 271 ;和 Kudryavtseva 等（1991) Pharmacol. Biochem. Behav. 38:315);糖水 偏好試驗（見，例如，Kurre Nielsen,等（2000)Behavioural Brain Research 107:21-33); 曠場試驗（見，例如，Holmes (2001) Neurosci. Biobehav. Rev. 25:261 - 273);高架十字迷宮 試驗（見，例如，Holmes (2001)同上）；等等。
[0043] 將包含編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列的核酸引入非人類哺乳動物。本文將包 含編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列的核酸也稱為"異源核酸"或"轉基因"。表達核酸，以 致在非人類哺乳動物的神經元中合成光響應性視蛋白。
[0044] 光響應性視蛋白在暴露于激活波長（激活視蛋白的波長）的光時，可以促進在其 中表達光響應性視蛋白的細胞（例如，神經元）的質膜超極化或去極化。例如，當在腹側被 蓋區的多巴胺能（DA)神經元中表達光活化視蛋白時，并且當光活化視蛋白在激活波長的 光存在下促進超極化時，抑制了 DA神經元的活性。再如，當在腹側被蓋區的DA神經元中表 達光活化視蛋白時，并且當光活化視蛋白在受激活波長的光激活時促進神經元去極化時， 激活了 DA神經元。再如，當在內側前額葉皮質的興奮性（谷氨酸能）神經元中表達光活化 視蛋白時，并且當光活化視蛋白在受激活波長的光激活時促進神經元去極化時，激活了興 奮性神經元。
[0045] 在一些情況下，轉基因整合到非人類哺乳動物的神經元基因組中。可靶向整合到 基因組中，例如，轉基因整合到基因組中的特定靶位點。可非靶向整合到基因組中，例如，轉 基因整合到基因組的隨機位點。在其它情況下，轉基因仍為附加體，例如，轉基因未整合到 非人類哺乳動物的基因組中。在一些情況下，在哺乳動物大體上所有細胞中存在轉基因；在 其它情況下，僅在哺乳動物一個亞類的細胞中存在轉基因（例如，僅在哺乳動物的神經元 細胞群中存在轉基因）。當在哺乳動物大體上所有細胞中存在轉基因時，在許多實施方案 中，轉基因僅在一個亞類的細胞中表達，例如僅在哺乳動物的神經元細胞中表達。
[0046] 向一個亞類的細朐中引入轉某閔
[0047] 如上所述，在一些情況下，僅在哺乳動物一個亞類的細胞中存在轉基因（例如，包 含編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列的核酸）。例如，在一些情況下，僅在腦細胞中存在轉 基因。在這些實施方案的一些中，將轉基因整合到所述亞類的細胞的基因組中（隨機整合 位點或靶向整合位點）。在其它情況下，轉基因仍為附加體。
[0048] 在一些情況下，編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列與為細胞類型特異性表達轉基 因而提供的轉錄控制元件可操作連接。例如，在一些情況下，編碼光響應性視蛋白的核苷酸 序列與為神經元特異性表達轉基因而提供的控制元件（例如，啟動子）可操作連接。在一 些情況下，神經元特異性啟動子是為在一個亞型的神經元，例如多巴胺能神經元、興奮性神 經元、側前額葉皮質神經元等中表達轉基因而提供。
[0049] 在本領域中已知神經元特異性啟動子和其它控制元件（例如，增強子）。適 合的神經元特異性控制序列包括但不限于神經元特異性烯醇酶（NSE)啟動子（見，例 如，EMBL HSEN02、X51956);芳香族氨基酸脫羧酶（AADC)啟動子；神經絲啟動子（見， 例如，GenBank HUMNFL, L04147);突觸蛋白（synapsin)啟動子（見，例如，GenBank HUMSYNIB，M55301) ;thy-l 啟動子（見，例如，Chen 等（1987)Cell51:7-19 JPLlewellyn 等（2010)Nat. Med. 16(10) :1161-1166);血清素受體啟動子（見，例如，GenBank S62283); 酪氨酸羥化酶啟動子（TH)(見，例如，Oh 等（2009)Gene Ther 16:437 ;Sasaoka 等（1992) Mol. Brain Res. 16:274 ;Boundy 等（1998) J. Neurosci. 18:9989;和 Kaneda 等（1991) Neuron 6:583-594) ;GnRH 啟動子（見，例如，Radovick 等（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406) ;L7 啟動子（見，例如，Oberdick 等（1990)Science 248:223-226) ;DNMT 啟 動子（見，例如，Bartge 等（I988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652);腦啡肽啟動 子（見，例如，Comb等（1988)EMBO J. 17:3793-3805);髓鞘堿性蛋白（MBP)啟動子；Ca2+-鈣 調素依賴型蛋白激酶Π-a (CamKIIa)啟動子（見，例如，Mayford等（1996)?1"〇(：.似七1· Acad. Sci. USA 93:13250 ;和 Casanova 等（2001) Genesis 31:37);和 CMV 增強子 / 血小板 源生長因子-β啟動子（見，例如，Liu等（2004)Gene Therapy 11:52-60)。
[0050] 可將轉基因（例如，包含編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列的核酸）直接注入目 標組織或目標組織附近，以為在目標組織中表達光響應性視蛋白而提供。例如，可將轉基因 注入腦部目標區域或附近，例如可將轉基因注入前額皮質、腹側被蓋區等或附近。
[0051] 整合到合子或ES細朐的某閔鉬中
[0052] 另一方面，本發明提供了其基因組包含轉基因（例如，包含編碼光響應性視蛋 白的核苷酸序列的核酸）的合子或胚胎干（ES)細胞。可通過任何標準方法，例如全部 以引用的方式并入本文的 Hogan 等，〃Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986 ；Kraemer 等，''Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo〃，Cold Spring harbor Laboratory Press, 1985 ;Wagner 等，美國 專利第 4, 873, 191 號，Krimpenfort 等，美國專利第 5, 175, 384 號和 Krimpenfort 等， Biotechnology，9:88 (1991)中描述的標準方法，將包含轉基因的DNA構建體整合到轉基因 哺乳動物的基因組中。例如，可將轉基因顯微注射到非人類哺乳動物，例如小鼠、大鼠等的 合子原核中。將注射的這些胚胎移植到假孕雌性的輸卵管或子宮，由假孕雌性獲得創始哺 乳動物。創始哺乳動物（Fo)為轉基因（雜合）并且可與相同物種的非轉基因哺乳動物交 配以獲得比例為1:1的Fl非轉基因和轉基因后代。來自一個轉基因哺乳動物系的雜合子 哺乳動物可與來自不同轉基因哺乳動物系的雜合子哺乳動物雜交以產生在兩個基因座雜 合的哺乳動物。通過標準技術，例如聚合酶鏈式反應、DNA印跡測定或本領域已知的其它方 法鑒定基因組包含轉基因的哺乳動物。
[0053] 在一些情況下，編碼光響應性視蛋白的核苷酸序列與為細胞類型特異性表達轉基 因而提供的轉錄控制元件可操作連接。例如，在一些情況下，編碼光響應性視蛋白的核苷酸 序列與為神經元特異性表達轉基因而提供的控制元件（例如，啟動子）可操作連接。在一 些情況下，神經元特異性啟動子是為在一個亞型的神經元，例如多巴胺能神經元、興奮性神 經元、側前額葉皮質神經元等中表達轉基因而提供。示例性啟動子包括以上列出的啟動子。
[0054] 光響應件視蛋白
[0055] 光遺傳學指以為與功能完整的生物系統保持同步所需的瞬時精度（毫秒級），用 于控制活組織靶細胞中，甚至自由移動的哺乳動物或其它動物中的特定事件的遺傳和光學 方法的組合。光遺傳學需要向靶神經元細胞的質膜引入允許瞬時精確操縱神經元膜電位， 同時通過使用特異性靶向機制維持細胞類型分辨率的快速光響應性通道或泵蛋白。可用于 響應于光促進神經細胞膜超極化或去極化的任何微生物視蛋白均可使用。例如，鹽細菌視 紫紅質家族的光響應性氯泵（例如，NpHR、NpHR2. 0、NpHR3. 0、NpHR3. 1)和GtR3質子泵均可 用于響應于光促進神經細胞膜超極化。另外，視紫紅質通道蛋白家族的光響應性陽離子通 道蛋白的成員（例如，ChR2、SFO、SSFO、ClVl)可用于響應于光刺激促進神經細胞膜去極化 或去極化誘導的突觸損耗。
[0056] 光響應件氯泵
[0057] 在一些情況下，在非人類動物模型的神經細胞中表達的光響應性視蛋白為光敏離 子泵，例如光響應性氯泵。例如，光響應性氯泵的鹽細菌視紫紅質家族的一個或多個成員 在神經細胞的質膜上表達。在一些實施方案中，一種或多種光響應性氯泵在VTA中神經元 的質膜上表達。在其它實施方案中，一種或多種光響應性氯泵在mPFC中神經兀的質膜上表 達。
[0058] 在一些方面，在上述神經元質膜上表達的所述一種或多種光響應性氯泵蛋白可源 自鹽堿單孢菌（Natronomonas pharaonis)。在一些實施方案中，當用琥拍色光或紅光照射 光響應性氯泵蛋白時，光響應性氯泵蛋白可對琥珀色光以及紅光有響應性并且可在神經細 胞中介導超極化電流。可激活光響應性氯泵的光的波長可介于約580nm和630nm之間。在 一些實施方案中，所述光波長可為約589nm或所述光的波長可大于約630nm(例如小于約 740nm)。在另一實施方案中，所述光的波長為630nm左右。在一些實施方案中，光響應性氯 泵蛋白在暴露于連續光脈沖時可超極化神經膜至少約90min。在一些實施方案中，光響應 性氯泵蛋白可包含與SEQ ID N0:1中所示序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97(%、98 (%、99(%或100(%相同的氨基酸序列。另外，光響應性氯泵蛋白可包含引入天 然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入以增強或降低對光的敏感性，增強或降低對特定波 長的光的敏感性，和/或增強或降低光響應性蛋白調節細胞質膜極化狀態的能力。在一些 實施方案中，光響應性氯泵蛋白含有一個或多個保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，光 響應性蛋白含有一個或多個非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺 失和/或插入的光響應性蛋白適當地保留了響應于光使神經元細胞質膜超極化的能力。
[0059] 另外，在其它方面，光響應性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列和內 質網（ER)輸出信號序列。這種ER輸出信號序列可與核心氨基酸序列的C端融合或可與核 心氨基酸序列的N端融合。在一些實施方案中，ER輸出信號序列通過接頭與核心氨基酸序 列連接。所述接頭可包含長度約 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、 275、300、400或500個氨基酸的任何多個。所述接頭可進一步包含熒光蛋白，例如但不限于 黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，ER輸出 信號序列可包含氨基酸序列FXYENE (SEQ ID NO: 12)，其中X可為任何氨基酸。在另一實施 方案中，ER輸出信號序列可包含氨基酸序列可包含氨基酸序列VXXSL，其中X可為任何氨基 酸。在一些實施方案中，ER輸出信號序列可包含氨基酸序列FCYENEV(SEQ ID NO: 13)。
[0060] 適合用于經修飾視蛋白中的內質網（ER)輸出序列包括（例如）VXXSL(其 中 X 為任何氨基酸）（例如，VKESL(SEQ ID N0:14) ;VLGSL(SEQ ID N0:15)等）； NANSFCYENEVALTSK(SEQ ID N0:16);FXYENE(SEQ ID 勵：12;其中乂為任何氨基酸），例如 FCYENEV (SEQ ID NO: 13);等等。ER輸出序列的長度可為約5個氨基酸至約25個氨基酸， 例如約5個氨基酸至約10個氨基酸，約10個氨基酸至約15個氨基酸，約15個氨基酸至約 20個氨基酸，或約20個氨基酸至約25個氨基酸。
[0061] 在其它方面，在本發明的非人類動物模型的神經元中表達的光響應性氯泵蛋白 可包含在細胞膜上表達的光響應性蛋白，其中所述蛋白質包含與SEQ ID N0:1中所示序 列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心 氨基酸序列和運輸信號序列（例如，可增強光響應性氯泵蛋白向質膜的轉運的運輸信號 序列）。運輸信號序列可與核心氨基酸序列的C端融合或可與核心氨基酸序列的N端融 合。在一些實施方案中，運輸信號序列可通過接頭與核心氨基酸序列連接，所述接頭可包含 長度約 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨 基酸的任何多個。所述接頭可進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒 光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，運輸信號序列可源自人內向 整流鉀通道Kir2. 1的氨基酸序列。在其它實施方案中，運輸信號序列可包含氨基酸序列 KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID N0:17)。
[0062] 在一些方面，光響應性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和選自 以下，增強向哺乳動物細胞質膜的轉運的至少一個（例如1、2、3個或更多個）氨基酸序列 基序：ER輸出信號序列、信號肽和膜運輸信號序列。在一些實施方案中，光響應性氯泵蛋白 包含N端信號肽、C端ER輸出信號序列和C端運輸信號序列。在一些實施方案中，C端ER 輸出信號序和C端運輸信號序列可通過接頭連接。所述接頭可包含長度約5、10、20、30、40、 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸的任何多個。所述接 頭還可進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或 青色熒光蛋白。在一些實施方案中ER輸出信號序列可比運輸信號序列更靠近C端。在其 它實施方案中運輸信號序列比ER輸出信號序列更靠近C端。在一些實施方案中信號肽包 含氨基酸序列MTETLPPVTESAVALQAE(SEQ ID N0:18)。在另一實施方案中，光響應性氯泵蛋 白包含與SEQ ID N0:2至少95%相同的氨基酸序列。
[0063] 而且，在其它方面，光響應性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的核心氨基酸序列， 其中SEQ ID NO: 1的N端信號肽缺失或經取代。在一些實施方案中，可使用其它信號肽（例 如來自其它視蛋白的信號肽）。光響應性蛋白可進一步包含本文所述的ER轉運信號序列 和/或膜運輸信號序列。在一些實施方案中，光響應性氯泵蛋白包含與SEQ ID N0:3至少 95 %相同的氨基酸序列。
[0064] 在一些實施方案中，光響應性視蛋白為與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%、至 少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %相同的NpHR視蛋白。在一些實施方案中， NpHR視蛋白進一步包含內質網（ER)輸出信號序列和/或膜運輸信號序列。例如，NpHR視蛋 白包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%相同的氨基酸序列和內質網（ER)輸出信號序 列。在一些實施方案中，與SEQ ID N0:1中所示序列至少95%相同的氨基酸序列通過接頭 與ER輸出信號序列連接。在一些實施方案中，ER輸出信號序列包含氨基酸序列FXYENE (SEQ ID N0:12)，其中X可為任何氨基酸。在另一實施方案中，ER輸出信號序列包含氨基酸序 列VXXSL，其中X可為任何氨基酸。在一些實施方案中，ER輸出信號序列包含氨基酸序列 FCYENEV(SEQ ID N0:13)。在一些實施方案中，NpHR視蛋白包含與SEQ ID N0:1中所示序 列至少95%相同的氨基酸序列、ER輸出信號序列和膜運輸信號序列。在其它實施方案中， NpHR視蛋白從N端到C端包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%相同的氨基酸序列、 ER輸出信號序列和膜運輸信號序列。在其它實施方案中，NpHR視蛋白從N端到C端包含 與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%相同的氨基酸序列、膜運輸信號序列和ER輸出信號 序列。在一些實施方案中，膜運輸信號序列源自人內向整流鉀通道Kir2. 1的氨基酸序列。 在一些實施方案中，膜運輸信號序列包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQI D I N V(SEQ ID NO: 17)。在一些實施方案中，膜運輸信號序列通過接頭和與SEQ ID NO: 1 中所示序列至少95%相同的氨基酸序列連接。在一些實施方案中，膜運輸信號序列通過接 頭與ER輸出信號序列連接。所述接頭可包含長度約5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、 175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸的任何多個。所述接頭可進一步包含熒光 蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些 實施方案中，光響應性視蛋白進一步包含N端信號肽。在一些實施方案中，光響應性視蛋白 包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列。在一些實施方案中，光響應性視蛋白包含SEQ ID N0:3 的氨基酸序列。
[0065] 在一些情況下，包含與SEQ ID N0:1中所示序列至少約90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列、ER輸出信號序列和膜 運輸信號序列的光響應性蛋白可用于生成本公開的非人類動物模型。
[0066] 在美國專利申請公布第2009/0093403和2010/0145418號及國際專利公布第WO 2011/116238號中可找到關于光響應性氯泵蛋白的更多公開內容，其各自的公開內容據此 以引用的方式整體并入。
[0067] 光響應件質子泵
[0068] 在一些方面，在本公開的非人類動物模型的神經元質膜上表達一種或多種光響應 性質子泵。在一些實施方案中，光響應性質子泵蛋白可對藍光有響應性并且可源自藍隱藻 (Guillardia theta)，其中在用藍光照射細胞時所述質子泵蛋白能夠在細胞中介導超極化 電流。所述光的波長可介于約450和約495nm之間或波長可為約490nm。在其它實施方案 中，光響應性質子泵蛋白可包含與SEQ ID N0:4中所示序列至少約90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。光響應性質子泵蛋白可另外 包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入以增強或降低對光的敏感性，增強或降 低對特定波長的光的敏感性，和/或增強或降低光響應性質子泵蛋白調節細胞質膜極化狀 態的能力。另外，光響應性質子泵蛋白可含有一個或多個保守性氨基酸取代和/或一個或 多個非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入的光響應性 質子泵蛋白適當地保留了響應于光使神經元細胞質膜超極化的能力。
[0069] 在本文公開的方法的其它方面，光響應性質子泵蛋白可包含與SEQ ID N0:4中所 示序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核 心氨基酸序列和選自以下，增強向哺乳動物細胞質膜的轉運的至少一個（例如1、2、3個或 更多個）氨基酸序列基序：信號肽、ER輸出信號序列和膜運輸信號序列。在一些實施方案 中，光響應性質子泵蛋白包含N端信號肽和C端ER輸出信號序列。在一些實施方案中，光響 應性質子泵蛋白包含N端信號肽和C端運輸信號序列。在一些實施方案中，光響應性質子 泵蛋白包含N端信號肽、C端ER輸出信號序列和C端運輸信號序列。在一些實施方案中，光 響應性質子泵蛋白包含C端ER輸出信號序列和C端運輸信號序列。在一些實施方案中，C 端ER輸出信號序和C端運輸信號序列可通過接頭連接。所述接頭可包含長度約5、10、20、 30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸的任何多個。 所述接頭可進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋 白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中ER輸出信號序列比運輸信號序列更靠近C端。在 一些實施方案中運輸信號序列比ER輸出信號序列更靠近C端。
[0070] 在國際專利申請第PCT/US2011/028893號中可找到關于光響應性質子泵蛋白的 更多公開內容，其公開內容據此以引用的方式整體并入。
[0071] 光響應件陽離子通道蛋白
[0072] 在一些方面，在主題非人類動物模型的神經元質膜上表達一種或多種光響應性 陽離子通道。在一些方面，光響應性陽離子通道蛋白可源自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)，在用光照射細胞時所述陽離子通道蛋白能夠在細胞中介導去極化電流。在 另一實施方案中，光響應性陽離子通道蛋白可包含與SEQ ID N0:5中所示序列至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。用于激活 源自萊茵衣藻的光響應性陽離子通道蛋白的光的波長可介于約460和約495nm之間或波長 可為約480nm。另外，所述光的強度可為至少約100Hz。在一些實施方案中，用強度為IOOHz 的光激活源自萊茵衣藻的光響應性陽離子通道蛋白可引起去極化誘導的表達光響應性陽 離子通道的神經元的突觸損耗。光響應性陽離子通道蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列 的取代、缺失和/或插入以增強或降低對光的敏感性，增強或降低對特定波長的光的敏感 性，和/或增強或降低光響應性陽離子通道蛋白調節細胞質膜極化狀態的能力。另外，光響 應性陽離子通道蛋白可含有一個或多個保守性氨基酸取代和/或一個或多個非保守性氨 基酸取代。包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入的光響應性質子泵蛋白適當 地保留了響應于光使神經元細胞質膜去極化的能力。
[0073] 在美國專利申請公布第2007/0054319號和國際專利申請公布第WO 2009/131837 和TO 2007/024391號中可找到關于光響應性陽離子通道蛋白的更多公開內容，其各自的 公開內容據此以引用的方式整體并入。
[0074] 階躍函數視蛋白和穩定階躍函數視蛋白
[0075] 在一些情況下，光響應性陽離子通道蛋白可為階躍函數視蛋白（SFO)或穩定階躍 函數視蛋白（SSFO)，其可在蛋白質的整個視網膜結合口袋的關鍵位置具有特定氨基酸取 代。在一些實施方案中，SFO蛋白可在SEQ ID N0:5的氨基酸殘基C128處有突變。在其 它實施方案中，SFO蛋白在SEQ ID N0:5中具有C128A突變。在其它實施方案中，SFO蛋白 在SEQ ID N0:5中具有C128S突變。在另一實施方案中，SFO蛋白在SEQ ID N0:5中具有 C128T突變。在一些實施方案中，SFO蛋白可包含與SEQ ID N0:6中所示序列至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的氨基酸序列。
[0076] 在一些實施方案中，SSFO蛋白可在SEQ ID N0:5的氨基酸殘基D156處有突變。 在其它實施方案中，SSFO蛋白可在SEQ ID N0:5的氨基酸殘基C128和D156處有突變。在 一個實施方案中，SSFO蛋白在SEQ ID N0:5中具有C128S和D156A突變。在另一實施方案 中，SSFO蛋白可包含與SEQ ID N0:7中所示序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
[0077] 在一些實施方案中，在用藍光照射細胞時SFO或SSFO蛋白能夠在細胞中介導去極 化電流。在其它實施方案中，所述光的波長可為約445nm。另外，光的強度可為約100Hz。。 在一些實施方案中，用強度為IOOHz的光激活SFO或SSFO蛋白可引起去極化誘導的表達 SFO或SSFO蛋白的神經元的突觸損耗。在一些實施方案中，公開的每種階躍視蛋白和穩定 階躍視蛋白可具有用于響應于光使神經元細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0078] 在國際專利申請公布第WO 2010/056970號和美國臨時專利申請第61/410, 704和 61/511，905號中可找到關于SFO或SSFO蛋白的更多公開內容，其各自的公開內容據此以引 用的方式整體并入。
[0079] ClVl嵌合陽離子通道
[0080] 在一些情況下，光響應性陽離子通道蛋白可為源自團藻（Volvox carteri)的 VChRl蛋白和來自萊茵衣藻的ChRl蛋白的ClVl嵌合蛋白，其中所述蛋白質包含至少第一和 第二跨膜螺旋經ChRl的第一和第二跨膜螺旋置換的VChRl氨基酸序列；對光有響應性；并 且在用光照射細胞時能夠在細胞中介導去極化電流。在一些實施方案中，ClVl蛋白可在位 于嵌合光響應性蛋白的第二和第三跨膜螺旋之間的細胞內環狀結構域中進一步包含置換， 其中至少一部分細胞內環狀結構域經來自ChRl的相應部分置換。在另一實施方案中，ClVl 嵌合蛋白的細胞內環狀結構域的所述部分可經來自ChRl的延伸到ChRl的氨基酸殘基A145 的相應部分置換。在其它實施方案中，ClVl嵌合蛋白可在嵌合光響應性蛋白的第三跨膜螺 旋中進一步包含置換，其中至少一部分第三跨膜螺旋經ChRl的相應序列置換。在再一實施 方案中，ClVl嵌合蛋白的細胞內環狀結構域的所述部分可經來自ChRl的延伸到ChRl的氨 基酸殘基W163的相應部分置換。在其它實施方案中，ClVl嵌合蛋白可包含與SEQ ID N0:8 中所示序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同 的氨基酸序列。
[0081] 在一些實施方案中，在用綠光照射細胞時ClVl蛋白可在細胞中介導去極化電流。 在其它實施方案中，所述光的波長可介于約540nm和約560nm之間。在一些實施方案中，所 述光的波長可為約542nm。在一些實施方案中，在用紫光照射細胞時ClVl嵌合蛋白不能夠 在細胞中介導去極化電流。在一些實施方案中，在用波長為約405nm的光照射細胞時ClVl 嵌合蛋白不能夠在細胞中介導去極化電流。另外，所述光的強度可為約100Hz。在一些實施 方案中，用強度為IOOHz的光激活ClVl嵌合蛋白可引起去極化誘導的表達ClVl嵌合蛋白 的神經元的突觸損耗。在一些實施方案中，公開的ClVl嵌合蛋白可具有用于響應于光使神 經元細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0082] ClVl嵌合突奪奪體
[0083] 在一些適合使用的光響應性視蛋白中可包含經取代或突變的氨基酸序列，其中突 變多肽保留了前體ClVl嵌合多肽的特征光響應特性，但是也可能具有在某些特定方面改 變的性質。例如，突變光響應性ClVl嵌合蛋白可表現出在動物細胞內或在動物細胞質膜上 表達水平升高；當暴露于不同波長的光，特別是紅光時響應性改變；和/或性狀組合，從而 嵌合ClVl多肽具有低脫敏作用、快速失活、低紫光激活，以致與其它光響應性陽離子通道 中交叉激活作用最低，和/或在動物細胞中強烈表達的性質。
[0084] 例如，在嵌合多肽VChRl部分的整個視網膜結合口袋的關鍵位置具有特定氨基酸 取代ClVl嵌合光響應性視蛋白適合使用。在一些實施方案中，ClVl蛋白可在SEQ ID N0:7 的氨基酸殘基E122處有突變。在一些實施方案中，ClVl蛋白可在SEQ ID N0:7的氨基酸 殘基E162處有突變。在其它實施方案中，ClVl蛋白可在SEQ ID N0:7的氨基酸殘基E122 和E162處有突變。在其它實施方案中，ClVl蛋白可包含與SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10或 SEQ ID N0:11 中所示序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，公開的每種突變ClVl嵌合蛋白可具有用 于響應于光使動物細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0085] 在一些方面，在用光照射細胞時C1V1-E122突變嵌合蛋白能夠在細胞中介導去 極化電流。在一些實施方案中，所述光可為綠光。在其它實施方案中，所述光的波長可介 于約540nm至約560nm之間。在一些實施方案中，所述光的波長可為約546nm。在其它實 施方案中，在用紅光照射細胞時C1V1-E122突變嵌合蛋白可以在細胞中介導去極化電流。 在一些實施方案中，紅光的波長可為約630nm。在一些實施方案中，在用紫光照射細胞時 C1V1-E122突變嵌合蛋白未在細胞中介導去極化電流。在一些實施方案中，在用波長為約 405nm的光照射細胞時嵌合蛋白未在細胞中介導去極化電流。另外，所述光的強度可為約 100Hz。在一些實施方案中，用強度為IOOHz的光激活C1V1-E122突變嵌合蛋白可引起去極 化誘導的表達C1V1-E122突變嵌合蛋白的神經元的突觸損耗。在一些實施方案中，公開的 C1V1-E122突變嵌合蛋白可具有用于響應于光使神經元細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0086] 在其它方面，在用光照射細胞時C1V1-E162突變嵌合蛋白能夠在細胞中介導去極 化電流。在一些實施方案中，所述光可為綠光。在其它實施方案中，所述光的波長可介于約 540nm至約535nm之間。在一些實施方案中，所述光的波長可為約542nm。在其它實施方案 中，所述光的波長可為約530nm。在一些實施方案中，在用紫光照射細胞時C1V1-E162突變 嵌合蛋白未在細胞中介導去極化電流。在一些實施方案中，在用波長為約405nm的光照射 細胞時嵌合蛋白未在細胞中介導去極化電流。另外，所述光的強度可為約100Hz。在一些 實施方案中，用強度為100Hz的光激活C1V1-E162突變嵌合蛋白可引起去極化誘導的表達 C1V1-E162突變嵌合蛋白的神經元的突觸損耗。在一些實施方案中，公開的C1V1-E162突變 嵌合蛋白可具有用于響應于光使神經元細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0087] 還有其它方面，在用光照射細胞時C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白能夠在細胞中 介導去極化電流。在一些實施方案中，所述光可為綠光。在其它實施方案中，所述光的波長 可介于約540nm至約560nm之間。在一些實施方案中，所述光的波長可為約546nm。在一些 實施方案中，在用紫光照射細胞時C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白未在細胞中介導去極化 電流。在一些實施方案中，在用波長為約405nm的光照射細胞時嵌合蛋白未在細胞中介導 去極化電流。在一些實施方案中，當暴露于紫光時，相對于在E122/E162沒有突變的ClVl 嵌合蛋白或相對于其它光響應性陽離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白可表現出 更低的激活作用。另外，所述光的強度可為約100Hz。在一些實施方案中，用強度為IOOHz 的光激活C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白可引起去極化誘導的表達C1V1-E122/E162突變嵌 合蛋白的神經元的突觸損耗。在一些實施方案中，公開的C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白可 具有用于響應于光使神經元細胞膜去極化的特定性質和特征。
[0088] 在美國臨時專利申請第61/410, 736、61/410, 744和61/511,912號中可找到關于 ClVl嵌合陽離子通道及其突變變體的更多公開內容，其各自的公開內容據此以引用的方式 整體并入。
[0089] 序歹1丨
[0090] 無信號肽的NpHR的氨基酸序列：
[0091] VTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLAS GLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGL AAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEffAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVffALGVEGIAVLPV GVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADD(SEQ ID NO ：1)
[0092] eYFP_NpHR3. 0 的氨基酸序列：
[0093] MTETLPPVTESAVALQAEVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAV STILVPVVSIASYTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNA TKLFTAITFDIAMCVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWL GYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITS EGEYIPLDQIDINVVSKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGE⑶ATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTT FGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKi^E⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHK LEYNYNSHNVYMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDH MVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYIENEV(SEQ ID NO ：2)
[0094] eYFP_NpHR3. 1 的氨基酸序列：
[0095] MVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLA SGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTffALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTG LAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEffAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVffALGVEGIAVLP VGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRTTSEGEYIPLDQIDINVVSK GEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQ HDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKi 7E⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQ KNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMD ELYKFCYENEV(SEQ ID NO :3)
[0096] GtR3的氨基酸序列：
[0097] ASSFGKALLEFVFIVFACITLLLGINAAKSKAASRVLFPATFVTGIASIAYFSMASGGGWVIAPDCRQL FVARYL
[0098] DWLITTPLLLIDLGLVAGVSRWDIMALCLSDVLMIATGAFGSLTVGNVKffVffffFFGMCffFLHIIFALG KSWAEAAKAKGGDSASVYSKIAGITVITWFCYPVVWVFAEGFGNFSVTFEVLIYGVLDVISKAVFGLILMSGAATG YESI (SEQ ID NO:4)
[0099] ChR2的氨基酸序列：
[0100] MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLM FYAYQTffKSTCGffEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSND YSRRTMGLLVSDIGTIVffGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAffLF FVSffGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCffGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEI EVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO :5)
[0101] SFO的氨基酸序列：
[0102] MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLM FYAYQTffKSTCGffEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQffLRYAEffLLTSPVILIHLSNLTGLSND YSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLF FVSffGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCffGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEI EVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO ：6)
[0103] SSFO的氨基酸序列：
[0104] MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLM FYAYQTffKSTCGffEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQffLRYAEffLLTSPVILIHLSNLTGLSND YSRRTMGLLVSAIGTIVffGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAffLF FVSffGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCffGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEI EVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO :7)
[0105] ClVl的氨基酸序列：
[0106] MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPN NGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTffKSTCGffEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGffTKILFFLISLSY GMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRCLVRVMAffTFFVAffGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWG VLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:8)
[0107] ClVl (E122T)的氨基酸序列：
[0108] MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPN NGQCFVLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTffKSTCGffETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGffTKILFFLISLSY GMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWG VLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:9)
[0109] ClVl (E162T)的氨基酸序列：
[0110] MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPN NGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTffKSTCGffEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGffTKILFFLISLSY GMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWG VLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:10)
[0111] ClVl (E122T/E162T)的氨基酸序列：
[0112] MSRRPffLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYT LENNGSVICIP NNGQCFCLAffLKSNGTNAEKLAANILQffITFALSALCLMFYGYQTffKS TCGffETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEP AVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNL TGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLIS LSYGMYTYFHAAKVY IEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAK NMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO ：11)
[0113] 籃飾
[0114] 光響應性視蛋白可包含各種修飾，例如添加一個或多個增強相哺乳動物細胞質膜 的轉運的氨基酸序列基序。哺乳動物細胞可能不表達或耐受具有源自進化較簡單的生物的 組分的光響應性視蛋白或在哺乳動物細胞中高水平表達時可能表現出亞細胞定位受損。因 此，在一些實施方案中，細胞中表達的光響應性視蛋白可與選自信號肽、內質網（ER)輸出 信號序列、膜運輸信號序列和/或N端高爾基輸出信號序列的一個或多個氨基酸序列基序 融合。增強光響應性蛋白向哺乳動物細胞質膜轉運的所述一個或多個氨基酸序列基序可與 光響應性蛋白的N端、C端或N端和C端融合。任選地，光響應性蛋白和所述一個或多個氨 基酸序列基序可被接頭分開。在一些實施方案中，可通過添加增強蛋白質向細胞質膜的轉 運的運輸信號序列（ts)修飾光響應性蛋白。在一些實施方案中，運輸信號序列可源自人內 向整流鉀通道Kir2. 1的氨基酸序列。在其它實施方案中，運輸信號序列可包含氨基酸序列 KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID N0:17)。
[0115] 適合使用的運輸序列可包含與諸如人內向整流鉀通道Kir2. 1的運輸序列（例 如 KSRITSEGEYIPLDQIDINV;SEQ ID N0:17)的氨基酸序列有 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0116] 運輸序列的長度可從約10個氨基酸至約50個氨基酸，例如從約10個氨基酸至約 20個氨基酸，從約20個氨基酸至約30個氨基酸，從約30個氨基酸至約40個氨基酸，或從 約40個氨基酸至約50個氨基酸。
[0117] 適合使用的信號序列可包含與例如下列之一的氨基酸序列有90^^91^^92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
[0118] DhChR2 的信號肽（例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS ;SEQ ID N0:19);
[0119] 2)神經元煙堿型乙酰膽堿受體的β 2亞基信號肽（例如， MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF ；SEQ ID NO:20)；
[0120] 3)煙堿型乙酰膽堿受體信號序列（例如，MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG ; SEQ ID NO:21);和
[0121] 4)煙堿型乙酰膽堿受體信號序列（例如，MRGTPLLLVVSLFSLLQD ;SEQ ID N0:22)。
[0122] 信號序列的長度可從約10個氨基酸至約50個氨基酸，例如從約10個氨基酸至約 20個氨基酸，從約20個氨基酸至約30個氨基酸，從約30個氨基酸至約40個氨基酸，或從 約40個氨基酸至約50個氨基酸。
[0123] 適合用于本公開的經修飾視蛋白中的內質網（ER)輸出序列包括（例如） VXXSL(其中 X為任何氨基酸）（例如，VKESL(SEQ ID N0:14)、VLGSL(SEQ ID N0:15)等）； NANSFCYENEVALTSK(SEQ ID N0:16) ;FXYENE(SEQ ID N0:12)其中 X 為任何氨基酸），例如， FCYENEV (SEQ ID NO: 13);等等。ER輸出序列的長度可從約5個氨基酸至約25個氨基酸， 例如約5個氨基酸至約10個氨基酸，約10個氨基酸至約15個氨基酸，約15個氨基酸至約 20個氨基酸，或約20個氨基酸至約25個氨基酸。
[0124] 在美國專利申請第12/041,628號中公開了另外的可增強光響應性蛋白向細胞質 膜轉運的蛋白質基序，其以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，蛋白質中的信號 肽序列可缺失或經來自不同蛋白質的信號肽序列取代。
[0125] 融僉
[0126] 在一些情況下，光活化視蛋白為融合蛋白，例如光活化視蛋白包含例如在氨基末 端和/或羧基末端和/或光活化視蛋白內的異源氨基酸（例如，融合伴侶）。例如，融合蛋 白可包括光活化視蛋白和融合伴侶，其中適合的融合伴侶包括酶、熒光蛋白、表位標簽等。
[0127] 可與主題抗體連接的適合熒光蛋白包括但不限于來自維多利亞多管發光水 母（Aequoria victoria)的綠色突光蛋白（GFP)或其突變體或衍生物，例如美國專利 第 6, 066, 476、6, 020, 192、5, 985, 577、5, 976, 796、5, 968, 750、5, 968, 738、5, 958, 713、 5, 919, 445、5, 874, 304號中所述，例如增強型GFP，許多此類GFP市場上可買到，例如來自 Clontech，Inc.;紅色熒光蛋白；黃色熒光蛋白（YFP);來自珊瑚物種的多種熒光和有色蛋 白的任一種，例如 Matz 等（1999) Nature Biotechnol. 17:969-973 中所述；mCherry ;增強型 GFP、增強型YFP ;等等。
[0128] 核酸
[0129] 包含編碼光響應性蛋白的核苷酸序列的多核苷酸可用于生成主題非人類動物模 型。在一些實施方案中，多核苷酸包含表達盒。在一些實施方案中，多核苷酸為包含上述核 酸的載體。在一些實施方案中，編碼光響應性視蛋白的核酸與啟動子可操作連接。啟動子 在本領域中眾所周知。在宿主細胞中起作用的任何啟動子均可用于表達光響應性視蛋白和 /或其任何變體。在一個實施方案中，用于驅動光響應性視蛋白表達的啟動子可為對多巴胺 能神經元有特異性的啟動子。在其它實施方案中，所述啟動子能夠驅動光響應性視蛋白在 興奮性神經元中表達。對驅動光響應性視蛋白或其變體在特定動物細胞中表達有用的起始 控制區或啟動子有許多并且為本領域的技術人員熟知。實際上可以使用能夠驅動這些核酸 的任何啟動子。
[0130] 在本領域中已知神經元特異性啟動子和其它控制元件（例如，增強子）。適 合的神經元特異性控制序列包括但不限于神經元特異性烯醇酶（NSE)啟動子（見，例 如，EMBL HSEN02、X51956);芳香族氨基酸脫羧酶（AADC)啟動子；神經絲啟動子（見， 例如，GenBank HUMNFL, L04147);突觸蛋白（synapsin)啟動子（見，例如，GenBank HUMSYNIB，M55301) ;thy-l 啟動子（見，例如，Chen 等（1987)Cell51:7-19 JPLlewellyn 等（2010)Nat. Med. 16(10) :1161-1166);血清素受體啟動子（見，例如，GenBank S62283); 酪氨酸羥化酶啟動子（TH)(見，例如，Oh 等（2009)Gene Ther 16:437 ;Sasaoka 等（1992) Mol. Brain Res. 16:274 ;Boundy 等（1998) J. Neurosci. 18:9989;和 Kaneda 等（1991) Neuron 6:583-594) ;GnRH 啟動子（見，例如，Radovick 等（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406) ;L7 啟動子（見，例如，Oberdick 等（1990)Science 248:223-226) ;DNMT 啟 動子（見，例如，Bartge 等（I988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652);腦啡肽啟動 子（見，例如，Comb等（1988)EMBO J. 17:3793-3805);髓鞘堿性蛋白（MBP)啟動子；Ca2+-鈣 調素依賴型蛋白激酶Π-a (CamKIIa)啟動子（見，例如，Mayford等（1996)?1"〇(：.似七1· Acad. Sci. USA 93:13250 ;和 Casanova 等（2001) Genesis 31:37);和 CMV 增強子 / 血小板 源生長因子-β啟動子（見，例如，Liu等（2004)Gene Therapy 11:52-60)。
[0131] 在一些實施方案中，用于驅動光響應性蛋白表達的啟動子可為Thy 1啟動 子，其能夠驅動轉基因在神經元中穩健表達（見，例如，Llewellyn等（2010) Nat. Med. 16(10) :1161-1166)。在其它實施方案中，用于驅動光響應性蛋白表達的啟動子可為 EFla啟動子、巨細胞病毒（CMV)啟動子、CAG啟動子、突觸蛋白啟動子或能夠驅動光響應性 視蛋白在哺乳動物神經元中表達的任何其它普遍存在的啟動子。
[0132] 在一些情況下，核酸為包含轉基因（例如本文所述編碼光響應性蛋白的核苷酸序 列或其任何變體）的表達載體。可施用的載體包括包含編碼在由載體的多核苷酸轉錄時， 會導致光響應性視蛋白在動物靶細胞質膜上積聚的RNA(例如，mRNA)的核苷酸序列的載 體。可使用的載體包括但不限于慢病毒、單純皰疹病毒（HSV)、腺病毒和腺相關病毒（AAV) 載體。慢病毒包括但不限于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIAV。慢病毒可能經其它病毒的包 膜蛋白假型化，包括但不限于VSV、狂犬病、Mo-MLV、桿狀病毒和埃博拉病毒（Ebola)。可使 用本領域的標準方法制備此類載體。
[0133] 在一些實施方案中，所述載體為重組AAV載體。AAV載體為尺寸相對較小，可以穩 定且定點的方式整合到其感染的細胞基因組中的DNA病毒。AAV載體能夠感染大范圍的細 胞，而不引起對細胞生長、形態或分化的任何影響，并且其似乎不牽涉人體病理學。已經克 隆、測序和表征了 AAV基因組。其涵蓋大約4700個堿基并且每個末端含有用作病毒復制起 點的大約145個堿基的反向末端重復（ITR)區。基因組其余部分分為兩個帶有衣殼化功能 的基本區域：基因組左手部分，其含有涉及病毒復制和病毒基因表達的rep基因；和基因組 右手部分，其含有編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
[0134] 可使用本領域的標準方法制備AAV載體。任何血清型的腺相關病毒均適合（見， 例如，Blacklow，"Parvoviruses and Human Disease"的第 165-174 頁，J.R. Pattison 編 輯(1988) ;Rose，Comprehensive Virology 3:1,1974 ;Ρ· Tattersall "The Evolution of Parvovirus Taxon omy〃In Parvoviruses(JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Lind en，CR Parrish 編輯）第 5_14 頁，Hudder Arnold, London, UK (2〇〇6);和 DE Bowles、JE Rabinowitz>RJ Samulski^The Genus Dependovi rus〃（JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish 編輯）第 15-23 頁，Hudder Arnold, London, UK(2006)，其各自的公 開內容據此以引用的方式整體并入本文）。例如，在美國專利第6, 566, 118、6, 989, 264和 6, 995, 006 號和標題為"Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors〃的W0/1999/011764中可找到純化載體的方法，其公開內容 以引用的方式整體并入本文。例如，在PCT公布第PCT/US2005/027091號中描述了雜交載 體的制備，其公開內容以引用的方式整體并入本文。
[0135] 已經描述了源自AAV的載體用于體外和體內轉染基因的用途（見例如，國際專利 申請公布第 91/18088 和 WO 93/09239 號；美國專利第 4, 797, 368、6, 596, 535 和 5, 139, 941 號；和歐洲專利第0488528號，其公開內容據此以引用的方式整體并入本文）。這些出版物 描述了其中rep和/或cap基因缺失且經目標基因置換的各種AAV源構建體和這些構建體 用于體外（轉染到培養的細胞中）或體內（直接轉染到生物體內）轉染目標基因的用途。 可通過將含有兩側為兩個AAV反向末端重復（ITR)區的目標核酸序列的質粒和攜帶AAV衣 殼化基因（rep和cap基因）的質粒共轉染至經人類輔助病毒（例如腺病毒）感染的細胞 系中制備根據本發明所述的復制缺陷型重組AAV。然后通過標準技術純化生成的AAV重組 體。
[0136] 在一些實施方案中，用于生成主題非人類動物模型的載體衣殼化為病毒顆粒（例 如，AAV 病毒顆粒，包括但不限于 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5, AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)。生成此類顆粒的方法在本領域已知 并且在美國專利第6, 596, 535號中有描述，其公開內容據此以引用的方式整體并入。
[0137] 光響應性視蛋白的遞送
[0138] 在一些方面，用針、導管或相關裝置，使用本領域已知的神經外科技術，例 如通過立體定位注射（見，例如，Stein 等，J. Virol, 73:34243429, 1999 ;Davidson 等，PNAS, 97:3428-3432, 2000 ;Davidson 等，Nat. Genet. 3:219-223, 1993 ;和 Alisky&Davidson, Hum. Gen e Ther. 11:2315-2329,2000,其各自的內容據此以引用的方式 整體并入）或熒光透視法將編碼本文公開的光響應性視蛋白的多核苷酸（例如，AAV載體） 直接遞送到目標神經元中（例如，腹側被蓋區（VTA)的多巴胺能神經元；內側前額葉皮質 (mPFC)的興奮性（谷氨酸能）神經元）。在一些實施方案中，可將編碼本文公開的光響應 性視蛋白的多核苷酸（例如，AAVl載體）遞送到VTA的多巴胺能神經元。在其它實施方案 中，可將編碼本文公開的光響應性視蛋白的多核苷酸（例如，AAV載體）遞送到mPFC的興 奮性（谷氨酸能）神經元。
[0139] 在一些方面，可用針、導管或相關裝置，使用本領域已知的神經外科技術，例如通 過立體定位注射或熒光透視法將編碼本文公開的光響應性視蛋白的多核苷酸（例如，AAV 載體）直接遞送到目標神經元。
[0140] 將光響應性視蛋白遞送到目標神經元的其它方法也可使用，例如但不限于用離子 脂質或聚合物轉染；電穿孔；光轉染；穿刺轉染（例如，使用納米材料例如碳納米纖維、碳納 米管、納米線等；見，例如，Melechko 等（2004)Nano Letters 4(7):第 1213-1219 頁）；或經 由基因槍。
[0141] 在一些實施方案中，使用病毒載體，例如腺病毒、AAV2和狂犬病毒糖 蛋白假型慢病毒，其中病毒載體為肌肉細胞吸收并且向后轉運到神經元（見， 例如，Azzouz 等，2009, Antioxid Redox Signal. ,11 (7):1523-34 ;Kaspar 等， 2003, Science, 301 (5634) : 839-842 ;Manabe 等，2002. Apoptosis, 7 (4) : 329-334)。
[0142] 光源和電源
[0143] 在本發明的一些方面，可用置于表達光響應性視蛋白的神經元或控制此類神經元 的神經周圍或附近的可植入光源（例如光袖套）或可植入電極激活本文公開的光響應性視 蛋白。用外科手術置于神經周圍或附近用于電刺激那些神經的電極袖套和電極在本領域眾 所周知（見，例如，美國專利第4, 602, 624、7, 142, 925和6, 600, 956號以及美國專利公布第 2008/0172116和2010/0094372號，其各自的公開內容據此以引用的方式整體并入）。正如 本領域中所知，光源（例如光袖套）或電極可由任何有用組成或組成混合物構成，例如鉬或 不銹鋼，并且可能具有刺激在神經元或控制此類神經元的神經中表達的光響應性視蛋白的 任何有用構造。例如，在mPFC的興奮性（谷氨酸能）神經元中表達光響應性視蛋白時，光 源可用于將光引到表達光響應性視蛋白的mPFC興奮性（谷氨酸能）神經元上；或光源可用 于將光引到為來自mPRC的幾個投射靶標之一的中縫背核（DRN)上。
[0144] 可將電極或可植入光源（例如光袖套）置于表達光響應性視蛋白的神經元（例 如，VTA的多巴胺能神經元或mPFC的興奮性神經元）周圍或附近；或可將電極或可植入光 源置于DRN周圍或附近。本領域的技術人員可在使用本領域的已知技術將電極或可植入光 源置于腦部區域周圍或附近之前，鑒定適合放置電極或可植入光源的腦部區域。
[0145] 可植入光源（例如光袖套）可包含內體，所述內體具有為電源配置的至少一個發 光裝置。在一些實施方案中，電源可以是為發光裝置供電的內置電池。在另一實施方案中， 可植入光源可包含用于接收來自為發光裝置供電的外置電源的無線傳輸電磁能的外置天 線。無線傳輸電磁能可為無線電波、微波或可從外置電源傳輸為可植入光源（例如光袖套） 的發光裝置供電的任何其它電磁能。在一個實施方案中，通過使用半導體或本領域已知的 其它工藝生產的集成電路控制發光裝置。
[0146] 在一些方面，發光裝置可為發光二極管（LED)。在一些實施方案中，LED可產生藍 光和/或綠光。在其它實施方案中，LED可產生琥珀色光和/或黃光。在一些實施方案中， 將幾個微型LED嵌入可植入光源（例如光袖套）的內體中。在其它實施方案中，發光裝置 為固體激光二極管或能夠發光的任何其它裝置。發光裝置可產生強度足以激活在接近光源 (例如光袖套）的神經質膜上表達的光響應性視蛋白的光。在一些實施方案中，發光裝置產 生強度為約 〇· 〇5mW/mm2、0. lmW/mm2、0. 2mW/mm2、0. 3mW/mm2、0. 4mW/mm2、0. 5mW/mm2、約 0· 6mW/ mm2、約 0· 7mW/mm2、約 0· 8mW/mm2、約 0· 9mW/mm2、約 I. OmW/mm2、約 I. lmW/mm2、約 I. 2mW/mm2、約 I. 3mW/mm2、約 I. 4mW/mm2、約 I. 5mW/mm2、約 I. 6mW/mm2、約 I. 7mW/mm2、約 I. 8mW/mm2、約 I. 9mW/ mm2、約 2. OmW/mm2、約 2. lmW/mm2、約 2. 2mW/mm2、約 2. 3mW/mm2、約 2. 4mW/mm2、約 2. 5mW/mm2、約 3mW/mm2、約 3. 5mW/mm2、約 4mW/mm2、約 4. 5mW/mm2、約 5mW/mm2、約 5. 5mW/mm2、約 6mW/mm2、約 7mW/mm2、約8mW/mm2、約9mW/mm 2或約10mW/mm2的任一值，包括這些數字之間的值的光。在 其它實施方案中，發光裝置產生強度為至少約IOOHz的光。
[0147] 在一些方面，可在外部用外置控制器激活發光裝置。外置控制器可包含可以固定 到發射線圈的發電機。在外置控制器的一些實施方案中，電池可與發電機連接以為其提 供電力。開關可與發電機連接，允許個人手動激活或停用發電機。在一些實施方案中，開 關激活后，發電機可通過外置控制器上的發射線圈與可植入光源（例如光袖套）的外置 天線之間的電磁耦合為光源上的發光裝置提供電力。發射線圈可在接近時建立與可植入 光源外置天線的電磁耦合，為發光裝置供給電力和向可植入光源發射一個或多個控制信 號。在一些實施方案中，外置控制器的發射線圈與可植入光源（例如光袖套）的外置天線 之間的電磁耦合可為射頻磁電感耦合。當使用射頻磁電感耦合時，無線電波的工作頻率可 介于約1和20MHz之間，包括這些數字之間的任何值（例如，約1MHz、約2MHz、約3MHz、約 4MHz、約 5MHz、約 6MHz、約 7MHz、約 8MHz、約 9MHz、約 IOMHz、約 I IMHz、約 12MHz、約 13MHz、 約14MHz、約15MHz、約16MHz、約17MHz、約18MHz、約19MHz或約20MHz)。然而，可使用其它 奉禹合技術，例如光接收器、紅外線或生物醫學遙測系統（見，例如，Kiourti, "Biomedical Telemetry:Communication between Implanted Devices and the External World, Optic onl826, (8) : Spring, 2010) 〇
[0148] 篩選方法
[0149] 本公開提供了鑒定治療哺乳動物抑郁癥的試劑的方法。本公開還提供了鑒定在抑 郁癥治療中用于治療性干預的試劑的方法。本公開還提供了鑒定正在研發用于病癥治療的 藥物的方法，所述藥物可在個體中誘導抑郁癥。
[0150] 如本文所使用，術語"測定"指定性和定量測定并且同樣，術語"測定"在本文中可 與"分析"、"測量"等交換使用。
[0151] 術語"候選試劑"、"試驗試劑"、"試劑"、"物質"和"化合物"在本文中可交換使 用。候選試劑涵蓋許多化學類別，通常為合成、半合成或自然存在的無機或有機分子。候選 試劑包括在大型合成或天然化合物庫中發現的試劑。例如，合成化合物庫可從Maybridge Chemical Co. (TreviIlet,CornwalI, UK)> ComGenex(South San Francisco, CA)和 MicroSource (New Milford, CT)購買得到。罕見化學庫可從 Aldri ch (Milwaukee, Wis.)得 到并且也可使用。可選地，呈細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫可從Pan Labs (Bothell, WA)得到或易于生產。
[0152] 候選試劑可為分子量大于50D且小于約2, 500D的小分子有機或無機化合物。候 選試劑可包含與蛋白質結構相互作用，例如氫鍵結合所必需的官能團，并且可能包括至少 一個胺基、羰基、羥基或羧基，并且可能含有至少兩個化學官能團。候選試劑可包含環碳或 雜環結構和/或經以上一個或多個官能團取代的芳香或多環芳香結構。在包括肽、糖類、月旨 肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶及其衍生物、結構類似物或組合在內的生物分子中發現候選試劑。
[0153] 本公開的測定法包括對照，其中適合的對照包括已經暴露于激活光，但尚未施用 所述試劑的主題非人類動物模型。
[0154] 主題篩選方法也可用于分析試驗試劑對多種不良心理和生理狀態的任一種的影 響，包括但不限于煩躁不安、抑郁、快感缺失、自殺、激動、焦慮、藥物成癮戒斷癥狀等。在一 些情況下，將減輕或緩和不良狀態的試驗試劑視為治療心境障礙（例如，重性抑郁癥（即， 單相障礙）、躁狂、煩躁不安、雙相障礙、心境惡劣、躁郁癥等）的候選試劑。因此，雖然在本 公開中討論了抑郁癥，但是主題篩選方法可用于分析試驗試劑對多種不良狀態的任一種的 影響；并且鑒定的試驗試劑可視為治療多種心境障礙的任一種和其它不良心理和生理狀態 的候選試劑。
[0155] 非人類動物模型中抑郁癥的癥狀包括（例如）逃避相關行為減輕、焦慮和應 激。對抑郁癥和/或焦慮和/或應激的試驗包括強迫游泳試驗（FST)(見，例如，Porsolt 等（1977)Nature 266:730;和 Petit-Demouliere,等（2005)Psychopharmacology 177:245);懸尾試驗（見，例如，Cryan 等（2005)Neurosci. Behav. Rev. 29:571 ;和 Li 等（2〇01)Neuropharmacol.40:l〇28);條件性位置厭惡（見，例如，Bechtholt-Gompf 等 (2〇10)Neuropsychopharmacol. 35:2〇49);新穎節食試驗（Dulawa,等（2〇〇 5)Neurosci. Biobehav. Rev. 29:771);社會失敗應激試驗（見，例如，Blanchard 等（2001)Physiol Behav. 73:261 - 271 ;和 Kudryavtseva 等（1991) Pharmacol. Biochem. Behav. 38:315);糖水 偏好試驗（見，例如，Kurre Nielsen,等（2000)Behavioural Brain Research 107:21-33); 曠場試驗（見，例如，Holmes (2001) Neurosci. Biobehav. Rev. 25:261 - 273);高架十字迷宮 試驗（見，例如，Holmes (2001)同上）；等等。任何此類試驗均可用于主題篩選方法中。
[0156] 鑒定適合治療抑郁癥的試劑的方法
[0157] 本公開提供了鑒定治療抑郁癥的候選試劑的方法。在一些情況下，所述方法通常 包括：a)使在腹側被蓋區（VTA)多巴胺能（DA)神經元中表達光響應性視蛋白的主題非人 類動物（例如，諸如大鼠或小鼠的嚙齒動物）與試驗試劑接觸，和b)將抑郁癥測定中嚙齒 動物的行為與尚未接觸試驗試劑的對照嚙齒動物的行為比較。接觸了試驗試劑的嚙齒動物 的抗抑郁行為表明試驗試劑是治療抑郁癥的候選物。
[0158] 軺極化VTA的DA神經元中表汰的視蛋白
[0159] 在一些情況下，具有神經元活性的活性光遺傳抑制因子（光響應性視蛋白）為在 VTA處或附近用光激活時促進DA神經元超極化的鹽細菌視紫紅質（例如，NpHR)。DA神經 元的超極化抑制這些神經元的活性。用光激活光響應性視蛋白時，非人類動物模型表現出 抑郁特征。向非人類動物模型施用試驗試劑。當VTA的DA神經元暴露于激活光響應性視 蛋白的波長的光（例如，琥珀色光）時，為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑將改善非人類 動物模型抑郁癥的至少一種癥狀。
[0160] 因此，在一些情況下，主題方法包括：a)使表達在VTA處或附近用光激活時促進DA 神經元超極化的鹽細菌視紫紅質（例如，NpHR)的主題非人類動物（例如，諸如大鼠或小鼠 的嚙齒動物）與試驗試劑接觸，和b)測定在抑郁癥測定中試驗試劑對嚙齒動物行為的影 響。與尚未接觸試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了試驗試劑的嚙齒動物的抗抑 郁行為表明試驗試劑是用于治療抑郁癥的候選物。在這些實施方案中，所述測定步驟在鹽 細菌視紫紅質暴露于會激活鹽細菌視紫紅質的波長的光之后或同時進行。
[0161] 本公開提供了鑒定治療個體不良心理或生理狀態的候選試劑的方法，其中所述方 法通常包括使在VTA多巴胺能神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳抑制因子的嚙 齒動物與試驗試劑接觸，并且在條件性位置厭惡（CPA)試驗中測定試驗試劑對嚙齒動物行 為的影響。與尚未接觸試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了試驗試劑的嚙齒動物 的CPA響應行為的調節表明試驗試劑是治療個體不良心理狀態的候選試劑。在這些實施方 案中，所述測定步驟在鹽細菌視紫紅質暴露于會激活鹽細菌視紫紅質的波長的光之后或同 時進行。不良心理和生理狀態包括但不限于煩躁不安、抑郁、快感缺失、自殺、激動、焦慮、藥 物成癒戒斷癥狀等。
[0162] 在一些實施方案中，鹽細菌視紫紅質包含ER輸出和膜運輸信號序列。例如，在一 些情況下，鹽細菌視紫紅質為從N端到C端包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%相同 的氨基酸序列、ER輸出信號序列和膜運輸信號序列的NpHR視蛋白。在其它實施方案中，鹽 細菌視紫紅質為從N端到C端包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%相同的氨基酸序 列、膜運輸信號序列和ER輸出信號序列的NpHR視蛋白。在一些情況下，膜運輸信號序列源 自人內向整流鉀通道Kir2. 1的氨基酸序列。在一些情況下，膜運輸信號序列包含氨基酸 序列KSRITSEGEHPLDQIDINV(SEQ ID N0:17)。在一些情況下，ER輸出信號序列包含序列 FCYENEV(SEQ ID NO:13)。
[0163] 在一些情況下，編碼鹽細菌視紫紅質的核苷酸序列與神經元特異性啟動子，例如 為在神經元中表達鹽細菌視紫紅質而提供的啟動子可操作連接。在一些實施方案中，所述 啟動子為酪氨酸羥化酶啟動子。
[0164] 非人類動物模型中抑郁癥的癥狀包括（例如）逃避相關行為減輕。與未用試驗試 劑治療的對照動物相比，目標試驗試劑（例如，為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑）增加 了逃避相關行為。例如，在一些情況下，與未用試驗試劑治療的對照動物相比，目標試驗試 齊U (例如，為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑）增加了逃避相關行為至少約10%、至少約 20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約2倍或大于2倍。
[0165] 對抑郁癥的試驗包括強迫游泳試驗（FST)(見，例如，Porsolt等（1977)Nature 266:730);懸尾試驗（見，例如，Cryan 等（2005)Neurosci. Behav. Rev. 29:571);等等。
[0166] 在一些實施方案中，試驗試劑增強了在懸尾試驗中的性能。懸尾試驗基于經受短 期、無法逃避的的懸尾應激的動物會形成不動姿勢的事實。與未用試驗試劑治療的對照動 物相比，為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑將降低固定性并且促進逃避相關行為的發 生。
[0167] 去極化VTA的DA神經元中的視蛋白
[0168] 在一些情況下，具有神經元活性的活性光遺傳抑制因子（光響應性視蛋白）為在 VTA處或附近用光激活時促進VTA的DA神經元去極化的視紫紅質通道蛋白（例如，ChR2)。 DA神經元的去極化激活了這些神經元。未用光激活光響應性視蛋白時，非人類動物模型在 慢性輕度應激（CMS)條件下表現出抑郁特征。向非人類動物模型施用試驗試劑。當VTA的 DA神經元未暴露于激活光響應性視蛋白去極化的波長的光時，為治療抑郁癥的候選試劑的 試驗試劑將改善非人類動物模型抑郁癥的至少一種癥狀。在一些情況下，當VTA的DA神經 元未暴露于激活光響應性視蛋白去極化的波長的光時，為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試 劑將改善非人類動物模型抑郁癥的至少一種癥狀，程度與暴露于激活波長的光相同。
[0169] 因此，在一些情況下，主題方法包括：a)使表達在VTA處或附近用光激活時促進DA 神經元去極化的視紫紅質通道蛋白（例如，ChR2)的主題非人類動物（例如，諸如大鼠或小 鼠的嚙齒動物）與試驗試劑接觸，和b)測定在抑郁癥測定中試驗試劑對嚙齒動物行為的影 響。與尚未接觸試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了試驗試劑的嚙齒動物的抗抑 郁行為表明試驗試劑是用于治療抑郁癥的候選物。在這些實施方案中，所述測定步驟在視 紫紅質通道蛋白沒有暴露于會激活視紫紅質通道蛋白的波長的光時進行。在一些情況下， 為治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑緩和抑郁癥的一種或多種癥狀，程度為通過將視紫紅 質通道蛋白暴露于會激活視紫紅質通道蛋白的波長的光緩和抑郁癥癥狀的程度的至少約 50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %或大于90 %。在一些情況下，為 治療抑郁癥的候選試劑的試驗試劑緩和抑郁癥的一種或多種癥狀，程度與將視紫紅質通道 蛋白暴露于會激活視紫紅質通道蛋白的波長的光相同。
[0170] 在本領域中已經描述了 CMS條件。見，例如，Forbes等（1996)Physiol. &Behavior 60:1481 ;并且在實施例中有描述。
[0171] 在一些情況下，去極化視蛋白是包含與SEQ ID NO:5所示序列至少約90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列的光響應性陽離 子通道蛋白。在一些實施方案中，光響應性通道蛋白包含膜運輸信號序列和/或ER輸出信 號序列。在一些情況下，膜運輸信號序列包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV(SEQ ID NO: 17)。在一些情況下，ER輸出信號序列包含序列FCYENEV(SEQ ID NO: 13)。
[0172] 鑒定治療性干預靶標的方法
[0173] 主題非人類動物模型可用于鑒定在抑郁癥治療中治療性干預的附加靶標。因此， 本公開提供了鑒定促進抑郁的蛋白質的方法，其中此類蛋白質將視為治療抑郁的潛在治療 性靶標，例如可用于鑒定調節靶標活性并從而治療抑郁癥的藥物的靶標。
[0174] 在一些情況下，本公開提供了鑒定個體中促進抑郁癥的蛋白質的方法，其中所述 方法通常包括：a)使在內側前額葉皮質（mPFC)興奮性神經元中表達具有神經元活性的活 性光遺傳活化因子的主題非人類動物與所述蛋白質接觸，和b)將抑郁癥測定中非人類動 物的行為與尚未接觸所述蛋白質的對照嚙齒動物的行為比較。接觸了所述試劑的非人類動 物的抑郁行為表明所述蛋白質促進抑郁。
[0175] 可通過將蛋白質本身引入動物體內或向動物體內引入包含編碼所述蛋白質的核 苷酸序列的核酸使主題非人類動物與蛋白質接觸。例如，可（例如，如上所述通過注射）直 接將包含編碼待試驗抑郁癥誘導作用的蛋白質的核苷酸序列的表達構建體引入神經元中。 以這種方式試驗cDNA庫。
[0176] 在一些情況下，活性光遺傳活化因子為ChR2。在一些情況下，通過在mPFC興奮性 神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因子，并且將中縫背核（DRN)暴光以激活 光遺傳活化因子工程化在mPFC興奮性神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因 子的非人類動物。
[0177] 在一些情況下，mPFC興奮性神經元中具有神經元活性的活性光遺傳活化因子為包 含與 SEQ ID N0:5 中所示序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%相同的氨基酸序列的光響應性陽離子通道蛋白。在一些實施方案中，mPFC興 奮性神經元中具有神經元活性的活性光遺傳活化因子包含膜運輸信號序列和/或ER輸出 信號序列。在一些情況下，膜運輸信號序列包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV (SEQ ID NO: 17)。在一些情況下，ER輸出信號序列包含序列FCYENEV(SEQ ID NO: 13)。
[0178] 評估研發用于治療除抑郁癥外的病癥的藥物的方法
[0179] 主題非動物模型可用于試驗正在研發用于治療除抑郁癥外的病癥的藥物的抑郁 誘導作用。在主題非動物模型中誘導抑郁癥癥狀的藥物可能需要重新評估其治療除抑郁 癥外的病癥的適用性；可能需要經化學改性以致其不再在主題非動物模型中誘導抑郁癥癥 狀，在治療除抑郁癥外的病癥中仍保持功效；或可能需要在警示標簽中包括藥物可能誘導 抑郁癥癥狀的可能性。
[0180] 在一些情況下，本公開提供了篩選試劑（例如，正在研發用于治療除抑郁癥外的 病癥的藥物）促進個體抑郁的能力的方法，其中所述方法通常包括：a)使在內側前額葉皮 質（mPFC)興奮性神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因子的主題非人類動物 與所述試劑接觸，和b)將抑郁癥測定中非人類動物的行為與尚未接觸所述試劑的對照嚙 齒動物的行為比較。接觸了所述試劑的非人類動物的抑郁行為表明所述試劑促進抑郁。在 一些情況下，活性光遺傳活化因子為ChR2。在一些情況下，通過在mPFC興奮性神經元中 表達具有神經元活性的光遺傳活化因子，并且將中縫背核（DRN)暴光以激活光遺傳活化因 子工程化在mPFC興奮性神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因子的非人類動 物。
[0181] 在一些情況下，mPFC興奮性神經元中具有神經元活性的活性光遺傳活化因子為包 含與 SEQ ID N0:5 中所示序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%相同的氨基酸序列的光響應性陽離子通道蛋白。在一些實施方案中，mPFC興 奮性神經元中具有神經元活性的活性光遺傳活化因子包含膜運輸信號序列和/或ER輸出 信號序列。在一些情況下，膜運輸信號序列包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV (SEQ ID NO: 17)。在一些情況下，ER輸出信號序列包含序列FCYENEV (SEQ ID NO: 13)。 實施例
[0182] 提出下列實施例以便為本領域的普通技術人員提供如何制備和使用本發明的完 整公開內容和描述，而非旨在限制發明人視為其發明的范圍，也非旨在表示下面的實驗完 全或僅為進行的實驗。已經努力確保關于所用數字（例如，量、穩定等）的精確性，但是應 考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指出，份數為重量份，分子量為重均分子量，溫度按攝 氏度計，而壓力為或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp，堿基對；kb，千堿基；pl，皮升；s 或sec,秒；min，分鐘；h或hr,小時；aa，氨基酸；kb，千堿基；bp，堿基對；nt，核苷酸；i.m.， 肌肉內；i. P.，腹膜內；s. c.，皮下；等等。
[0183] 實施例1 :多巴胺神經元調節抑郁相關行為的神經編碼和表達
[0184] 研究維持正常水平的動機和快感是否需要腹側被蓋區（VTA)多巴胺神經元的活 性。為試驗選擇性抑制VTA DA神經元的活性是否可敏銳誘導抑郁樣行為，利用光遺傳學技 術（21-23)允許的細胞類型特異性靶向和精確瞬時操縱。為抑制VTA DA神經元，通過在 用多重抑郁癥測定法試驗這些動物之前，將雙floxed ere依賴型病毒構建體注入TH: :Cre 小鼠的VTA中（24)(圖1A)，在酪氨酸羥化酶（TH)陽性神經元中選擇性表達在用琥珀色光 照射后使神經元膜超極化的表達增強型鹽細菌視紫紅質（eNpHR3. 0) (23)。
[0185] 因為eNpHR3. 0與增強型黃色熒光蛋白（eYFP)融合，通過量化表達eNpHR3. 0-eYFP 的VTA神經元的比例，或在為TH+的單獨表達eYFP的年齡匹配對照中，經免疫組織化學檢 驗了在用于這些行為測定的動物中的靶向特異性（圖1B。嚙齒動物中兩大主要類別的抑郁 癥測定包括測量動機（25 - 28)和快感缺失（27, 29, 30)。已經充分驗證了這些測定，因為經 抗抑郁藥物的慢性治療性能得到改善（25 - 27, 29, 30)。
[0186] 在抑郁表現型的上下文中，通過為嚙齒動物呈現無法逃避的應激物，例如懸掛動 物的尾巴或被迫在冷水中游泳，測定動機。測定分析需要量化動物進行逃避相關行為或掙 扎花費的時間相對于靜止不動花費的時間比例。在歷史上已經將此類測定中在懸尾試驗 (TST)中懸掛或在強迫游泳試驗（FST)中漂浮的固定性解釋為"行為絕望"的征兆（27, 28)。 此處，在分3個時期（包括基線關燈時期、開燈時期，然后再是關燈時期）的TST的9-min期 間將具有表達eNpHR3. 0的VTA DA神經元的小鼠與eYFP對照比較，我們看到用591nm光持 續照射時逃避相關行為明顯減輕（雙因素 ANOVA揭示組X時期相互作用，F4, 38 = 3. 95， p = 0. 00089，Bonferroni事后檢驗顯示相對于eYFP組，在eNpHR3. 0組中逃避相關行為明 顯減輕，p〈〇. 05)，一旦關燈就回到基線（圖1C)。
[0187] 通過在新的但非壓力環境中，用曠場試驗（OFT)在關燈和開燈條件之間兩次 3-min相互作用的12-min期間自由探索的同時評估這些動物研究逃避相關行為的這種瞬 時減輕是否是總體運動效果，而非動機增加。雖然照射時，eNpHR3.0組中已經存在減少運 動的細微趨勢，但是組間運動速度沒有顯著差異（雙因素 ANOVA未顯示出組X時期相互作 用，F3, 48 = 1. 76, p = 0. 17)。抑制VTA DA神經元時，逃避相關行為的顯著減輕和減少運 動的不顯著趨勢可能反映動機減少。
[0188] 除測定面對無法逃避的應激物的逃避相關行為外，研發了對充分驗證的快感缺失 測定法，糖水偏好試驗（29-34)的新變化以測定選擇性抑制VTA DA神經元是否可以敏銳誘 導快感缺失。為增強我們糖水偏好試驗的靈敏性，通過自動化檢測量化90-min期間在輸送 水或1 %蔗糖溶液的噴口上的舔食次數，以測定基線30-min關燈期，接著是30-min開燈期， 最后再是30-min關燈期內的糖水偏好（圖1E)。顯著地，觀察到在eNpHR3. 0而非eYFP對 照小鼠在照射期間糖水偏好顯著降低（圖IE ;雙因素 ANOVA揭示視蛋白的顯著作用，F1，42 =6. 31，p = 0. 016 ;Bonferroni事后檢驗揭示僅在開燈期間組間有顯著差異，p〈0. 05)。因 此，通過減輕糖水偏好測定，抑制VTA DA神經元顯著降低了面對無法逃避的應激物的逃避 相關行為，以及敏銳引起快感缺失。總之，這里顯示在增加"行為絕望"和快感缺失的測量 方面，選擇性抑制VTA DA神經元敏銳模擬了抑郁樣表現型（27, 28)。
[0189] 接著，研究了階段性激活VTA DA神經元是否可用于挽救不可預見性慢性輕度應激 (CMS) (31，32, 34, 35)誘導的抑郁樣表現型。在人類中，患有抑郁癥的大多數患者陳述慢性 應激逐漸引發長期抑郁狀態（幾個月），而非短暫的（幾天）應激性事件（36 - 40, 19, 41)。 為如實地模仿在人類中觀察到的抑郁樣狀態，使用不可預見性慢性輕度應激（CMS)范例 在嚙齒動物中誘導抑郁樣狀態（32, 34 - 36, 42 - 47)，其中在成年嚙齒動物中每天遞送不 可預見性輕度應激物2次，8-12周。已經證實CMS引起如同通過面對無法逃避的應激物 的逃避相關行為減少測定的動機減少以及如同通過糖水偏好測量的快感缺失（27,29 _ 32, 34, 44, 18)。
[0190] 因為證明抑制VTA DA神經元敏銳地產生抑郁樣表現型（圖1)，然后確定激活VTA DA神經元是否可以挽救慢性應激誘導的抑郁樣表現型。為選擇性激活VTA DA神經元，使用 病毒轉導方法選擇性表達視紫紅質通道蛋白（ChR2)，使膜去極化并且以毫秒級精度產生動 作電位（22, 48)的一種光活化陽離子通道，并且已經證實在使用的參數下，在VTA TH+中表 達時，在伏隔核（NAc)中釋放多巴胺瞬態物（24, 49, 50)。為測試這一點，包括了 4個實驗組 (圖2A) :1)在VTA中具有經ChR2-轉導的TH+神經元的組，其暴露于慢性輕度應激（CMS) 方案8-12周，2)作為對照，單獨在VTA DA神經元中表達的eYFP熒光團；用CMS方案處理 這些動物,養在低應激環境（非CMS)中8-12周的動物的VTA DA神經元中單獨表達的3) ChR2*4)eYFP。
[0191] 為試驗VTA DA神經元中階段性放電是否可以挽救CMS誘導的抑郁樣表現型，我們 在多重抑郁癥測定法中的基線（關燈）、階段性照射（開燈）和照射后（關燈）時期（圖 2B)檢查了動物。為在VTA DA神經元中產生階段性放電，使用稀疏、爆發照明模式（圖2B; 每5s，30Hz的8個脈沖，5-ms脈沖寬度）以在照射（開燈）期間引起階段性脈沖24和釋放 多巴胺瞬態物（24, 49)。為檢查VTA DA神經元中階段性放電對動機的影響，使全部4組動 物經受懸尾試驗（TST)并且量化了每個時期掙扎或逃避相關行為的量。
[0192] 在基線時，與先前的研究一致（25, 32, 33, 43)，觀察到相對于非CMS對照，CMS 使掙扎量減少?50%(6丫卩？〇1^ = 33.8±6.1;〇11?2〇1^ = 31.3±3.9;〇11?2非〇1^ = 61.7±7. 3;eYFP非CMS 61.3±7. 6;圖2C)。雙因素 ANOVA不僅揭示了顯著的組X時期 相互作用，F6, 108 = 3.36, p = 0.0045,而且揭示了組非常強的影響，F3, 108 = 16.92， p〈0. 0001。照射時，ChR2CMS組相對于eYFP CMS組在逃避相關行為上顯示出顯著增加 (p〈0. 001，Bonferroni事后檢驗）。因此，ChR2CMS小鼠而非eYFP CMS小鼠體內VTA DA神 經元的階段性照射以秒級挽救CMS誘導的抑郁樣表現型（圖2C)。重要的是，未觀察到照射 時（Bonferroni事后檢驗）eYFP非CMS和ChR2非CMS小鼠之間掙扎的顯著差異，表明逃避 相關行為是展現出應激誘導的抑郁樣表現型的動物特有的。
[0193] 因為DA系統也與運動相關聯，所以測試了 TST期間使用的刺激參數是否為總運動 效果。在與兩個3-min關燈時期交錯的兩個3-min開燈時期，使用上述相同的階段性照射參 數，在曠場腔室內檢查了 TST測定中包括的所有小鼠的運動（圖2D)。雖然照射時ChR2組 存在速度增加的趨勢，但是在雙因素 ANOVA中未觀察到顯著的組X時期相互作用（F9, 152 =0. 99，p = 0. 4493)，并且通過Bonferroni事后檢驗未揭示出可檢測的差異。然而，觀察 到組的顯著影響（F3, 152 = 5. 06,p = 0. 0023)，其可能反映了 CMS和非CMS組間在曠場腔 室內（圖2D)初始探索的差異。
[0194] 接下來，問到階段性激活VTA DA神經元是否也可挽救CMS-誘導的糖水偏好降 低。為檢測糖水偏好的劇烈變化，研發了對糖水偏好試驗的新變化以增強該測定法的靈敏 性。使用測舔儀（Iickometer)檢測在輸送水或1%蔗糖溶液的噴口上的舔食次數，在跨3 個30-min時期的單個90-min期內測定糖水偏好（圖2E)。雙因素 ANOVA揭示了顯著的 組X時期相互作用（F6, 62 = 4. 33, p = 0. 001)以及組的顯著影響（F3, 31 = 3. 40, p = 0. 0299)。與先前的研究一致，基線測量顯示在測舔儀測定中照射之前，eYFP和ChR2CMS小 鼠與eYFP和ChR2非CMS小鼠相比具有明顯更低的糖水偏好（Bonferroni事后檢驗，分別 為p〈0. 05和p〈0. 01)。然而，階段性激活VTA DA神經元敏銳地挽救了 ChR2CMS而非eYFP CMS動物中CMS誘導的快感缺乏作用（單因素 ANOVA，Dunn事后檢驗將基線與開燈時期比 較,對于ChR2CMS小鼠而言p〈0. 01，對于eYFP CMS小鼠而言p = 0. 2851)。
[0195] 上面提供的數據證明對抑郁相關行為的多重測定中，VTA DA神經元活性的雙向 作用。然而，因為VTA DA神經元投射到整個腦部的多個區域（51-54)，所以不清楚哪些下 游靶標可能有助于這種行為。此外，有證據證明VTA DA神經元在腹側紋狀體中輔助釋放 谷氨酸（55 - 57)。考慮到腹側紋狀體，特別是診斷患有重性抑郁障礙的人類患者的伏隔核 (NAc)中的深部腦刺激有助于緩和抑郁癥的癥狀（58, 59)，測試了 NAc中谷氨酸或多巴胺傳 輸是否在小鼠中介導了光誘導的對這種抑郁樣表現型的挽救。
[0196] 為研究TST期間NAc中VTA DA神經元傳輸的作用，包括了另一組小鼠，除病毒轉 導VTA DA神經元和針對VTA慢性植入光纖電纜（圖3A)外，在經歷8-12周不可預見性慢 性輕度應激之前，在NAc中植入了雙側引導插管。為研究階段性激活VTA DA神經元時谷氨 酸傳輸的功能性作用，進行了受試者內比較（within-subject comparison)，對于順序進行 平衡，并且就在TST中試驗之前向NAc輸注鹽水或α -氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑 丙酸受體（AMPAR)拮抗劑、2, 3-二羥基-6-硝基-7-氨磺酰-苯并[f]喹喔啉-2, 3-二酮 (NBQX)和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR)拮抗劑、（2R)-氨基-5-膦酰基戊酸（AP5)的 混合物。
[0197] 雙因素 ANOVA揭示了顯著的組X時期相互作用（F2, 28 = 3. 69，p = 0.0379)、組的 顯著影響（F1，14 = 7· 24，p = 0· 0176)和時期的顯著影響（F2, 28 = 38. 98，ρ〈0· 0001)。NAc 內鹽水處理之后，我們重復在VTA照射時挽救應激誘導的抑郁樣表現型（單因素 AN0VA， ρ〈0. 001，Dunn事后檢驗比較基線與開燈時期，p〈0. 01 ;圖3Β)。NAc內谷氨酸受體阻滯后， 還觀察到照射時挽救了應激誘導的抑郁樣表現型（單因素 ANOVA，ρ〈0. 001，Dunn事后檢驗 比較基線與開燈時期，P〈〇. 001 ;圖3Β)。實際上，通過組的顯著影響所見，在用谷氨酸受體 拮抗劑處理的動物中掙扎花費的時間量總體上更長。
[0198] 因為NAc接受了來自許多區域，包括PFC、扁桃體和海馬的穩健谷氨酸能神經支 配，所以推測這些輸入的凈效應可能用于阻遏TST中的逃避相關行為。而且，本文提出的發 現與最近證實克他命（ketamine)，一種NMDAR拮抗劑，可敏銳地改善人類中抑郁樣癥狀的 研究一致（60 - 62)。
[0199] 因為證明，懸尾期間介導我們光誘導的逃避相關行為增加不需要NAc中的谷氨酸 傳輸，然后測試NAc中的多巴胺信號是否主要牽涉于介導逃避相關行為。為此，在NAc內鹽 水或NAc內多巴胺受體拮抗后，在TST中試驗之前，使用SCH 23390 (D1受體拮抗劑）或奎丙 靈（raCl〇pride)(D2受體拮抗劑）的混合物進行受試者內比較。在基線和照射時期經NAc 多巴胺受體阻滯觀察到逃避相關行為明顯減弱（雙因素 ANOVA揭示了顯著的藥物X時期 相互作用，F2, 44 = 3. 52, p = 0· 0381，藥物的顯著影響，F1，22 = 53. 74, ρ〈0· 0001和時期 的顯著影響，F2, 44 = 3. 48, ρ = 0· 0395 ;圖 3C)。
[0200] 這些發現與從VTA到NAc的多巴胺能神經支配對維持基線水平的逃避相關行為以 及增強VTA DA神經元的階段性活性后挽救CMS誘導的逃避相關行為減少很重要的假設一 致。數據也與多巴胺信號損耗在往往在似帕金森氏病癥狀發作之前經歷抑郁的前期似帕金 森氏病（pre-Parkinsonian)患者中引起抑郁樣癥狀的報道一致。
[0201] 以上數據已經證明，在動機和快感缺失的測量方面，選擇性抑制VTA DA神經元敏 銳地引起了抑郁相關行為，并且階段性激活VTA DA神經元敏銳地挽救了 NAc中多巴胺能信 號介導的不可預見性慢性輕度應激誘導的抑郁樣表現型。然而，NAc中多巴胺受體阻滯減 弱了光誘導和基線水平的逃避相關行為，使得難以解釋NAc中多巴胺信號在這種動機測定 中介導光誘導的抑郁相關行為的挽救的作用。因此，研究了兩種基線條件下抑郁癥測定期 間和階段性激活VTA DA神經元期間NAc神經元的活性。為此，組合了幾種新的工具。
[0202] 在飼養籠中在基線活性期間對最近研發的TH: :Cre大鼠（50)進行首次體內電生 理記錄，在曠場試驗和強迫游泳試驗（圖4A)的新環境中探索，同時在CMS后間歇性照射表 達ChR2的VTA DA神經元（圖4B)。因為強迫游泳試驗（FST)的量化傳統上已經是固定時 期的低分辨率測量27,所以我們需要研發在FST中對逃避相關行為的毫秒精度時間分辨率 檢測的新方法。為此，利用磁感應新方法，使用強迫游泳池外的磁性線圈和與大鼠足部連接 的小磁體測量游泳踢腿或逃避相關行為，并且為體內電生理記錄探頭防水（圖4B)。
[0203] 與對小鼠的TST中的發現類似，發現照射5只CMS TH: :Cre大鼠體內表達ChR2的 VTA DA神經元增加了 FST中的逃避相關行為（配對檢驗，ρ = 0. 0088 ;圖4C和D)，但是開 燈運動對OFT沒有可檢測的影響（圖4D)。雖然有相當比例的編碼光和踢腿的神經元，但是 正如關于以30Hz，每5s輸送8個脈沖序列的光脈沖序列的刺激事件后踢腿光柵直方圖所例 證那樣，光脈沖和踢腿事件未在秒級鎖時（圖4E)。因為我們觀察到相對于關燈時期，在開 燈時期踢腿頻率穩健增加，但是未觀察到對激光脈沖的鎖時踢腿行為，所以我們推測總體 上由多巴胺音調而非分離的多巴胺瞬態物調節逃避相關行為。
[0204] 然后我們研究了開燈時期相對于關燈時期逃避相關行為的增加與記錄的每只動 物編碼階段性VTA DA神經元激活的所有神經元的比例之間的關系。我們使用Spearman相 關性檢驗發現了顯著相關性（P = 0. 0167)，每只大鼠對VTA DA神經元激活顯示出階段性響 應的NAc神經元越多，VTA DA神經元激活時逃避相關行為相對增加越多（圖4F)。這可能 是由于個別動物的解剖變異以及實驗變異例如視蛋白表達。我們在5只CMS TH: :Cre大鼠 體內，在整個期間記錄到總共123個NAc神經元并且檢查了 FST中對輸送到VTA的光脈沖 或踢腿顯示出階段性響應的神經元的比例。
[0205] 我們發現123個NAc神經元中的75個（61% ;圖4G和4H)對光顯示出階段性響 應：這些75個神經元中的15個對光顯示出階段性抑制（20%光響應性神經元），而75個神 經元中的60個為階段性興奮（80%光響應性神經元）。正如通過對踢腿事件的階段性響應 所見，123個NAc神經元中的83個（67% ;圖4G和4H)編碼逃避相關行為：這些神經元中 的14個（17% )在對踢腿顯示出階段性抑制而這些神經元中的69個（83% )響應于踢腿 顯示出階段性興奮。正如在代表性刺激事件后光柵直方圖（圖4G和4H)所見，54個神經元 編碼光脈沖和踢腿事件。
[0206] 為檢查VTA DA神經元的階段性放電是否可以調節NAc中逃避相關行為的編碼，我 們將開燈時期發生的踢腿事件與關燈時期發生的踢腿事件分開。雖然123個神經元中的34 個（28% )編碼開燈和關燈時期的踢腿，我們發現激活VTA DA神經元調節了兩個神經元亞 群中踢腿事件的編碼（圖4G和41)。123個神經元中的21個（17%)僅選擇性編碼開燈時 期的逃避相關行為，而123個神經元中的22個（18% )僅選擇性編碼關燈時期的逃避相關 行為（圖4G和41)。
[0207] 接下來，我們檢查了在同一時間段內的不同時期的放電率動力學。因為有在不同 時期增加或降低放電率的神經元亞群，所以雖然在各個時期NAc神經元群體中放電率的分 布有相對輕微的變化，但是分布的凈變化并未引起個別神經元的放電變化。神經元亞群在 從飼養籠移到新環境（曠場腔室）中時顯示出放電率變化（33%;18個增大而22個降低放 電率），并且神經元亞群在〇FT(24% ;24個增大而6個降低放電率）和FST(30% ;18個增 大而19個降低放電率）中經照射時顯示出放電率變化。然而，當將大鼠從新環境（曠場腔 室）中移到應激環境（強迫游泳池）時，不管是否在關燈時期（86% ;27個增大而79個降 低放電率）或開燈時期（75% ;19個增大而73個降低放電率）比較，更大比例的神經元顯 示出放電率的變化。在此為了總結我們的發現，選擇性抑制VTA DA神經元敏銳地誘導了抑 郁相關行為，反映了 "行為絕望" ￠3)和快感缺失增加。
[0208] 不可預見性輕度應激物的慢性呈現誘導了長期的抑郁樣表現型，通過階段性激活 VTA DA神經元進行挽救。介導逃避相關行為需要NAc中多巴胺而非谷氨酸受體激活。NAc 神經元編碼VTA DA神經元的階段性激活以及逃避相關行為。重要的是，通過VTA DA神經 元激活調節逃避相關行為的編碼。我們還證實大部分NAc神經元在暴露于無法逃避的應急 物時顯示出放電率顯著變化，并且在更多的NAc神經元在緊張放電率方面顯示出降低而非 增加。
[0209] 我們的發現與大鼠抑郁癥模型中的其它體內電生理記錄一致，顯示用抗抑郁去郁 敏（desipramine) (64)處理后記錄到的爆發活性降低。雖然已經有一些報道表明在對抑郁 癥10天社會失敗模型敏感的小鼠中VTA DA神經元放電和爆發增加￠5, 66)，但是這些發現 的差異可源于動物模型、范例持續時間、中腦內的特定記錄部位的差異或其它實驗差異。我 們的數據還支持在成癮和獎賞相關行為的情況下多巴胺功能的現有模型介導動機和感情 反應（11 - 13, 15, 20, 67 - 69)，以及VTA多巴胺放電構成預期或接受獎賞（70, 71)或體驗快 樂（24)或尋求獎賞（48, 49)的基礎。更重要的是，我們的結果可能對通過NAc中深部腦刺 激實現的抗抑郁效果提供機械解釋（57, 58)。與亞屬扣帶皮層中深部腦刺激的抗抑郁作用 (71)并行的這些研究表明，由一系列不同類別的癥狀定義的精神病由多種神經回路病理介 導。心境障礙的復雜性和構建動物精神病模型的挑戰代表查明介導抑郁癥癥狀的準確神經 功能異常的障礙。然而，鑒定即使介導一個亞類的抑郁相關癥狀的回路機制的潛在影響意 義深刻。研究嚙齒動物和人類之間保存良好的回路，例如中腦緣多巴胺系統，提高了嚙齒動 物模型中抗抑郁操縱將有助于研發改良的對人類治療性干預的可能性。
[0210] 圖1.選擇性抑制腹側被蓋區（VTA)多巴胺神經元誘導了抑郁樣表現型。A，Cre 依賴性AAV的示意圖。遞送到TH: : IRES-Cre轉基因中后，eNpHR3. O將在酪氨酸羥化酶陽 性神經元中選擇性表達。B，中腦多巴胺神經元的共聚焦圖像；橙色帶點矩形指出了對準照 射VTA的光纖的位置。下面，在光線軌跡正下方的VTA神經元的特寫圖像。C，光抑制VTA DA神經元敏銳地誘導逃避相關行為減少，*P〈0. 05。圖IC中，每一組中左側柱為eYFP ;每一 組中右側柱為eNpHR3.0。D，抑制VTA DA神經元并未引起曠場試驗中運動的可檢測差異。 E，90-min快感缺失測定的示意圖和結果。光抑制VTA DA神經元誘導糖水偏好劇烈降低， *P〈0. 05。
[0211] 圖2.稀疏階段性光激活VTA DA神經元挽救了應激誘導的抑郁樣表現型。A，實驗 中包括的4個實驗組的圖解。B，用473nm光，用于在表達ChR2的VTA DA神經元中引起活 性階段性爆發的照射模式的示意圖。C，階段性照射VTA DA神經元挽救了 ChR2CMS小鼠而 非eYFP CMS小鼠在懸尾試驗（TST)中應激誘導的掙扎減少，**P〈0. 001。圖2C中，每個"關 燈"和"開燈"組從左至右的柱為：eYFP CMS ;ChR2CMS ;ChR2非CMS ;和eYFP非CMS。D，TST 中使用的照射參數并未引起在曠場腔室內運動活性的可檢測變化。E，階段性激活VTA DA 神經元敏銳地挽救了 ChR2CMS而非eYFP CMS動物應激誘導的糖水偏好降低，對于ChR2CMS 小鼠而言**P〈〇. 01。
[0212] 圖3.介導逃避相關行為需要多巴胺而非谷氨酸受體信號。A，在經CMS處理的動 物中兩側NAc藥理學操縱連同VTA DA神經元照射的示意圖。B，NAc中AMPAR和NMDAR谷 氨酸受體（GluRx)的拮抗不防礙基線水平的掙扎，也不妨礙懸尾試驗中光誘導的逃避相關 行為的增加。圖3B中，每個"關燈"和"開燈"數據組中的左側柱為GluRx ;每個數據組中 的右側柱為鹽水。C，NAc中Dl和D2多巴胺受體（Dlx+D2x)的拮抗減弱了逃避相關行為， ***P〈0. 0001。圖3C中，每個"關燈"和"開燈"數據組中的左側柱為鹽水；每個數據組中的 右側柱為Dlx+D2x。
[0213] 圖4.階段性激活VTA多巴胺神經元調節了 TH: :Cre大鼠中逃避相關行為的NAc 神經編碼。A，體內電生理記錄期的示意概況圖。B，經CMS處理的TH: :Cre大鼠中，NAc中 體內電生理記錄、表達ChR2的VTA DA神經元的照射和游泳行為的精確測量的整合。C，強 迫游泳試驗中階段性照射表達ChR2的VTA DA神經元增加了 TH: :Cre大鼠的逃避相關行 為。D，階段性照射表達ChR2的VTA DA神經元增加了強迫游泳試驗中的踢腿速率，但是未 增加曠場試驗中的步行速率。E，藍色線條所示，示出了關于8個光脈沖序列的踢腿事件的 刺激事件后光柵直方圖顯示踢腿事件未與光脈沖鎖時。F，散點圖，示出了每只大鼠游泳行 為受VTA DA神經元激活調節的程度相對于從指定受試者記錄的所有神經元的比例之間的 相關性，P = 〇. 0167。G，對光脈沖和踢腿事件顯示出階段性興奮的代表性神經元（實例細 胞1)和選擇性編碼開燈時期（實例細胞2)或關燈時期（實例細胞3)的踢腿事件的神經 元的刺激事件后光柵直方圖。H，對光脈沖和踢腿事件顯示出階段性響應的神經元的群體匯 總，示出了從5只CMS TH: :Cre大鼠記錄的123個NAc神經元的群體匯總，在75個NAc神 經元中看到對VTA照射的階段性響應，并且在83個NAc神經元中看到對踢腿行為的階段性 響應，54個神經元對光和踢腿事件均顯示出階段性響應。I，在強迫游泳試驗的開燈和關燈 時期顯示出對逃避相關行為的差分編碼的神經元比例的群體匯總。123個NAc神經元中的 55個在開燈時期對踢腿響應，123個NAc神經元中的56個在關燈時期顯示出對踢腿的階段 性響應，并且123個NAc神經元中的34個在開燈和關燈時期對踢腿響應。21個NAc神經元 選擇性編碼開燈時期的踢腿事件，而123個神經元中的22個選擇性編碼關燈時期的踢腿事 件。
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[0286] 實施例2 :在面向目標的行為狀態中前額皮質向腦干神經投射的作用
[0287] 材料和方法
[0288] 受試者。從查爾斯河（Charles River)得到重200_225g(大約6-8周）的雌性朗 伊凡氏大鼠（Long-Evans rat)。使大鼠保持標準的12h光暗循環并且隨意給予食物和水。 最初每個籠子飼養兩只大鼠。植入了四極管微型硬盤或固定線陣列的動物在移植后單獨飼 養以將對記錄用硬件的損害減到最小。僅植入了光纖的動物在移植后繼續每只籠子飼養兩 只。所有程序遵照國立衛生研究院（National Institutes of Health)確定的指導方針 并且已經得到斯坦福大學動物保護與應用委員會（Stanford Institutional Animal Care and Use Committee)批準。
[0289] 自動化強迫游泳試驗（FST) 9英寸直徑的水池 （Tap Plastics, Mountain View, CA) 周圍是由10磅26號規格漆包銅線構成的10英寸直徑的線圈。用溫暖舒適的橡皮圈 將2g稀土磁體置于大鼠的后足部。在行為試驗之前立即進行磁體放置并且醒來的大鼠 耐受良好。FST期間，發現游泳期間磁體在線圈內的移動在線圈中感應強電流。線圈電 壓是1和300Hz之間濾波的帶通，在2kHz下數字化并且使用數字Lynx數據采集系統 (Neuralynx, Bozeman, MT)記錄進行后期分析。同時從參考線圈收集數據，并且離線進行參 考以減少線路噪聲。通過將感應線圈放在籠子的正下方使用相同系統測量在熟悉籠子中的 運動活性；先前已經使用了類似方法測量大鼠的帕金森氏病震顫（1)。對所有實驗收集了 線圈數據和視頻數據。在對實驗條件和自動評分固定性/踢腿頻率不知道的情況下，進行 用于驗證自動化方法的手動評分。手動評分期間每5s進行目視觀察，并且將固定時期定義 為沒有移動或保持飄浮所需最少必須移動。
[0290] 四極管微型硬盤或固定線陣列放置對于圖2所示數據，大鼠在手術之前達到最 少400g。對于圖4所示數據，在8-10周在mPFC中（如下所述）為大鼠兩側注射病毒，并 且在電極移植之前使病毒最少表達4個月（通常大鼠達到MOOg重量）。最初用5%異氟 烷麻醉大鼠。刮頭皮并將大鼠放在具有非破裂性耳棒的立體定位架中。使用加熱板預防 體溫過低。整個手術中遞送1-3%的異氟烷；調節該水平以維持恒定手術平面。使用眼用 軟膏保護眼睛。手術開始之前給予丁丙諾啡（buprenorphine) (0.05mg/kg，皮下）和恩諾 沙星（enrofloxacin)(5mg/kg，皮下）。沿著切口線皮下注射0.5%利多卡因（Iidocaine) 和0.25 (%布比卡因（13即；^；^3；[116)的混合物（100以]^)。用聚維酮碘〇36七3(1；[116)和醇 為頭皮消毒。正中切口露出顱骨，其經徹底清潔。在暴露的顱骨外周植入8-11個顱骨 螺釘以確保穩定記錄，在右側mPFC上鉆2-mm顱骨切孔，并且小心切除硬腦膜。在顱骨 切孔（AP:2. 7-3. 3ML:0. 8DV:4. 0)上植入從13μπι鎳鉻合金纏繞有四極管的4-四極管 微型硬盤（Neuralynx, Bozeman, MT)或具有50 μ m不銹鋼電極的24-電極固定線（NB Labs，Denison，TX)并且用牙科用丙烯酸樹脂固定。對于圖4所示數據，此時還植入了靶向 DRN的光纖跳線（如下所述）。使丙烯酸樹脂成形以在顱骨和電極接口板之間產生細小脖 頸，以便利于防水。縫合皮膚并且給予大鼠卡洛芬（carprofen) (5mg/kg，皮下）和乳酸林格 氏液（lactated ringer's solution) (2. 5mL，皮下）并且在加熱燈下恢復。移植后每天調 節四極管。
[0291] 自由移動的神經生理學用異氟烷簡單麻醉大鼠。探頭和繩索 (Neuralynx, Bozeman, MT)與微型硬盤或固定線陣列連接并且用線固定以預防"濕狗"抖動 期間分離。為保護電子設備免受水漬，將切去兩端的橡膠套固定在用橡皮圈緊緊纏繞的探 頭連接點周圍。此時，將磁體連接到后足部進行行為讀數。異氟烷麻醉的總時間限制為小 于IOmin,并且在開始記錄之前使速率恢復至少lh。對于圖4記錄，在FST之前立即連接光 線電纜以便將旋轉期間因為扭轉的破損減到最少，并且在記錄之后立即檢查光功率以確認 光纖完整。用64通道數字Lynx數據采集系統（Neuralynx, Bozeman, MT)采集神經數據。 首先將強化通道引用到未表現出強化活性的電極以減少行為噪聲。然后在600和6000Hz 之間帶通濾波信號并且在32kHz下數字化。還在所有時期記錄了感應線圈數據和視頻數據 以便驗證感應線圈方法對FST和熟悉籠子活動的用途。根據實驗對可變數量的時期記錄數 據。對于圖2,我們記錄了 FST前在熟悉籠子中15min，FST期間15min和FST后在熟悉籠 子中15min的數據。對于圖4,我們記錄了 FST前在熟悉籠子中的15min，FST期間有刺激 的20min (與5個2-min刺激時期交錯的5個2-min無刺激時期），FST后在熟悉籠子中的 15min和FST后在熟悉籠子中有刺激的20min (與5個2-min刺激時期交錯的5個2-min無 刺激時期）。在熟悉籠子與游泳池之間轉移期間輕輕觸摸大鼠以將神經漂移減到最小。完 成記錄后，去除防水材料并且將大鼠置于加熱燈下IOmin干燥。處死進行組織學分析之前， 深度麻醉大鼠并且電流通過所有電極（50 μ A，30s)以產生電解損傷進行解剖定位。
[0292] 病毒構建和包裝在北卡羅來納大學（University of North Caroli na) 用AAV5外殼蛋白對重組AAV載體進行血清分型并且用病毒載體核包裝。對于 AAV5-CaMKII a -hChR2 (H134R) -EYFP 和 AAV5-CaMKII a -EYFP 而言，病毒滴度分別為 2 X IO12 個顆粒/mL和3Χ IO12個顆粒/mL。在www(dot) optogenetics (dot) org上圖譜在線可用。
[0293] 立體定位病毒注射和光纖移植將大鼠準備好手術并如上所述給予鎮痛劑和流體。 正中切口露出顱骨，并且在mPFC上兩側產生顱骨切孔。用10 μ L注射器和斜面面向前面的 33號規格斜面針，以150nL/min使用注射泵注射病毒。在AP 2. 2mm、ML 0. 5、DV 5. 2和AP 2. 2、ML 0.5、DV 4. 2處遞送兩次IyL注射，每只大鼠總計4 μ L。每次注射后，將針留在原 處7min，然后緩慢抽出。縫合皮膚。使病毒表達最少4個月以便允許有時間在軸突上積聚 足夠的視蛋白。在行為試驗之前至少10天，如先前所述2,在目標靶結構上植入具有外部金 屬箍的光纖（200 μ m 直徑，0.22NA，Doric Lenses, Qu6bec, Canada)。mPFC 移植的坐標為 AP 2. 7、ML 0.5、DV 3.8。在從右側30度處植入DRN光纖以避開中央竇和腦導水管，并且光纖 尖端的坐標為AP-7.8、ML 0. 5、DV 5.9。將大鼠準備好手術并如上所述給予鎮痛劑和流體。 產生正中切口，徹底清洗顱骨并且在mPFC或DRN上產生顱骨切孔。連接4個顱骨螺釘，并 且在mPFC或DRN上降低光纖。使用環氧樹脂類粘合劑薄層牢牢地將硬件連接到顱骨上，接 著是較厚的牙科用丙烯酸樹脂層用于結構支撐。
[0294] 光遞送行為試驗期間，用氧化鋯套管將外部光纖（200μπι直徑，0.22NA， Doric Lenses, Qu6bec, Canada)偶聯到植入的光纖。光學轉換器允許不受限制的 旋轉（Doric Lenses, Qu6bec, Canada) (3)。用 100mW473nm 二極管栗浦固體激光 器（OEM Laser Systems, Inc. , Salt Lake City, UT)提供光學刺激并且用 Master-8 刺激發生器（A. M. P. I. , Jerusalem, Israel)控制。用數字Lynx數據采集系統 (Neuralynx, Bozeman, CA)，與行為和神經數據一起同時記錄光脈沖。20Hz的5ms長光脈 沖的脈沖序列用于所有實驗。mPFC細胞體刺激實驗使用3mW光（光纖尖端為24mW/mm 2)。 mPFC-DRN軸突刺激實驗使用20mW光（光纖尖端為159mW/mm2)。由于在這個部位熒光較低， 這是視蛋白表達較低的指標，所以DRN軸突刺激實驗期間需要更強的光功率。
[0295] 強迫游泳試驗我們利用Porsolt強迫游泳試驗進行這些實驗4。游泳池裝入25°C 水至40cm高度。將感應線圈放在所述池周圍，并且如上所述，將小磁體連接到大鼠的后足 部。第一天在光/暗循環的光部分期間將大鼠置于FST中15min進行預曝光。然后用毛巾將 其擦干并且在回到飼養籠之前置于加熱燈下IOmin暖和。在24h后進行的第二個15-20min 試驗期間收集數據。將外部光纖懸掛在FST池上并用氧化鋯套管連接到植入的光纖上。用 光刺激的實驗期間，刺激在2min時期的開燈和關燈期間交替，開始沒有刺激，使用上述參 數總計20min。對所有實驗收集感應線圈數據、視頻數據和激光脈沖時間數據。每只動物間 更換FST池。
[0296] 曠場試驗將外部光纖懸掛在曠場上并用氧化鋯套管連接到植入的光纖上。將大鼠 放在白色、光線昏暗的曠場腔室（105X 105cm)的中央并允許自由探索環境。光刺激在3min 時期的開燈和關燈期間交替，開始沒有刺激，總計15min。將攝像機放在曠場正上，并且用 Viewer2軟件（BiObserve，Fort Lee，NJ)檢測和分析運動活性。收集激光脈沖時間數據并 與行為數據同步。
[0297] 體內麻醉記錄如先前所述3,對在mPFC中用AAV5CaMKII a -ChR2_EYFP構建體轉導 的麻醉大鼠進行mPFC和DRN的同時雙位記錄和光學刺激。開始記錄之前用異氟烷深度麻醉 大鼠。產生正中切口并且皮膚反射。在mPFC(垂直穿透）和DRN(30°穿透）上產生2-3mm 直徑顱骨切孔。立體定向降低與200 μ m 0.37NA光纖（Thorlabs Inc. ,Newton, NJ)偶聯 的IMohm環氧涂層鶴電極（A-M Systems, Sequim, WA)，直至對于mPFC記錄而言在AP 2. 7、 ML 0. 5、DV 3. 6處和對于DRN記錄而言在AP-7. 8、ML 0. 5、DV 6. 0處（30°穿透）開始分 離一個單元。記錄的信號在〇. 3和IOkHz之間經帶通濾波，放大10000X (A-M Systems)， 在 30kHz 下數字化（Molecular Devices, Sunnyvale, CA)并且用 Clampex 軟件（Molecular Devices)記錄。用 IOOmW 473nm 二極管泵浦固體激光器（OEM Laser Systems, Inc. ,Salt Lake City, UT)提供光學刺激。Clampex軟件用于記錄神經數據并控制激光輸出。使用介 于lmW(在光纖尖端為8mW/mm2)和20mW(159mW/mm 2)之間的光功率。在所有實驗結束時，電 流通過電極（50 μ A，30s)以產生電解損傷進行解剖定位。
[0298] 組織學、免疫組織化學和共聚焦成像用Beuthanasia-D深度麻醉大鼠并且穿心灌 注4%于PBS(pH 7. 4)中的冰冷多聚甲醛（PFA)。將腦部于PFA中固定整夜，然后轉移到 30 %于PBS中的蔗糖中以平衡至少3天。在冷凍切片機上切通過mPFC和DRN的40 μ m冠狀 切片并且在4°C下儲存在防凍劑中。用PBS洗滌切片并在于PBS中的0.3% Triton X-100 和3%常規驢血清（NDS)中培育30min。在4°C下，在于PBS中的3%NDS(兔抗5HT 1:1000， ImmunoStar，Hudson，WI)中用一次抗體培育切片整夜。然后將其在PBS中洗滌并在室溫下 用與 Cy5 偶聯的二次抗體培育 3h(l: 500, Jackson Laboratories，West Grove，PA)。于 PBS 中洗滌切片并且在DAPI (1:50000)中培育10min，然后再次洗滌并用PVA-DABC0固定在載玻 片上。使用具有10X空氣物鏡或40X油浸物鏡的Leica TCS SP5掃描激光顯微鏡獲取圖 像。
[0299] 數據分析將峰值導入離線分類軟件（Plexon Inc，Dallas，TX)并使用波形特征 (峰谷高度）和主要組成部分離線分類。使用自定義編寫的Matlab (Mathworks, Natick, MA) 腳本和Neuroexplorer數據分析包（Nex Technologies, Littleton, MA)進行神經數據和行 為數據的分析。對于所有分析而言，統計顯著性定義為P〈 = 0.05。參考感應線圈數據并 且在l-6Hz下離線零相位過濾，這樣保護了個體踢腿的形狀，同時降低了高頻率線路噪聲。 然后整合參考且過濾的線圈數據并且閾值化（最大偏差的10% )并且檢測了與個體踢腿 相對應的峰值（圖1)。掙扎期間進行的踢腿與記錄的信號中的大偏轉相對應并且可易于 和被動漂浮期分開。將瞬時踢腿頻率定義為IOs期內每秒鐘踢腿的平均次數。通過將踢腿 間隔大于Is的時期評分為固定，測定自動評分的固定性。對熟悉籠子記錄期間收集的感應 線圈數據進行相同分析。在這種情況下，在1-20HZ下過濾感應線圈數據，在4%最大偏差 下閾值化，并且因為使用這些參數更易于檢測單極步波形，所以并未整合。對手動評分的行 為數據回歸自動評分的行為數據以測定評分方法之間的一致性。由該回歸分析導出R平方 和F統計量和p值。使用Wilcoxon秩和檢驗進行不同行為時期之間神經放電統計顯著差 異的測定。首先測試神經元在FST前期和FST時期之間放電率的差異。對于該分析，將神 經和行為數據歸入IOs間期。然后測試神經元在FST期間移動和固定狀態之間放電率的差 異。對于該分析，將移動和固定行為時期分為兩個不同的連續數據流，然后如以上使用IOs 期進行統計試驗。
[0300] 將圖2中使用的選擇性指數定義為條件之間放電率的差異除以總和。鑒定假定的 快速尖峰形成抑制神經元的標準是放電率高于20Hz和窄波形5。使用Wilcoxon符號秩檢 驗測定圖3中行為數據的統計顯著性。數據首先經線性除趨勢。在IOs期內計算圖4中描 繪的瞬時平均放電率，并且再次使用Wilcoxon秩和檢驗計算個體神經元的統計顯著性。使 用對等方差的F檢驗，測試移動性-固定性差異的分布在刺激和非刺激條件之間方差的變 化。用協方差分析（ANCOVA)測試斜率的差異。
[0301] 結果
[0302] 在充滿挑戰的條件下以積極努力采取行動消耗能量表示生物的重要決定，尤其是 因為這種行為并不總是代表大部分適應性行為。即使在極其困難的情況下選擇有力的行為 模式時（而非更節能的被動或抑郁型模式），評估可能已經出現預期結果證明能量消耗。相 反，當生物在充滿挑戰的情形下選擇不活躍的行為模式時，決定可能代表預計努力很可能 徒勞。而且，在人類中導致不活動的預期可變得不適應，包括臨床癥狀例如精神運動性阻滯 和絕望（重性抑郁癥的核心定義特征，終生患病率近20%且具有廣泛社會經濟分支的疾病 (9)。
[0303] 我們設法探查在自由移動的哺乳動物中以受限制的電路元件組的靶向控制，支 配行為狀態選擇的高水平過程。關于此類決策的神經基礎的了解很少，也不存在特別靶 向這些行為的廣泛有效的醫學療法。然而，越來越多證據表明可能牽涉前額皮質（PFC); PFC負責協調思想和行為，并且已經證實對目標導向行為、計劃和認知控制至關重要 (10, 11)一在病理狀態例如抑郁癥中其全部受損（12 - 17)，與疾病相關的額葉功能低下 (hypofrontality) (5, 18) 一致。
[0304] 而且，認為與嚙齒動物內側PFC(mPFC)的邊緣下區類似的胼胝體下扣帶的深部腦 刺激（DBS)在難治性患者（19)中引起抗抑郁作用。嚙齒動物mPFC的電刺激誘導強迫游泳 試驗（20, 21)中固定性的抗抑郁樣降低，mPFC的光遺傳刺激對糖水消耗量和社會失敗有抗 抑郁樣作用（如果同時刺激興奮性和抑制性神經元）（22)，并且嚙齒動物體內的mPFC似乎 介導了恢復和行為代理對習得性無助獲得的保護作用（23, 24)(被認為模仿重性抑郁的主 要特征）（25)。最后，對人類患者的神經成像研究已經有助于集中對腦部區域的關注，包括 在抑郁癥和憂郁狀態中表現出異常活性的PFC(5, 6, 26)。
[0305] 盡管這些開創性努力針對PFC(具有許多作用和不同傳入和傳出神經的廣泛而復 雜的區域），對充滿挑戰的情形的目標導向行為響應的實時選擇牽涉哪個特定神經通路仍 不清楚。與在嚙齒動物中廣泛采用的行為試驗一樣（27)，強迫游泳試驗（FST)與這個組織 有關。在FST中，嚙齒動物置于無法逃避的水池中，并且認為反映了行為絕望狀態（27)的 被動漂浮或固定時期與有主動逃避行為時期穿插；FST中的固定性受抗抑郁藥物（28)和應 激（29)影響。將FST中主動逃避和行為絕望狀態之間的過渡清楚地劃開界限，原則上提供 了行為狀態的明確瞬時分類和研究成為決定對挑戰采取主動行為響應的基礎的神經動力 學的機會。然而，就我們所知，由于在自由游泳的動物中記錄和控制神經活動的基本技術障 礙，在行為動物中尚未在FST期間記錄到神經活動。
[0306] 為應對這種挑戰，我們研發了一套新的記錄FST期間隨著光遺傳控制的毫秒精度 神經和行為數據的方法（圖5)。我們設計了磁感應法檢測個體游泳踢腿，其中用感應線圈 包圍FST水池并且將小磁體連接到后爪（圖5a)。FST期間，每次踢腿在線圈中感應電流 (圖5b);可能干凈地分離單次踢腿（圖6)，并且踢腿頻率與手動評分的固定性對應良好 (圖5c)，提供了對行為狀態的可靠測量（圖5d)。我們另外采用這種方法記錄在熟悉籠子 中活動期間的移動和固定狀態，正如先前在似帕金森氏病大鼠（30)中對震顫測量觀察到 的那樣，這與手動記錄的數據良好符合（圖7)。為了記錄游泳期間很好分離的單個單元和 局部場電位，植入了四極管微型硬盤或固定線陣列，然后防水。
[0307] 在這些條件下，我們能夠容易地分離FST固定和移動狀態期間的單個單元（圖 5e);事實上，我們能夠以高時間精度檢測主動逃避行為和固定狀態之間的過渡并且將這些 行為與正在進行的神經活動相關聯（圖8)。我們使用靶向mPFC的4-四極管微型硬盤（6 只大鼠）或24-電極固定線陣列（5只大鼠）記錄神經活動（圖8a)。定期記錄3個時期 的數據（圖8b):在熟悉籠子中FST之前的15min，FST期間的15min和FST后回到熟悉籠 子中的15min。我們發現許多mPFC神經元在行為期間以似乎明確反映 FST期間動作或克 制動作的決定的方式受強烈調節。示出了實例神經元（圖8c-d)。這種神經元在FST之前 和之后以固定為主的時期有高活性，但是在FST期間其在移動狀態期間保持活性而在固定 狀態期間受抑制。因此這種神經元不僅僅編碼運動活性，但是相反在對應于傳統定義的行 為絕望狀態的FST固定期間受特異性抑制。我們發現在記錄群體中許多表現出這種驚人的 活性性質的神經元（23/160,14%)。所有大鼠均在FST前期表現出最低的運動活性（對于 所有大鼠而言大于88 %固定性，平均97 %固定性）而在FST期間表現出高水平的運動活 性（對于所有大鼠而言小于79%固定性，平均39%固定性，圖Se)。記錄的大多數神經元 (129/160,81% )在FST前和FST時期之間的放電率上顯示出顯著變化（圖8f，上）。平均 來說，在FST時期這群神經元受抑制（80/129,62% )，但是記錄到選擇性反映時期整個范圍 的神經元。許多神經元（70/160,44% )也在FST時期移動和固定狀態之間放電率上顯示 出差異（圖8f，下）。這些神經元大部分在移動狀態受激活而在固定狀態受抑制（51/70， 73% )，但是也檢測到在移動狀態受抑制的神經元。
[0308] 然后我們檢查了 4個象限中具有時期和移動性依賴性神經選擇性的聯合分布（圖 8g)，并且發現其非常不對稱。其中兩個，右上和左下象限，在運動活性和神經活性之間表現 出直接對應；例如，右上象限中的神經元在很大程度移動的FST時期比在FST之前的固定時 期更具活性，并且，在FST時期內，在移動狀態下更具活性。另外兩個象限（左上和右下象 限）顯示出反向對應。在左上象限中，在更具活性的FST時期靜止的神經元實際上在FST 中的逃避行為期間激活，并且右下象限中的神經元相反。因此這些組中發現的活性性質不 僅僅取決于運動活性。有趣的是，根據原始數量和個體神經元表現出的選擇性強度，似乎存 在的在固定、行為絕望樣狀態期間受抑制的神經元比存在的在這些狀態期間激活的神經元 更多。最后我們注意到，假定快速尖峰形成的中間神經元沿兩個選擇性維度表現出調節程 度降低，表明在興奮性或投射神經元中反映對挑戰的行為響應的信號占據了更大的比例。
[0309] 因為記錄到的mPFC神經元表現出一系列選擇性，所以mPFC中光遺傳激活性局部 神經元不一定在FST期間對行為有凈效應并不明顯。為測試這一點，我們使用在CaMKII α 啟動子的控制下，表達與增強型黃色熒光蛋白融合的視紫紅質通道蛋白-2(ChR2-EYFP)的 腺相關病毒載體（AAV5)，對mPFC中的興奮性神經元限制視蛋白表達。將病毒輸注到mPFC 中并且在緣前區上植入微型光纖（圖9a-b)。通過在mPFC中的麻醉光極記錄和經照射證明 尖峰形成活性確認這些神經元的功能靶向（圖l〇a)，但是令人驚訝的是，當在FST期間的 2-min時期照射這些神經元時，我們發現刺激甚至不足以引起固定性的略微降低（圖9c)。 我們還用曠場試驗（OFT)測試了這些大鼠以評估刺激誘導的運動活性變化并且類似地沒 有找到總運動效果的證據（圖l〇b)。這些FST結果的一種解釋是局部PFC神經元可能與移 動性和固定性相關的行為狀態變化相關聯，但不是因果上牽涉其中；可選地，可能如此牽涉 一些局部PFC神經元，但是其它的在因果關系函數中不存在或相反，并且當一起驅動時，未 看到對行為的凈效應。
[0310] 因此接下來我們假設通過限制對更小mPFC神經元群體的光遺傳刺激，可能誘導 有動機的行為狀態的變化。已知mPFC投射到已經牽涉于有動機的行為和抑郁的幾個下游 腦部區域（31);其中為中縫背核（DRN) (32)，9個血清素能核中最大的一個（33, 34)并且牽 涉于重性抑郁障礙8。mPFC對DRN中的神經活性和細胞外5-HT水平施加控制（23, 35)，并且 mPFC電刺激的抗抑郁樣作用似乎取決于完整的5-HT系統（20)，但是從未直接證實從mPFC 投射到DRN對行為有影響。
[0311] 為了特異性激活mPFC-DRN投射，我們首先使用AAV5病毒載體，用受CaMKIIa啟 動子控制的ChR2-EYFP轉導mPFC中的興奮性神經元（圖9d)，這導致在DRN的mPFC軸突 中ChR2-EYFP穩健表達（圖9e ;圖Ila)。我們通過在DRN上植入微型光纖并且選擇性照射 這個區域中的mPFC軸突，限制對mPFC中投射到DRN的興奮性神經元亞群的激活（圖9d)。 通過在DRN中的麻醉光極記錄和經照射mPFC軸突證明DRN神經元的尖峰形成活性確認功 能靶向（圖l〇b)。
[0312] 當在FST期間刺激DRN中表達ChR2-EYFP的mPFC神經元的軸突時，產生深刻的行 為效應。示出了來自兩只大鼠（一只ChR2-EYFP大鼠和一只EYFP大鼠，圖9f-g)的實例感 應線圈行為軌跡，證明ChR2-EYFP情況而非對照EYFP情況下，每個開燈時期踢腿頻率強勁 增長。這種行為效應存在于大多數大鼠中并且迅速、可逆且可重復（圖9h-i)。重要的是， 這種投射的刺激不影響在曠場中的運動活性（圖9 j)，再次證明在FST期間所見的逃避行為 不是非特異性運動激活的結果。如圖9c所示，這種結果仍與經非特異性驅動所有mPFC興 奮性神經元看到缺乏效果形成鮮明對比，證明了拆分投射靶標限定的亞群的重要性，并且 說明了在驅動對充滿挑戰的環境的目標導向行為響應中特定PFC-腦干神經通路的因果作 用。
[0313] 最后，我們探索了這種光遺傳誘導的行為效應可能如何影響FST期間行為狀態的 mPFC神經編碼。對于該實驗，我們在mPFC主神經元中表達ChR2-EYFP并且在DRN上植入光 纖以便特異性激活具有這種投射的細胞。另外，我們在mPFC上植入了 24-電極固定線陣列 以記錄在這些神經元中的神經活性，同時刺激mPFC-DRN投射（圖12a)。我們記錄了來自3 只大鼠的神經活性，其全部顯示穩健的光誘導行為效應（圖12b)。而且，在幾乎全部記錄 的mPFC神經元中光影響了放電率（31/34,91% )。雖然比通過刺激激發（9/31,29% )，有 更多神經元明顯受抑制（22/31,71% )，但是群體間的平均放電率在刺激時期略微增加（圖 12c)，與特定行為狀態的選擇一致并且表明mPFC->DRN刺激對mPFC的凈效應是普遍微弱抑 制，加上mPFC網絡相對強烈的稀疏激發。我們還注意到，在刺激時期PFC中關于行為狀態 的信息減少。
[0314] 在FST中沒有刺激的時期測試了移動和固定狀態之間放電率的差異時，6 2 % (21/34)神經元明顯受調節。然而，當測試這些相同神經元在光刺激期間移動和固定狀態之 間放電率的差異時，有顯著選擇性的比例急劇下降到21% (7/34)。對每個神經元固定與移 動放電率的檢查說明了這種影響（圖12d);刺激期間的放電率顯示出對固定狀態的依賴性 低于沒有刺激的時期的放電率；這些點在最佳擬合線周圍有更緊密的分布。我們檢查了移 動和固定狀態之間放電率的原始差異并且觀察到刺激期間這種差異的分布明顯更窄（圖 12e-f)。刺激和非刺激條件之間斜率無明顯差異（ANCOVA，p = . 2041)。
[0315] 將記錄的神經元群體分為圖8g所述的4個象限，我們注意到移動-固定性編碼的 減少對于所有細胞類型適用（圖12g)，并且無論神經元增大、降低還是維持其平均放電率， 都看到這種減少。光刺激期間行為狀態的mPFC編碼的這種減少可能反映在外源應用的驅 動目標導向的刺激的存在下，對進一步恢復這種特定內源性PFC活性模式的需要降低。有 趣的是，光刺激對FST后的時期中移動性編碼沒有影響（圖12h-j)。
[0316] 在這里，我們已經使用在強迫游泳試驗中允許電記錄和光遺傳控制的新技術，連 同瞬時行為狀態的高速讀數，探查了牽涉于在充滿挑戰的情形下選擇目標導向行為的神經 關聯和因果神經通路。我們已經證明不同生理學定義的mPFC神經群體的存在一一種在行 為絕望樣狀態期受選擇性抑制，而另一種選擇性激活。我們還已證明，雖然激活mPFC中的 所有興奮性神經元對這種行為沒有凈效應，但是投射到DRN的那些mPFC神經元的選擇性激 活對響應于沒有非特異性運動激活的挑戰，積極行為狀態的選擇具有深刻、快速且可逆的 影響。
[0317] 總之，這些生理和行為結果描述了成為對充滿挑戰的情形的行為響應的基礎的神 經動力學并且證明了 DRN的mPFC控制在執行這種響應中的因果重要性，對理解行為模式選 擇的正常和病理狀態有潛在含義。
[0318] 圖5A-E :自動化FST提供了可與同時記錄的神經數據同步的高時間分辨率行為讀 數。a)自動化FST的示意圖。用線圈包圍水池并且將磁體舒適地連接到大鼠的后爪。游 泳期間磁體在線圈中的運動感應出可記錄到的電流。為了允許同時神經記錄，為探頭防水。 可將光纖包括在內用于同時光學刺激。b)實例FST線圈軌跡。描繪了線圈電壓。上：描繪 了個體踢腿的短時6s行為線圈軌跡。中：描繪了在較長時間尺度的活性的較長5min行為 線圈軌跡。下：由5min線圈軌跡估計的瞬時踢腿頻率。c)平均踢腿頻率與手動評分的固 定性估計值良好對應。d)源自感應線圈的FST固定性估計值與手動評分的固定性估計值密 切對應。e)FST期間記錄的4個良好分離的單mPFC單元。
[0319] 圖6A和6B:強迫游泳試驗中個體踢腿的檢測。a)首先過濾感應線圈軌跡 (l-6Hz)，然后整合以在每次踢腿的中點產生峰值。然后閾值化整合的軌跡（最大偏差的 10%)并檢測峰值。閾值以灰色示出。b)整合之前過濾的線圈軌跡。踢腿時間與每次踢腿 的中點對應。
[0320] 圖7A-C :磁感應法可用于檢測在籠中的固定性。a)過濾感應線圈軌跡（1-20HZ)， 閾值化（最大偏差的4%)，并檢測峰值。由于單極波形與步驟相關，所以在峰值檢測之前 未整合籠子線圈軌跡。b)自動化評分的籠子固定性與手動評分的籠子固定性對應良好。c) 平均步進頻率與手動評分的固定性對應良好。
[0321] 圖8A-G :前額葉神經元活性編碼FST行為狀態。a)在mPFC上植入4-四極管微型 硬盤（6只大鼠）或24-電極固定線陣列（5只大鼠）。b)我們記錄了 FST前在熟悉籠子中 15min(FST前），FST期間15min(FST)和FST后在熟悉籠子中15min(FST后）的數據。c) 在FST的固定狀態期間受特異性抑制的實例神經元的柱狀圖。這種神經元在FST前后基 本固定的時期和FST移動狀態期間以高速率放電，但是在FST固定狀態期間受特異性抑制 (Wilcoxon 秩和檢驗，*ρ〈0· 05 ;**p〈0. 01 ;***p〈0. 001 ;****ρ〈0· 0001)。d)相同神經元的 光柵圖。線圈軌跡為黑色，移動狀態為紫色，尖峰為紅色。上：FST前在熟悉籠子中的活性。 這種神經元在FST前的整個時期以高速率放電，其中大鼠幾乎完全不動（98%固定性）。中： FST期間的活性。這種神經元在移動狀態期間以高速率放電，但是在與行為絕望樣狀態對應 的固定狀態期間受抑制。下：FST后在熟悉籠子中的活性。這種神經元在FST后的整個時 期再次穩健放電，其中大鼠大部分不動（94%固定性）。e)FST前和FST試驗時期來自全部 11只大鼠的行為數據。大鼠在FST前的時期在熟悉的籠子中幾乎完全不動（97%固定），但 是在FST期間活躍得多（39%固定）。f)群體選擇性指數的分布（見補充方法）。上：FST 前與FST時期。示出了對于FST前與FST有顯著選擇性的所有神經元。提出了各種選擇性 性質。下：移動與固定FST狀態。示出了對于移動與固定FST狀態有顯著選擇性的所有神 經元。大多數神經元在移動FST狀態期間放電比在固定FST狀態期間多。g)選擇性指數的 聯合分布。左上象限對應在FST的固定狀態期間受特異性抑制的神經元，而右下象限描繪 了在這些狀態期間特異性激活的神經元。黑色圓圈：對任務時期和移動性均有選擇性的神 經元。紅色圓圈：實例神經元。藍色圓圈：假定抑制性快速尖峰形成的神經元。回收圓圈： 非顯著選擇性神經元。示出了記錄的所有神經元。
[0322] 圖9A-J :光遺傳刺激DRN中的mPFC軸突，而非興奮性mPFC細胞體，在具有挑戰 性的情況下誘導快速可逆的行為激活。a)在mPFC中兩側輸注AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP 或CaMKII a -EYFP并且在感染細胞體上植入光纖。b)mPFC中的EYFP熒光。c)來自 ChR2-EYFP(左側，η = 10)和EYFP(右側，η = 8)大鼠的行為數據。照射ChR2-EYFP大鼠 體內的興奮性mPFC細胞體未誘導行為效應（去趨勢數據，開燈與關燈，Wilcoxon符號秩檢 驗，P = 0.23)。灰線代表個別大鼠，而較粗的線描繪了 ChR2-EYFP(紅色）或EYFP(黑色） 大鼠的行為平均值。藍色柱指示開燈。d)在mPFC中兩側輸注AAV5CaMKII a-ChR2-EYFP或 CaMKII a -EYFP并且在DRN上植入光纖以便特異性激活mPFC-DRN軸突。e) DRN中的mPFC軸 突中的EYFP熒光（對5-HT免疫染色）。f)來自一只表達ChR2-EYFP的大鼠的行為數據。 上、中：線圈軌跡。下：踢腿頻率。光刺激期間踢腿頻率增加。藍色柱指示開燈。g)來自 一只表達EYFP的大鼠的行為數據。上：線圈軌跡。下：踢腿頻率。踢腿頻率不受光刺激影 響。h)來自所有大鼠的行為數據。左：ChR2-EYFP大鼠 （η = 16)。照射DRN中表達ChR2的 mPFC軸突在FST中誘導快速可逆的行為激活。右：EYFP大鼠 （η = 12)。照射DRN中表達 EYFP的mPFC軸突不影響行為。i)來自h的線性去趨勢數據。在ChR2-EYFP大鼠 （Wilcoxon 符號秩檢驗，P = I. 〇4e_ll)，而非EYFP大鼠（Wilcoxon符號秩檢驗，p = 0. 39 ;*p〈0. 05 ; **p〈0. 01 ;***p〈0. 001 ;****p〈0. 0001)中光刺激期間的踢腿頻率在照射期間顯者增加。j) 曠場試驗。光刺激投射DRN的mPFC神經元對ChR2-EYFP大鼠 （η = 12, Wilcoxon符號秩檢 驗，ρ = 0. 59)或EYFP大鼠 （η = 12, Wilcoxon符號秩檢驗，ρ = 0. 71)的運動活性沒有非 特異性影響。
[0323] 圖IOA和IOB :大鼠 mPFC的光遺傳刺激。a)在mPFC中兩側輸注 AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP。光極記錄檢測局部細胞體照射誘導的mPFC中的尖峰形成活性。 b) 曠場試驗。在 mPFC 中兩側輸注 AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP 或 AAV5CaMKII a -EYFP。光刺 激mPFC不影響ChR2-EYFP大鼠（Wilcoxon符號秩檢驗，ρ = 0· 50, η = 10)或EYFP大鼠 (Wilcoxon符號秩檢驗，ρ = 0. 09,η = 8)的速度。紅線指示ChR2-EYFP組平均值。灰線指 示EYFP組平均值。藍色柱指示開燈。對去趨勢數據進行顯著性計算。
[0324] 圖IlA和IlB :DRN組織學和光極記錄。a)在mPFC中兩側輸注 AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP。用綠色示出DRN中mPFC軸突中的EYFP熒光，紅色示出 了對5-HT的免疫染色，并且用白色示出了對核的DAPI染色。b)在mPFC中兩側輸注 AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP。DRN中的光極記錄檢測照射DRN中的mPFC軸突誘導的局部尖峰 形成活性。每個光脈沖均未引出尖峰。示出了 12條重疊軌跡。
[0325] 圖12A-J :光遺傳刺激投射DRN的mPFC神經元降低了移動性的mPFC編碼。a)向 mPFC兩側輸注AAV5CaMKII a -ChR2-EYFP并且在DRN上植入光纖。使24電極固定線陣列 靶向mPFC。b) 3只經注射和植入的大鼠全部在刺激期間在FST移動性上顯示出穩健增加。 c) 光刺激mPFC-DRN誘導了平均mPFC放電率的適度增大（但是見文本）。d)照射DRN中 的mPFC軸突降低了 FST期間移動狀態的mPFC編碼。每個點代表一個神經元。黑色矩形描 繪了無光刺激神經元的移動與固定放電率，而藍色圓圈描繪了有光刺激的移動與固定放電 率。光刺激使這些點在最佳擬合線周圍緊密集群。經光刺激斜率沒有顯著變化（ANC0VA， ρ = 0. 20)。e-f)移動和固定狀態間放電率變化的直方圖。上：無光刺激。下：有光刺激。 照射減小了這種分布的方差（等方差F檢驗，p = 2. lle-4)，表明在這些神經元中移動狀態 的編碼減少。g)神經元的4個象限（參見圖2f)全部顯示經光照射移動狀態的編碼減少。 h-j)當大鼠在熟悉的籠子中，并且未進行FST時，刺激對移動狀態編碼沒有顯著影響。
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[0363] 實施例3 :多巴胺神經元在條件性位置厭惡中的作用
[0364] 小鼠如實施例 1 中所述。THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 小鼠和 THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 小 鼠經受條件性位置試驗。結果示于圖13A和13B中。
[0365] 圖 13A. VTA 中感染了 AAV5-flox-eNpHR3. Ο-eYFP 或 AAV5-flox_eYFP 的 THcre+ 小 鼠。所述兩個組表現出明顯不同的行為（F(l，16) =5，p<0.001)。兩個條件形成期（琥 珀色箱）足以在THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP小鼠中誘導條件形成腔室的厭惡（#p彡0. 01， t(3.3;14))。僅THcre+/eNpHR3.0-eYFP小鼠在整個實驗期間表現出厭惡（F(3,21)= 7. 7*林p 彡 0· 001) (THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 與 THcre+/eYFP 在條件形成第 2 天，*p 彡 0· 05， t(2. 3 ;16) ;THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 與 THcre+/eYFP 在試驗當天，*p 彡 0· 05, t(2. 2 ;16))。 圖13A中，上方的線為Thcre/eYFP ;下方的線為THcre/eNpHR2. Ο-eYFP。圖13B.注意到在 試驗前，當小鼠在兩個腔室內所花時間相等時，沒有初始厭惡。條件形成后，在VTA DA細 胞中表達eNpHR3. Ο-eYFP的小鼠在試驗當天對條件性腔室顯示出明顯厭惡（對于THcre+/ eNpHR3. Ο-eYFP小鼠而言，試驗前一天與試驗當天*p彡0. 05, t(2. 5 ;14)，但對照小鼠未顯 示（THcre+/eNpHR3. Ο-eYFP 與 THcre+/eYFP 在試驗當天，*p 彡 0· 05t2. 2 ;16n = 10)。圖 13B中，"試驗前"和"試驗"數據集中的左側柱為THcre/eYFP ;"試驗前"和"試驗"數據集 中的右側柱為 THcre/eNpHR3. 0-eYFP。
[0366] 雖然已經參考其具體實施方案描述了本發明，但是本領域的技術人員應理解，在 不背離本發明的精神和范圍的前提下可做各種變化并且可代用等效方案。另外，可做許多 修改以使特定情況、材料、物質組成、工藝、工藝步驟適于本發明的目的、精神和范圍。旨在 使所有此類修改均屬于所附權利要求的范圍之內。
【權利要求】
1. 一種鑒定治療個體抑郁癥的候選試劑的方法，包括： 使在腹側被蓋區（VTA)多巴胺能神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳抑制因 子的嚙齒動物與試驗試劑接觸，并且 在抑郁癥測定中測定所述試驗試劑對所述嚙齒動物行為的影響， 其中與尚未接觸所述試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了所述試驗試劑的所 述嚙齒動物抑郁行為減輕，表明所述試驗試劑為治療抑郁癥的候選試劑。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述活性光遺傳抑制因子為鹽細菌視紫紅質 (NpHR)多肽，其包含與SEQ ID N0:1中列出的NpHR氨基酸序列有至少約95%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述NpHR由為在多巴胺能神經元中表達NpHR而 提供的啟動子可操作連接的核苷酸序列編碼。
4. 根據權利要求2所述的方法，其中所述NpHR包含內質網輸出信號序列和膜運輸信號 序列。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述測定在將所述VTA暴露于激活所述光遺傳抑 制因子的波長的光之后或同時進行。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述抑郁癥測定為強迫游泳試驗、懸尾試驗或條 件性位置厭惡試驗。
7. -種轉基因嚙齒動物，其包含表達具有神經元功能的光遺傳抑制因子的腹側被蓋區 多巴胺能神經元。
8. 根據權利要求7所述的轉基因嚙齒動物，其中所述具有神經元功能的光遺傳抑制因 子為鹽細菌視紫紅質（NpHR)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1中列出的NpHR氨基酸序列有至 少約95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9. 根據權利要求8所述的轉基因嚙齒動物，其中所述NpHR由為在多巴胺能神經元中表 達NpHR而提供的啟動子可操作連接的核苷酸序列編碼。
10. 根據權利要求8所述的轉基因嚙齒動物，其中所述NpHR包含內質網輸出信號序列 和膜運輸信號序列。
11. 一種鑒定治療個體抑郁癥的候選試劑的方法，包括： 使在腹側被蓋區（VTA)多巴胺能神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因 子的嚙齒動物與試驗試劑接觸，并且 在抑郁癥測定中測定所述試驗試劑對所述嚙齒動物行為的影響， 其中與尚未接觸所述試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了所述試驗試劑的所 述嚙齒動物抑郁行為減輕，表明所述試驗試劑為治療抑郁癥的候選試劑。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中進行所述測定無需將所述VTA暴露于激活所述 光遺傳抑制因子的波長的光。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中所述具有神經元活性的光遺傳活化因子為視紫 紅質通道蛋白多肽，其包含與SEQ ID N0:5中列出的視紫紅質通道蛋白氨基酸序列有至少 約95 %氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述視紫紅質通道蛋白由為在多巴胺能神經元 中表達所述視紫紅質通道蛋白而提供的啟動子可操作連接的核苷酸序列編碼。
15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述視紫紅質通道蛋白包含內質網輸出信號序 列和膜運輸信號序列。
16. -種篩選試劑促進個體抑郁癥的能力的方法，所述方法包括： 使在腹側被蓋區（VTA)多巴胺能神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化因 子的嚙齒動物與試劑接觸，并且 在抑郁癥測定中測定所述試劑對所述嚙齒動物行為的影響， 其中與尚未接觸所述試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了所述試劑的所述嚙齒動 物的抑郁行為，表明所述試劑促進抑郁癥。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述活性光遺傳活化因子為視紫紅質通道蛋 白。
18. 根據權利要求16所述的方法，其中VTA多巴胺能神經元中具有神經元活性的所述 活性光遺傳活化因子在所述VTA暴露于激活波長的光后激活。
19. 一種篩選試劑促進個體抑郁癥的能力的方法，所述方法包括： 使在內側前額葉皮質（mPFC)興奮性神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳活化 因子的嚙齒動物與試劑接觸，并且 在抑郁癥測定中測定所述試劑對所述嚙齒動物行為的影響， 其中與尚未接觸所述試劑的對照嚙齒動物的行為相比，接觸了所述試劑的所述嚙齒動 物的抑郁行為，表明所述試劑促進抑郁癥。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述活性光遺傳活化因子為視紫紅質通道蛋 白。
21. 根據權利要求19所述的方法，其中所述接觸在將中縫背核（DRN)暴露于激活所述 光遺傳活化因子的波長的光之前或同時進行。
22. -種鑒定治療個體不良心理狀態的候選試劑的方法，所述方法包括： 使在腹側被蓋區（VTA)多巴胺能神經元中表達具有神經元活性的活性光遺傳抑制因 子的嚙齒動物與試驗試劑接觸，并且 在條件性位置厭惡（CPA)試驗中測定所述試驗試劑對所述嚙齒動物行為的影響， 其中與尚未接觸所述試驗試劑的對照嚙齒動物的行為相比，對接觸了所述試驗試劑的 所述嚙齒動物CPA反應行為的調節，表明所述試驗試劑為治療個體不良心理狀態的候選試 劑。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中所述不良心理狀態為煩躁不安、快感缺失、抑 郁、自殺或焦慮。
24. 根據權利要求22所述的方法，其中所述活性光遺傳抑制因子為鹽細菌視紫紅質 (NpHR)多肽，其包含與SEQ ID ΝΟ:1中列出的NpHR氨基酸序列有至少約95%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述NpHR由為在多巴胺能神經元中表達NpHR 而提供的啟動子可操作連接的核苷酸序列編碼。
26. 根據權利要求24所述的方法，其中所述NpHR包含內質網輸出信號序列和膜運輸信 號序列。
27. 根據權利要求22所述的方法，其中所述測定在將所述VTA暴露于激活所述光遺傳 抑制因子的波長的光之后或同時進行。
【文檔編號】A61N5/06GK104270942SQ201380022721
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2012年3月20日
【發明者】K·A·戴瑟羅斯, K·M·泰, M·R·瓦登 申請人:斯坦福大學托管董事會