誘導抗原特異性調節性t細胞的方法

文檔序號：1293104閱讀：420來源：國知局

誘導抗原特異性調節性t細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及引發載有凋亡細胞或凋亡體的未成熟抗原呈遞細胞的方法。本發明還涉及體外或體內獲得抗原特異性調節性T細胞的方法。載有凋亡體/凋亡細胞的細胞和調節性T細胞可通過用溶細胞性CD4+T細胞誘導抗原呈遞細胞凋亡來獲得。所述細胞用于抑制或預防疾病，例如自體免疫疾病、移植物排斥和過敏性疾病，以及與其相關的藥物。還公開了用于抑制或預防疾病，例如自體免疫疾病、移植物排斥和過敏性疾病的抗原特異性調節心T細胞以及其相關藥物的應用。還公開了通過所述方法獲得的抗原特異性調節性T細胞的群。
【專利說明】誘導抗原特異性調節性T細胞的方法發明領域
[0001] 本發明涉及獲得抗原特異性調節性T細胞的方法及其作為藥物治療病癥（如自體免疫疾病、過敏性疾病或移植排斥）的應用。
[0002] 發明背景
[0003] 調節性T細胞（Treg)，尤其是表達轉錄受體Foxp3 (叉頭框P3)的Treg，是維持正常免疫穩定狀態所必需的。在此類細胞不存在時，自體免疫迅速發展，并伴隨臨床表現例如糖尿病和其它自體免疫疾?。▍⒁奡akaguchi等·（2012)Nature Med. 18, 54-58)。 Foxp3+Treg在胸腺中被主動選擇，并且組成周圍血液中發現的細胞群,其穩定表達Foxp3。在同種識別由胸腺上皮細胞呈遞的自身肽后的胸腺中選擇細胞的閾值使得在外周血中發現具有顯著親和性的Foxp3+細胞，這與效應T細胞不同。目前的觀點是，外周耐受尤其通過弱親和性的自身抗原特異性效應細胞與Foxp3+細胞之間的平衡由此提供平衡至耐受來得以維持。除了對Treg的所述中心選擇以外，細胞可在外周被轉化以表達轉錄因子Foxp3。然而，表達低于胸腺選擇的群，并且觀察到獲取的表型具有一些可逆性。
[0004] 天然Treg的性質,如選擇自胸腺中并且以高度且穩定地表達Foxp3為特點，使其就作為控制以自體免疫應答為特點的疾病的手段以及保持對移植物或受控過敏原的不需要應答的治療工具等而言具有吸引力。然而，外周中的抗原特異性天然Treg非常低，并且使其體內甚至體外擴增的方法既不確定又不可靠。一種能夠選擇性擴增Treg群的方法將有可能防止或抑制疾病進程但不影響器官產生有益應答的整體能力。
[0005] 凋亡，或程序性細胞死亡，是幫助維持組織穩定狀態的生理學機制（參見Fuchs和 Steller(2011)Cell 147,742-758)。已經計算在人體中，每分鐘有多至IO6個細胞通過凋亡被損毀。須控制通過細胞死亡而釋放的大量抗原，從而避免引發針對自身蛋白質的免疫應答。實際上，凋亡的細胞被清除細胞（主要是未成熟樹突細胞）攝取，然后以某種方式被處理以誘導耐受。源自凋亡細胞的抗原的交叉呈遞出現在II類主要組織相容性復合體（MHC) 中，已知其引發F 〇Xp3+Treg的表達。因此，在炎性狀態不存在時發生的細胞凋亡，顯示了使調節性T細胞擴增的一種生理學途徑。
[0006] 因此，需要設計一種能夠誘導呈遞自體抗原或引起不希望的免疫應答（例如，過敏性疾病或移植物排斥）的抗原的細胞凋亡的方法，這之后將產生凋亡體，導致抗原特異性Treg的表達。本領域已知的非特異性免疫抑制治療法通常易于發生嚴重感染和其它嚴重后果，其嚴重影響生活質量。因此，開發采用抗原特異性Treg來治療免疫疾病但不產生傳統療法的不利后果的方法是有利的。
[0007] W02008/017517中已經描述了能夠引發抗原特異性溶細胞性CD4+T細胞（cCD4+T 細胞）的一般方法。此類細胞在同類識別肽-MHC II類復合體之后誘導抗原呈遞細胞的凋亡。不同于且優于現有技術，本發明提供通過誘導抗原呈遞細胞凋亡來擴增抗原特異性 Foxp3 Treg，所述抗原呈遞細胞攜帶源自移植物釋放的同種抗原、自體抗原或免疫原的II 類限制性表位。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明描述引發抗原特異性Foxp3+調節性T細胞的方法。
[0010] 這些方法包括如下一般步驟：
[0011] (a)獲得抗原特異性溶細胞性⑶4+T細胞；
[0012] (b)通過使抗原呈遞細胞接觸所述溶細胞性CD4+T細胞來誘導所述抗原呈遞細胞的凋亡；
[0013] (C)由所述抗原呈遞細胞的凋亡獲得凋亡細胞和凋亡體；和
[0014] (d)使所述凋亡細胞或凋亡體與能夠呈遞來自所述凋亡細胞或凋亡體的抗原的細胞孵育。
[0015] C⑶4+T (溶細胞性⑶4+細胞）細胞可通過主動免疫動物然后采用被覆有表面特異性抗體的磁珠進行親和純化來制備獲得。通常使⑶8+、⑶19+、⑶127+細胞減少。
[0016] 或者，體外獲得CCD4+T細胞，該方法包括從動物分離原初CD4+T細胞，并在培養中接觸包含本文中或W02008/017517中所述的側接殘基內含硫還原酶（thioreductase)基序的II類限制性表位?；蛘?，可體外獲得cCD4+T細胞，該方法包括從動物分離極化的CD4+T 細胞，并在培養中接觸包含本文中或W02008/017517中所述的側接殘基內含硫還原酶基序的II類限制性表位。
[0017] 所述C⑶4+T細胞可用于體內誘導抗原呈遞細胞的凋亡，該方法包括傳遞動物中的cCD4+T細胞，該動物主動產生針對由cCD4+T細胞識別的抗原的免疫應答。
[0018] 在本發明方法的實施方式中，所述CCD4+T細胞在體外用于與抗原呈遞細胞培養，所述抗原呈遞細胞呈遞由CCD4+T細胞識別的表位，以產生或獲得凋亡體。
[0019] 在本發明方法的其它實施方式中，使未成熟抗原呈遞細胞載上體外培養所得的凋亡體，并且所述未成熟抗原呈遞細胞用于采用獲自未處理動物的CD4+T細胞群通過循環刺激來產生或獲得抗原特異性Treg。
[0020] 在本發明的另一個方面中，載有體外培養所得的凋亡體的所述未成熟抗原呈遞細胞用于被動傳送進入需要治療的動物。
[0021] 在本發明的另一個方面中，載有凋亡體的所述未成熟抗原呈遞細胞用于體外產生或獲得Treg,以供被動傳送至需要治療的動物。
[0022] 在本發明的特定方面中，通過本文所述的方法獲得（和/或分離）的Treg用于預防或治療對所述預防或治療有需要的患者的疾病。所述疾病可以是自體免疫疾病、過敏性疾病或移植物排斥。
[0023] 本發明的方面設計獲得載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的方法。這些方法包括如下步驟：
[0024] a)提供針對某一抗原的抗原特異性溶細胞性⑶4+T細胞，
[0025] b)提供抗原呈遞細胞，呈遞所述抗原，
[0026] c)使所述抗原呈遞細胞接觸所述溶細胞性CD4+T細胞，由此誘導所述抗原呈遞細胞凋亡；
[0027] d)從經歷步驟c)中的凋亡的抗原呈遞細胞分離凋亡細胞或凋亡體；和
[0028] e)使所述凋亡細胞或凋亡體與能夠呈遞來自所述凋亡細胞或來自所述凋亡體的抗原的細胞孵育，由此獲得載有所述凋亡細胞或凋亡體的細胞。
[0029] 除此以外，這些方法還可包括步驟f)用于通過使步驟e)的負載細胞接觸其它 ⑶4+T細胞源來獲得抗原特異性調節性T細胞，由此獲得抗原特異性調節性T細胞群。這些細胞對已用于產生所述抗原特異性溶細胞性CD4+T細胞的抗原具有特異性。
[0030] 此類抗原特異性調節性T細胞通常是Foxp3高⑶4+Τ細胞。
[0031] 根據某些實施方式，⑶4+T細胞的源選自下組：原初⑶4+T細胞、極化的⑶4+T細胞，和天然Treg。
[0032] 根據某些實施方式，能夠呈遞來自所述凋亡細胞或來自所述凋亡體的抗原的細胞選自下組：樹突細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞和能夠表達MHC II類決定簇的細胞。步驟d) 中分離的凋亡細胞或凋亡體可通過親和純化、離心、凝膠過濾、磁珠分選或熒光激活的分選來分離。
[0033] 能夠呈遞來自凋亡細胞或凋亡體的抗原的細胞可以是通過外周血單核細胞或骨髓源性前體轉化的未成熟的抗原呈遞細胞。
[0034] 用于所述方法的實施方式的抗原可以是自體免疫抗原、免疫原或移植排斥中涉及的抗原。
[0035] 本發明方法的實施方式中，抗原特異性溶細胞性CD4+T細胞通過如下方式獲得：使外周血細胞與肽接觸，所述肽包含所述抗原的MHC II類限制性表位和具有基序 [CST] -X (2) -C 或 C-X (2) - [CST]的序列。
[0036] 在本發明方法的實施方式中，抗原特異性溶細胞性CD4+T細胞獲自原初CD4+T細胞、極化的CD4+T細胞或來自天然Treg。在這些方法的其它實施方式中，進行將步驟e)中獲得的載有所述凋亡細胞或凋亡體的細胞分離的額外步驟。
[0037] 本發明方法的其它實施方式包括將通過所述方法獲得的抗原特異性調節性T細胞分離的步驟。
[0038] 在特定實施方式中，基于表面標志物⑶25和/或CTLA_4(通常均高度表達）的表達或基于細胞因子TGF-β和/或IL-10或基于Foxp3的表達來將抗原特異性調節性T細胞分成不同亞組。
[0039] 本發明的另一方面涉及通過上述方法獲得的抗原特異性Treg的群。
[0040] 本發明的另一方面涉及作為藥物應用的通過上述方法獲得的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
[0041] 本發明的另一方面涉及作為藥物應用的通過上述方法獲得的抗原特異性調節性T 細胞的群。
[0042] 另一個方面涉及包含通過上述方法獲得的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群和藥學上可接受的運載體的藥物組合物。
[0043] 另一方面涉及包含通過上述方法獲得的抗原特異性調節性T細胞和藥學上可接受的運載體的藥物組合物。
[0044] 本發明的另一方面涉及治療或預防哺乳動物疾病的方法，所述疾病選自自體免疫疾病、過敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動物對象如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。哺乳動物通常是人。
[0045] 本發明的另一方面涉及治療或預防哺乳動物疾病的方法，所述疾病選自自體免疫疾病、過敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動物對象載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。哺乳動物通常是人。
[0046] 可用上述細胞治療的疾病包括自體免疫疾病、過敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病。
[0047] 所述自體免疫疾病可以是全身性或器官特異性的自體免疫疾病。
[0048] 所述自體免疫疾病可針對抗原例如甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體、胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質細胞蛋白和熱激蛋白HSP65。
[0049] 針對過敏原的過敏性疾病可以是針對空氣傳播過敏原、食物過敏原、接觸過敏原或全身性過敏原的過敏反應。
[0050] 移植物排斥可以是細胞來源或組織來源的移植物排斥。
[0051] 本發明的另一個方面涉及通過上述方法獲得的抗原特異性調節性T細胞用于評價抗原特異性調節性T細胞的作用機制的應用。
[0052] 附圖簡要說明
[0053] 圖1顯示在女性受者上移植的男性皮膚移植物中的Foxp3+調節性T細胞的累積。在該移植物中，有12. 5%的⑶3+淋巴細胞群顯示為Foxp3+細胞，對比正常皮膚中的1 % (η =3只小鼠/組）。
[0054] 發明詳述
[0055] 定義
[0056] 本文所用的術語"肽"指包含由肽鍵連接的2?200個氨基酸的氨基酸序列的分子，但其可包含非氨基酸結構（例如，連接有機化合物）。本發明方法中所用的肽可包含任何20個常規氨基酸或其修飾形式，或可包含通過化學肽合成或通過化學或酶修飾引入的非天然發生的氨基酸。本文所用的術語"抗原"指某種大分子結構，通常是蛋白質（含或不含多糖）或由包含一個或多個半抗原且包含T細胞表位的蛋白質組合組成。
[0057] 本文所用術語"抗原性蛋白質"指包含一個或多個T細胞表位的蛋白質。本文所用的自體抗原或自體抗原性蛋白質指體內存在的人或動物蛋白質，其引發相同人或動物體內的免疫應答。
[0058] 術語"食物或藥物抗原性蛋白質"指天然存在于食物或藥物產品（例如疫苗）中的抗原性蛋白質。
[0059] 本文所用的術語"表位"指抗原性蛋白質的一個或數個部分（其可定義一個構象表位），所述部分被抗體或其部分（Fab'、Fab2'等）或存在于B或T細胞淋巴細胞的細胞表面的受體特異性識別并結合，并能夠通過所述結合來誘導免疫應答。
[0060] 本
【發明內容】
中的術語"T細胞表位"指顯性、亞顯性或隱性T細胞表位，S卩，被T淋巴細胞的細胞表面受體特異性識別并結合的抗原性蛋白質的部分。表位是顯性、亞顯性或是隱性取決于針對所述表位引起的免疫反應。顯性取決于所述表位在蛋白質的所有可能T 細胞表位中被T細胞識別以及能夠激活T細胞的頻率。在【具體實施方式】中，T細胞表位是由MHC II類分子識別的表位，其由與所述MHC II分子的槽契合的8或9個氨基酸的序列 (視該II類單體型而定）組成。在代表T細胞表位的肽序列中，將該表位中的氨基酸編號為P1-P9,該表位N末端的氨基酸編號為P-1、P-2等，該表位C末端的氨基酸編號為P+1、 P+2 等。
[0061] 術語"自體抗原"指由相同物種的兩個個體之間的蛋白質多態性產生的抗原。
[0062] 術語"自體反應性"指針對移植物受體和供體之間的等位差異而產生的免疫應答。自體反應性應用于抗體和T細胞。在本
【發明內容】
中，其涉及T細胞自體反應性，這基于T細胞對由肽-MHC復合體的MHC決定簇內容中呈遞的自體抗原的識別。
[0063] 術語"主要組織相容性抗原"指屬于人HLA系統（小鼠的H2)的分子，其被分為兩個一般類別。MHC I型分子由含有3個結構域的單一多態性鏈組成（α 1、2和3)，其與細胞表面上的β 2微球蛋白相關。I類分子由在人類中稱為Α、Β和C的3個基因座編碼。此類分子向⑶8+亞組的T淋巴細胞呈遞肽。II型分子由2條多態性鏈組成，其各自含有2條鏈（α 1和2,以及β 1和2)。這些II類分子由在人類中稱為DP、DQ和DR的3個基因座編碼。
[0064] 術語"次要組織相容性抗原"指源自正常細胞蛋白質并且被屬于I類和/或II類復合體的MHC呈遞的肽。在質上或量上影響此類肽在細胞表面上呈現的任何遺傳多態性可產生次要組織相容性抗原。
[0065] 述及表位時，本文所用的術語"同源物"指這樣的分子：所述分子與天然發生的表位具有至少50%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%氨基酸序列相同性，由此保持該表位與抗體或B細胞和/或T細胞的細胞表面受體結合的能力。某一表位的具體同源物對應于天然表位而言在至多三個，更具體地至多兩個，更具體地至多一個氨基酸上有修飾。
[0066] 述及肽，本文所用的術語"衍生物"是指至少含有肽活性部分（例如，能夠引發細胞溶解性CD4+T細胞活性）的分子，并且所述分子還包含可以具有不同目的（諸如使所述肽穩定或改變所述肽的藥代動力學或藥效性質）的互補部分。
[0067] 本
【發明內容】
中，術語"具有還原活性的有機化合物"指對蛋白質的二硫鍵具有還原活性的化合物，更具體地，氨基酸序列。
[0068] 所述術語"免疫紊亂"或"免疫疾病"指生物體內免疫系統的反應引起或維持失常或非生理狀況的疾病。免疫疾病包括過敏性疾病和自體免疫疾病。
[0069] 本文所用術語"過敏性疾病"或"過敏性紊亂"指以免疫系統對于稱作免疫原的特定物質（例如花粉、刺毛、藥物或食物）的超敏反應為特征的疾病。過敏，是遺傳性過敏癥個體患者接觸使其敏感化的過敏原時所顯示的跡象和癥狀的統稱，其可導致發展出各種疾病，尤其是呼吸道疾病和癥狀，例如支氣管哮喘。存在不同類型的分類方法，并且大多數過敏性疾病根據其在哺乳動物體內發生的位置而具有不同的名稱。"超敏反應"是不希望的 (破壞性、造成不舒適而有時致命）的反應，其在個體接觸使其敏感化的抗原之后于該個體中產生；"速發型過敏反應"視IgE抗體的產量而定并因而等同于過敏癥。
[0070] 術語"自體免疫疾病"或"自體免疫紊亂"指生物體針對其自身細胞或組織的異常免疫應答導致的疾病，這歸因于該生物體無法識別其自身組成部分（低至亞分子水平）為 "自身"。該組疾病可被分為兩類：器官特異性（例如愛迪生病、溶血性貧血或惡性貧血、古德帕斯丘綜合征、格氏病、特發性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病、青少年糖尿病、葡萄膜炎、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、天皰瘡、過敏性皮膚炎、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、自體免疫性肺炎、自體免疫性心肌炎、重癥肌無力、血管球性腎炎和自發性不育癥，以及全身性疾病，例如紅斑狼瘡、銀屑病、血管炎、多肌炎、硬皮病、多發性硬化、強直性脊柱炎、類風濕性關節炎和干燥綜合征。因此，自身免疫病癥針對自身細胞或組織，并且包含針對"自體抗原"的反應，自體抗原表示的抗原（例如，蛋白質）是特定哺乳動物生物體自己的組成部分。在這種機制中，由B-細胞和/或T-細胞識別自體抗原，其會引起針對所述自體抗原的免疫反應。
[0071] 術語"自體免疫疾病"或"自體免疫紊亂"所包括的疾病的非限制性列表包含：急性播散性腦脊髓炎（ADEM)、阿狄森氏病、斑禿、抗磷脂抗體綜合征（APS)、自身免疫性溶血、自體免疫性肝炎、大皰性類天皰瘡、白塞氏病、腹部疾病、炎性腸?。↖BD)(諸如克羅恩病和潰瘍性結腸炎）、皮肌炎、1型糖尿病、古德帕斯徹氏綜合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征（Guillain-Barr6 syndrome) (GBS)、橋本病、特發性血小板減少性紫癜、紅斑狼瘡、混合型結締組織病、多發性硬化（MS)、重癥肌無力、嗜睡癥、慢性天皰瘡、惡性貧血、銀屑病、銀屑病性關節炎、多肌炎、原發性膽汁性肝硬化、類風濕性關節炎（RA)、舍格倫綜合征、顳動脈炎、脈管炎、韋格納肉芽腫病和特應性皮炎。
[0072] "過敏原"定義為一種物質，通常是大分子或蛋白質成分，其在有傾向的、尤其是遺傳傾向的個體（特應性）患者中引發IgE抗體產生。相似定義見于Liebers等.（1996) Clin. Exp. Allergy 26,494-516。
[0073] 術語"炎性疾病"或"炎性紊亂"指其中顯示炎癥的典型特征的疾病。因此，該術語可能與其中也顯示炎性方面的其它疾病重疊。本領域已知"急性炎癥"和"慢性炎性疾病" 之間存在差異。術語"炎性疾病"或"炎性紊亂"包括但不限于選自下組的疾?。侯愶L濕性關節炎、結膜炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、支氣管炎、結核、慢性膽囊炎、炎性腸病、急性胰炎、敗血癥、哮喘、慢性阻塞性肺病、皮膚炎性疾病例如銀屑病和特應性皮炎、全身炎性反應綜合征（SIRS)、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)、癌癥相關炎癥、腫瘤相關血管生成的減少、糖尿病、移植物V.宿主疾病與相關聯的組織排斥炎性反應的治療、克羅恩氏病、遲發型超敏反應、免疫介導的和炎性CNS疾病要素；例如，阿茲海默癥、帕金森病、多發性硬化等。術語"治療有效量"指在患者中產生所需治療或預防效果的細胞數。例如，述及疾病或紊亂，其為一定程度上使所述疾病或紊亂的一種或多種癥狀減少，尤其是使與所述疾病或紊亂相關或引起所述疾病或紊亂的生理學參數或生化參數部分或完全回復至正常的細胞數。根據本發明的一個【具體實施方式】，所述治療有效量是導致正常生理狀況改善或恢復的細胞數。例如，當用于治療性治療受免疫疾病影響的哺乳動物時，其為每天的細胞數/kg該哺乳動物體重。
[0074] 本文中述及肽或序列時，術語"天然的"指該序列與天然發生的序列相同。這包括群體中大多數所具有的野生型序列，但也包括群體中出現的不常見的多態性和突變。相反，術語"人工的/人造的"指自然中不存在的序列或肽。任選地，人工序列通過對天然序列進行有限修飾而獲得，所述修飾例如更換天然發生序列中的一個或多個氨基酸，向天然發生序列的N末端或C末端添加氨基酸。本文中，氨基酸采用其全名、三字母縮寫形式或單字母縮寫形式表示。
[0075] 〃F〇xp3〃（叉頭框P3)是叉-翼螺旋轉錄因子家族的成員，其在天然發生的⑶4-陽性/⑶25-陽性T調節細胞（Treg)的發育和功能中起重要作用。
[0076] 〃Treg〃（調節性T細胞）Treg涉及對不適當免疫應答的主動抑制。這些細胞是 CD4+、CD25+、FoxP3+ 細胞。
[0077] "原初cd4+T細胞〃表達⑶62L，低度或中度表達⑶44,低產細胞因子，無優選通路。〃極化的⑶4+細胞〃具有高⑶44表達并生成有限的細胞因子組。
[0078] 〃cCD4+T細胞〃溶細胞性CD4+T細胞已在WO 2009/101207中具體表征，并且以如下性質中的一種或多種為特點：_轉錄阻遏物Foxp3的表達不可檢測，
[0079] -絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT相較于天然⑶4+調節性T細胞而言活性增加，
[0080] -TGF-β的產量不可檢測，并且IL-10的產量不可檢測或與天然⑶4+調節性T細胞相比產量極低，
[0081] -相較于天然⑶4+調節性T細胞而言的高IFN- Y濃度，
[0082] -抗原性刺激后，轉錄活化劑T-bet和GATA3共表達，
[0083] -NKG2D 表達，
[0084] -產生高濃度的可溶性Fas配體（Fasl)。
[0085] 發明描述
[0086] 本發明的一般原理涉及獲自載有特異性抗原的抗原呈遞細胞的凋亡體用于引發抗原特異性F 〇Xp3+Treg生成的應用。具體而言，本發明的目的是：提供從以MHC II類決定簇呈遞自體抗原或引發不希望的免疫應答的抗原（例如，過敏原、來自移植物的自體抗原或用于治療目的的同種異體因子）的抗原呈遞細胞獲得選擇性凋亡的方法。如下文更詳細地描述，因此，本發明提供產生、獲得或分離抗原特異性Treg的方法，由此提供使特定針對給定抗原的免疫應答停止的可能性。
[0087] 被誘導凋亡的細胞經歷許多表面變化，包括磷脂酰絲氨酸、多糖和糖脂的氧化，這使所述細胞可被吞噬細胞識別。此外，凋亡細胞表達新蛋白質，例如凝血栓蛋白-1和/或使胞內組分定位于其表面，所述胞內組分例如磷脂酰絲氨酸、DNA和核小體。這些表面變化共同為巨噬細胞吞噬凋亡細胞而不觸發先天免疫反應提供可能（在先天受體例如Toll樣受體、NOD或RIG不存在的情況下）。
[0088] 移除凋亡細胞的吞噬細胞具有識別受體（例如CD14)、清除受體和C型凝集素受體 (Ravichandran 和 Lorenz (2007) Nature Rev. Tmmunol. 7, 964-974)。清除受體是能夠與氧化的或乙?；牡兔芏戎鞍祝↙DL)以及多陰離子配體和凋亡細胞結合的表面糖蛋白。清除受體的例子包括⑶36、L0X-1和CLA-1。識別之后是快速內化，以及在凋亡細胞的情況中的破裂和與內體和溶酶體的融合。特別感興趣的是凋亡細胞產生的凝血栓蛋白-1，其作為連接吞噬細胞上表達的CD36的可溶橋。凝血栓蛋白-1的表達是半胱天冬酶依賴性的。 [0089] 可溶因子還在凋亡細胞的移除中起作用。示例包括膠原凝集素和膠原凝集素樣分子，例如甘露糖結合凝集素和Clq。所述兩者均與吞噬細胞表面表達的鈣網蛋白相互作用。正五聚蛋白家族，其包括血清淀粉體P(SAP)和C-反應性蛋白（CRP)，而原型正五聚蛋白（PTX)也結合凋亡細胞?？傊?，有許多因子在生理學條件下用于處理經歷自然程序性細胞死亡或凋亡的細胞（Jeannin 等·（2008) Curr. Opinion in Immunol. 20, 530-537)。哺乳動物中，細胞持續更新以維持正常細胞數量和活性（Steinman等.（2000) J. Exp. Med. 191，411-416)。在不存在炎性條件的情況下，凋亡體被器官由抗原呈遞細胞攝取，所述細胞遷移至局部淋巴結，并在此處與淋巴結樹突細胞進行凋亡體交換，該交換直接發生或因遷移抗原呈遞細胞快速裂解而發生。發現遷移至局部淋巴結的樹突細胞中的至少一些是未成熟的，其顯示吞噬凋亡細胞的高能力。在淋巴結中，樹突細胞開始處于未成熟狀態，但似乎屬于顯示以I類和II類決定簇呈遞抗原的能力的亞組。在與非炎性條件相關的共刺激信號不存在的情況下，MHC II類呈遞提供對Treg所需信號的募集和活化。此類Treg是抗原特異性的（導向自體抗原）并且阻遏針對此類自體抗原的反應的活性。因此，在非炎性情況下發生的凋亡引發抗原特異性Treg，這維持對于自身抗原的耐受。
[0090] 相反地，在炎性條件下，因為其自體免疫疾病中發生或響應同種抗原或過敏原或在準確針對感染劑的免疫應答過程中發生，所以凋亡體產量增加，其被帶至局部淋巴結。所述載有凋亡體的細胞的大量流入超過了淋巴結樹突細胞捕獲并呈遞所述凋亡體從而招募并激活Treg的能力。因此，促炎性細胞因子的存在改變了淋巴結樹突細胞的表型，其被誘導成熟并且最終使效應T細胞活化增加至破壞Treg。盡管這是對感染劑的響應過程中希望的效果，但在自體免疫疾病、過敏性反應和移植物排斥中，這不幸地導致其它組織損傷和炎癥。因此，設計一種使非炎性情況下生成或獲得凋亡體的能力增加，以產生、獲得或分離抗原特異性Treg的方法是有利的。
[0091] 在對于采用側接殘基內攜帶硫還原酶基序的MHC II類限制性表位的CCD4+T細胞的引發的研究（尚未公開）過程中，出乎預料地發現CD4+誘導的結果是目標器官中 F〇Xp3+Treg的累積。因此，在皮膚移植物排斥模型中，同種異源移植物的長期持續伴隨該移植物本身中Foxp3+Treg的存在。在多種硬化癥實驗模型中進行了相同觀察，其中疾病的預防和抑制伴隨著中樞神經系統（CNS)白質中Foxp3+Treg的累積。
[0092] 因此，在【具體實施方式】中，本發明方法包括攜帶W02008/017517(其通過引用納入本文）中所述側接殘基內含硫還原酶基序的MHC II類限制性表位的應用。
[0093] 一般而言，用于本發明實施方式的肽是包含可能觸發免疫反應的抗原（自身或非自身）的至少一種T細胞表位的肽，其偶聯至具有還原活性的有機化合物，例如含硫還原酶序列基序[CST]-X(2)-[CST]，其中至少一個[CST]是Cys;因此所述基序是 [C]-X(2)-[CST]或[CST]-X(2)-[C]。在【具體實施方式】中，肽包含序列基序[C]-X(2)-[CS] 或[CS]-X(2)-[C]。在更具體的實施方式中，肽包含序列基序C-X(2)-S、S-X⑵-C或 C-X(2)-C。所述T細胞表位和所述有機化合物任選地由接頭序列分隔。
[0094] 這些肽可以通過化學合成來制備，其允許引入非天然氨基酸。因此，在還原性化合物的基序中，C代表半胱氨酸或具有硫醇基團的其它氨基酸，例如巰基纈氨酸、同型半胱氨酸或具有硫醇功能的其它天然或非天然氨基酸。為了具有還原活性，所述基序中存在的半胱氨酸應不作為胱氨酸二硫橋的部分或作為氧化的半胱氨酸出現。不過，該基序可包含經修飾的半胱氨酸，例如甲基化的半胱氨酸，其在體內被轉化成具有三個硫醇基團的半胱氨酸。
[0095] 還原性化合物的[CST]-X(2)-[CST]基序中的氨基酸X可以是任何天然氨基酸，包括S、C或T或可以是非天然氨基酸。具體而言，X是具有小側鏈例如Gly、Ala、Ser或Thr 的氨基酸。或者，不是具有大側鏈例如Tyr的氨基酸。更具體地，[CST]-X(2)-[CST]基序中的至少一個X是His或Pro。
[0096] 在包含上述基序的作為還原性化合物的肽中，所述基序如此定位：當表位嵌合進入MHC槽時，該基序留在該MHC結合槽的外側。所述基序的位置直接毗鄰所述肽內的毗鄰所述表位序列，或與所述T細胞表位由一個接頭隔開。更具體地，所述接頭包括7個或更少氨基酸的氨基酸序列。最具體地，所述接頭包含1、2、3或4個氨基酸?；蛘?，接頭包含5、6、 7、8、9或10個氨基酸。在基序序列與表位序列相鄰的那些肽中，這指示為相較于表位序列的P-4位至P-I位或Ρ+l位至P+4位。
[0097] 除還原性基序以外，此類肽包含（如現有技術中所述）源自抗原的T細胞表位，所述抗原通常是過敏原或自體抗原，視應用而定。蛋白質序列中的此類T細胞表位可通過功能性實驗和/或一種或多種計算機預測實驗來鑒定。
[0098] 合適算法見述于，例如 Zhang 等，（2005)Nucleic Acids Res 33,W180-W183(PREDBALB) !Salomon 和 Flower(2006)BMC Bioinformatics 7,501(MHCBN) ;Schuler 等，（2007)Methods Mo/Biol. 409,75-93(SYFPEITHI) ;Donnes 和 Kohlbacher(2006)Nucleic Acids Res.34,W194-W197(SVMHC) ;Kolaskar 和 Tongaonkar(1990)FEBS Lett. 276, 172-174 和 Guan 等，（2003)Appl Bioinformatics 2, 63-66(MHCPred)。
[0099] T細胞表位序列中的氨基酸根據其在MHC蛋白的結合槽中的位置來編號。通常，肽內存在的T細胞表位由8?25個氨基酸組成，然而更具體地，由8?16個氨基酸組成，然而最具體地，由7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個氨基酸組成。
[0100] 更具體地，所述T細胞表位由9或8個氨基酸的序列組成。更具體地，所述T細胞表位是由MHC II類分子呈遞至T細胞的表位。尤其所述T細胞表位序列是嵌合進入MHC II蛋白裂隙的表位序列，更具體而言是嵌合進入所述MHC II裂隙的九肽。
[0101] 肽的T細胞表位可以對應蛋白質的天然表位序列，或者可以是其修飾形式，前提是修飾的T細胞表位與天然T細胞表位序列相似，保留其在MHC縫隙內結合的能力。修飾的T細胞表位就MHC蛋白而言可具有與天然表位相同的結合親和性，但也可以具有較低親和性。在此類情況中，經修飾肽的結合親和性相較原始肽降低不小于10倍，更優選降低不小于5倍。
[0102] 可衍生用于本發明方法的實施方式的T細胞表位的（自體）抗原的示例有甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體、胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質細胞蛋白和熱激蛋白HSP65。
[0103] 并不意在限制并受理論限制，作用的一般機制包括如下步驟：
[0104] (a)載有凋亡體的未成熟樹突細胞引發對以MHC II類決定簇中存在的決定簇具有特異性的Treg。
[0105] (b)這些Treg遷移至不希望的免疫應答發生的位置。
[0106] (c)這些Treg在所述目標位置處的累積導致因所述Treg的大量抗炎性性質所致的對于炎癥的控制。
[0107] (d)抑制組織破壞和凋亡細胞產生，并重新建立該目標位置處正常細胞的周轉，由此恢復正常組織功能。
[0108] 本發明提供能夠獲得抗原特異性Treg的方法的多種實施方式。在本發明方法的一個實施方式中，抗原呈遞細胞的凋亡可通過與CCD4+T細胞接觸而在體外獲得。使未成熟樹突細胞載有凋亡體。載有凋亡體的未成熟樹突細胞用于細胞治療，或用于體外產生、分離或獲得供于細胞治療的抗原特異性Treg。本
【發明內容】
中的細胞治療包括制備用于給予哺乳動物的細胞的步驟。
[0109] 本領域中描述并已知用于誘導細胞體外凋亡的一般方法。例如，⑶4+T細胞淋巴細胞的凋亡可通過在針對CD3和CD28的不溶性抗體存在下培養所述細胞來獲得。用于測定細胞是否實際凋亡的方法是本領域中熟知的。這些方法包括使膜聯蛋白V與凋亡細胞表面上表達的磷脂結合，胱冬酶的激活，以及核酸降解。關于這些方法的綜述可見于出版物如 Fuchs 和 Steller (2011)，Cell 147, 742-758。
[oho] 與現有技術不同，本發明中，抗原呈遞細胞中誘導的凋亡需要在所述抗原呈遞細胞（APC)和所述誘導凋亡的細胞（即，CCD4+T細胞）之間形成突觸。所述突觸的形成激活 cCD4+T細胞的溶細胞性質，導致僅誘導呈遞對應抗原衍生的II類限制性表位的細胞的凋亡。有利的是，這提供嚴格的抗原特異性。在用于該試驗系統的任何其它試劑（例如抗CD3 抗體）不存在時，本發明方法中描述的凋亡的體外誘導再現與體內存在那些接近的條件。
[0111] 通過⑶4+T細胞的抗原呈遞細胞的凋亡已被Janssens等人報道，Janssens 等.（2008) J. Immunol. 171,4604-4612)。在一些情況中，Treg可能誘導靶細胞凋亡，而凋亡的多種機制已經描述，包括在穿孔蛋白存在或不存在下激活粒酶B的IDO釋放。關于這些機制的綜述可見于（Shevach (2011)Adv. Immunol. 112, 137-176)。在本發明方法中，cCD4+T 細胞代表獨特的細胞亞組，與Treg在表型上和功能性質上均有差異。能夠誘導此類cCD4+T 細胞的方法可見于W02008/017517。
[0112] 用于鑒定和分離凋亡體的方法是本領域已知的。凋亡細胞或凋亡體在其表面上表達多種新組分，從而使所述凋亡細胞或凋亡體易受可溶性因子的調理，如上所述。這兩種變化形式提供分離凋亡細胞或凋亡體的方式。關于此的示例可見于本領域（Schiller 等·（2008)Cell Death Diff. 15, 183-191)。一個示例是采用針對凝血栓蛋白的抗體來分離細胞或細胞碎片，其因進入凋亡周期而表達凝血栓蛋白。
[0113] 本發明的一個實施方式中，使分離的凋亡體或凋亡細胞與樹突細胞孵育以允許吞噬、加工和在MHC II類決定簇中的呈遞。已描述了樹突細胞的不同亞組，其在功能上、表面表型和成熟度上均有差異。一般而言，未成熟的樹突細胞具有攝取凋亡細胞和凋亡體的高能力，但可能就在MHC II類決定簇中表達表位而言并不有效。然而，樹突細胞的一些亞基，尤其是封在淋巴結內的那些，結合這兩種性質，在其表面表位呈遞攝取凋亡細胞或凋亡體。
[0114] 然而，在本
【發明內容】
中，樹突細胞通過本領域熟知的方法衍生自體外并且保持在未成熟狀態。本領域教導樹突細胞在干擾素 -Y (IFN- γ )存在下的衍生化誘導高度成熟狀態，而IL-4將樹突細胞保持在未成熟狀態。樹突細胞可源自外周血單核細胞或骨髓前體。如上所述獲得的凋亡細胞和凋亡體與未成熟的樹突細胞孵育，由此允許通過MHC II類決定族呈遞。
[0115] 本領域技術人員應清楚，優選樹突細胞，但并不排除獲得能夠呈遞由凋亡細胞或凋亡體加工的抗原的呈遞細胞的方法。代替方式包括但不限于巨噬細胞、內皮細胞或上皮細胞，其可以MHC II類表達誘導。
[0116] 本發明的另一方面涉及載有源自凋亡細胞或凋亡體的抗原的樹突細胞在細胞治療中的應用。通過示例方式，將通過呈遞自體抗原的抗原呈遞細胞上的CCD4+T細胞的溶細胞作用所獲得的樹突細胞靜脈內給予受疾病影響的動物，所述樹突細胞呈遞源自凋亡體的 II類限制性表位，該疾病中涉及針對自體抗原的免疫應答。所述細胞治療的結果是特異性抑制所述免疫應答并治愈所述疾病。其它示例如下所示，但本發明的范圍不限于這些示例。在本發明方法的特定實施方式中，使載有凋亡細胞或凋亡體的未成熟樹突細胞維持在培養中，并向其添加 CD4+T細胞的群，孵育以產生、分離或獲得Treg?？刹捎脭捣NCD4+T細胞的可能來源，包括但不限于：從未處理動物獲得并采用例如被覆有特異性抗體的磁珠通過親和性來制備的細胞；獲自動物脾、淋巴結、組織或外周血的極化的CD4+T細胞，其中所述動物具有涉及針對（自體）抗原的免疫應答的疾病病程，就該疾病而言需要引發Treg;或確定為顯示高且穩定的轉錄Foxp3受體表達的天然Treg。
[0117] 本領域技術人員應清楚，這三種CD4+T細胞來源在給定相關環境中可能各有優勢。例如，原初CD4+T細胞甚至更易從外周血進入并提供足夠大的庫以識別任何抗原。在優選預防疾病進程的情況中，而其中可尤其根據給定動物的MHC II類單體型來選擇抗原，原初CD4+T細胞將是最佳選擇。另一方面，極化的CD4+T細胞是用于在優選采用對肽-MHC 復合體具有較高親和性的細胞的情況中實踐本發明方法的細胞來源。一個例子是，在1型糖尿病中發現自體反應性CD4+T細胞，其中對CD4+T細胞對胰島素原型肽的識別主要通過與肽-MHC復合體的不完全結合而發生，導致相對低的T細胞受體親和性。
[0118] 本發明中，一個實施方式是采用天然Treg作為來源。Treg的庫針對對于自體抗原的識別而形成，并且如上所述，此類細胞具有足夠的親和性來與抗原呈遞細胞功能上形成突觸。針對給定抗原的抗原特異性天然Treg的數量過低，因為此類Treg僅為總CD4+T細胞數的5-10%。本發明提供能使所述低數量體外增加的方法。在本發明方法中，采用胸腺選擇的天然Treg的另一個好處是,經報道它們表型穩定性。因此,在天然Treg中,Foxp3高表達且隨時間在不同活化條件下維持穩定。相反，Treg誘導進入外周并且獲取Foxp3表達可能不穩定，這是因為沒有對于Treg系確定的表觀特征，從而在其活化的環境變化時（例如在炎性條件下）其調節性質減弱。
[0119] 在本發明的另一個方面中，采用通過與呈遞來自凋亡細胞或凋亡體的抗原的未成熟的樹突細胞體外培養擴增的Treg (天然Treg)或誘導的（原初或極化的）Treg進行基因治療。所述治療可作為預防性治療給予，例如預防移植物排斥，或作為抑制治療給予，例如在1型糖尿病中。
[0120] 任選地，通過本發明所述的方法獲得的Treg在需要更大數量的此類Treg時可另采用非特定方法擴增。此類非特定方法的示例是本領域中已知的。例如，在不溶性抗CD3 和抗CD28抗體和IL-2存在下孵育的細胞可被擴增數個數量級。
[0121] 本領域技術人員應清楚，在給予細胞之前，可添加其它步驟。一種可能是通過將細胞與載有一種或多種合成肽的MHC II類決定簇的四聚體孵育來進一步限制Treg的特異性，所述合成肽是希望用于定向Treg的肽。另一種可能是，通過表面標志物或不同Foxp3 的表達程度來分選出細胞。已知Foxp3表達特別高的細胞群是整個天然Treg群的部分，并且顯示使其適合于本
【發明內容】
的特點。
[0122] 在本發明的另一個方面，通過本發明方法獲得的Treg可用于建立關于疾病進程發展的給定抗原或表位的關聯性。在許多疾病中，有多于一種抗原涉及病程，而仍舊難以鑒定最重要的一種。通過實施本發明方法來產生抗原特異性Treg提供關閉特異性抗原的方法，以作為分離和鑒定疾病發展中特異性抗原的作用的手段。
[0123] 通過本發明方法獲得的抗原特異性Treg提供確定Treg表型在其功能中的重要性的方法。舉例而言，比較根據粒酶的表達和粒酶+與粒酶（_)的群來分選的抗原特異性 Treg的抑制體外或體內應答的能力。
[0124] 本發明的多個方面和實施方式通過如下實施例進行說明。然而，這并不意在將本發明的范圍限制到這些實施例。實施例
[0125] 實施例1.體外凋亡的誘導
[0126] 抗原呈遞細胞（APC)制備自C57BL/6小鼠并用涵蓋實驗性自體免疫腦脊髓炎 (EAE)中涉及的自體抗原的II類限制性T細胞表位的肽加載，用于多發性硬化癥模型。
[0127] 因此，具有序列VGffYRSPFSRVVHLYRTSEQ ID. NO: 1]的髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白 (MOG)肽，對應于MOG蛋白的氨基酸殘基37-52，被用于加載細胞。
[0128] 該肽包含優勢T細胞表位。Pl位，即錨定至MHC II類槽的第一個氨基酸是 Y40(P1-P9序列加有下劃線）。
[0129] 溶細胞性⑶4+Τ細胞（c⑶4+Τ細胞）獲自動物的脾，所述動物用氫氧化鋁和50 μ g 的SEQ ID. NO: 1的肽免疫四次，其中所述肽的氨基末端的3個氨基酸被序列CGPC替代，生成序列 CGPCYRSPFSRVVHLYR「SEQ ID.N0:2]的肽。
[0130] c⑶4+T細胞細胞在加載的APC存在下于37°C下培養過夜并洗滌，而采用針對活化的半胱天冬酶3的抗體來檢測APC的凋亡程度。
[0131] 實施例2.凋亡體的分離
[0132] 實施例1中獲得的凋亡細胞的上清液經收集并進行兩次離心步驟（500xg，5分鐘）以移除細胞。然后，將該上清液過濾通過1. 2 μ M親水性注射器濾器。以100, OOOxg離心30 分鐘后，沉淀中所含的凋亡體經收獲并用于細胞實驗。
[0133] 或者，凋亡細胞和凋亡體可采用針對因凋亡而表達的細胞表面組分的抗體來通過親和性分離。這些的示例有抗凝血栓蛋白抗體。在優選的制備步驟中，抗凝血栓蛋白抗體共價偶聯至磁性微珠。在20°C下柔和振蕩孵育1小時后，磁珠保留在磁鐵上。然后，通過用弱酸性緩沖液洗脫來回收凋亡體。
[0134] 這些方法是本領域已知的。（Schiller 等·（2008)Cell Death Diff. 15, 183-191 ; Gautier 等·（1999)J. Tmmunol. Methods 228, 49-58)
[0135] 實施例3.產生或獲得未成熟的樹突細胞（iDC)
[0136] 從上膝和下膝骨獲得骨髓祖細胞。分別采用CD19和CD90微珠利用磁性減少來移出B和T淋巴細胞。包含⑶19-⑶90-iDC祖細胞的陰性分離部分重懸在含有500U/ml重組 GM-CSF的無血清培養基中并接種（3xl06個細胞/ml)在組織培養板上并保持在37°C。細胞每隔一天清洗一次，持續6天，避免破壞聚集體。在第6天，移出iDC聚集體，清洗并加至新板。在第7天，收獲細胞并用于分析。
[0137] 這些方法是本領域已知的。參見例如，Inaba等.（2009)Curr. Prot. iHiMinoI. 1 (86)，第 3. 7.單兀第 10-12 頁。
[0138] 實施例4.產生或獲得載有抗原的未成熟樹突細胞
[0139] iDC顯示吞噬凋亡體的高能力。因此，將實施例3中獲得的iDC與實施例2中獲得的凋亡體孵育。就此而言，通過在37°C孵育30分鐘來將2xl0 5個iDC鋪板于微型培養孔。然后將凋亡體的懸液添加至培養物并在37°C另孵育16小時。細胞然后經清洗并重懸于培養基中。
[0140] 實施例5.載有抗原的樹突細胞用于細胞治療的應用
[0141] 載有凋亡體的iDC通過靜脈內途徑注射（2xl05)進入疾病誘導之前或之后的動物。
[0142] 因此，對C57BL/6小鼠進行如下方案，包括在完全弗氏佐劑中給予MOG肽（參見實施例1的SEQ ID:N01的肽）和分枝桿菌提取物，并注射2次百日咳毒素。該方案在MOG肽給予后兩周內引發與人多發性硬化癥相當的病征的發展。
[0143] 在該模型中，載有凋亡體的iDC (如實施例4中所得）在疾病誘導前一天或首次觀察到疾病病征之后（即誘導后兩周）注射至小鼠。
[0144] 未經iDC注射的動物，或未載有iDC的動物經注射作為對照。在實驗組和兩組對照組中評價疾病病征的預防或抑制。
[0145] 實施例6.載有抗原的樹突細胞用于引發抗原特異性Treg的應用。
[0146] 允許載有凋亡體的iDC體外產生Treg。
[0147] 因此，使實施例4中所述的iDC保持在培養中。
[0148] 采用抗體通過磁性微珠分選從未處理小鼠的脾分離T細胞，以排除⑶8+、⑶19+、 ⑶127+細胞，然后進行⑶25+細胞正選擇。⑶4+F 〇Xp3s細胞的百分比通過熒光活化的細胞分選（facs)采用Foxp3特異性抗體在細胞透過后檢測。本領域公開了獲得此類細胞的方法（Peters 等.（2003)Plos one 3,574-584)。獲得純度高于 85%的細胞。
[0149] 然后將⑶4+F〇Xp3S細胞（IxlO6個細胞/孔）添加至實施例4所述的iDC培養物。在37°C 7天的刺激循環后，在IL-2 (20IU/ml)存在下，細胞經洗滌并根據相同方案采用載有凋亡體的新一批iDC再孵育。在該第二次刺激循環之后，可任選地通過與被覆有抗CD3和抗CD28抗體的磁珠在IL-2的存在下孵育來進一步擴增細胞。細胞經洗滌并通過facs評價Foxp3表達。
[0150] 實施例7.抗原特異性Treg用于細胞治療的應用
[0151] 實施例6中制備的細胞可用于在自體免疫疾病的情況下被動給予。
[0152] 因此，按照與實施例5中所述相似的方案但包括IV注射2xl05個⑶4+Foxp3 S細胞代替iDC。
[0153] 顯示相較于未注射⑶4+Foxp3S細胞的對照動物而言，有疾病病征的顯著預防和/ 或抑制。
[0154] 實施例8.分選出抗原特異性Treg供于分析目的
[0155] 還可分析⑶4+Foxp3 S細胞群來確定單一組分或合并組分重要性的作用機制。
[0156] 因此，⑶4+F〇Xp3 S細胞采用被覆有針對FasL的抗體的微珠分離。然后，功能性測試兩群細胞FasL+和FasL(-)，并比較其引發耐受的能力。這采用分析系統進行，其中，多克隆效應⑶4+淋巴細胞（以⑶4+⑶25(-)表型為特點）從未處理動物的脾分離。
[0157] 天然Treg通常通過其顯示對效應細胞的旁路抑制的能力來確定。本文所用的分析系統涉及⑶4+⑶25+T細胞群的活化，所述活化通過非特異性刺激，即聯合抗-⑶3和抗-⑶28抗體進行。
[0158] 將FasL+CD4+Foxp3高細胞抑制CD4+CD25 (_) T細胞增殖的能力與FasL (_) ⑶4+Foxp3*細胞做比較。
[0159] 顯示表達FasL的細胞顯示較高的抑制效應細胞增殖的能力。
[0160] 實施例9. Foxp3Treg在皮膚移植物中的累積
[0161] 8?10周齡的C57BL/6雌性小鼠注射50 μ g的肽來免疫，然后進行皮膚移植，所述肽涵蓋側接殘基內含硫氧還基序的Dby(ccDby)的II類限制性表位，如W02009/100505中所述。
[0162] 將雄性同系供體的完整厚度的皮膚移植在受體的背部，并跟蹤排斥跡象。所有小鼠耐受該移植物。在移植后6周取該移植物的活檢，供于組織學分析。顯示Foxp3+細胞在該移植物中累積。
[0163] 作為比較，正常皮膚中Foxp3+T細胞的含量示于圖1。
【權利要求】
1. 一種獲得載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的體外方法，所述方法包括如下步驟： a) 提供針對某一抗原的抗原特異性溶細胞性CD4+T細胞， b) 提供抗原呈遞細胞，呈遞所述抗原， c) 使所述抗原呈遞細胞接觸所述溶細胞性CD4+T細胞，由此誘導所述抗原呈遞細胞凋亡； d) 從經歷步驟c)中的凋亡的抗原呈遞細胞分離凋亡細胞或凋亡體；和 e) 使所述凋亡細胞或所述凋亡體與能夠呈遞來自所述凋亡細胞或來自所述凋亡體的抗原的細胞孵育，由此獲得載有所述凋亡細胞或凋亡體的細胞。
2. 如權利要求1所述的方法，所述方法用于獲得抗原特異性調節性T細胞，所述方法還包括如下步驟： f) 使權利要求1所述的步驟e)的加載細胞與另一個CD4+細胞來源接觸，由此獲得抗原特異性調節性T細胞的群。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性調節性T細胞是Foxp3高 ⑶4+T細胞。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述CD4+T細胞的來源選自下組：原初 ⑶4+T細胞、極化的⑶4+T細胞，和天然Treg。
5. 如權利要求1?4中任一項所述的方法，其特征在于，所述能夠呈遞來自所述凋亡細胞或來自所述凋亡體的抗原的細胞選自下組：樹突細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞和能夠表達 MHC II類決定簇的細胞。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述凋亡細胞或凋亡體在步驟d)中通過親和純化、離心、凝膠過濾、磁珠分選或熒光活化的分選來分離。
7. 如權利要求1?6中任一項所述的方法，其特征在于，所述能夠呈遞來自所述凋亡細胞或所述凋亡體的抗原的細胞選自下組：通過轉化外周血單核細胞或骨髓源性的祖細胞獲得的未成熟抗原呈遞細胞。
8. 如權利要求1?7中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗原是自體免疫抗原、過敏原或涉及移植物排斥的抗原。
9. 如權利要求1?8中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性溶細胞性 CD4+T細胞通過如下方式獲得：使外周血細胞與肽接觸，所述肽包含所述抗原的MHC II類限制性表位和具有基序[CST] -X (2) -C或C-X (2) - [CST]的序列。
10. 如權利要求1?9中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性溶細胞性 ⑶4+T細胞獲自原初⑶4+T細胞、極化的⑶4+T細胞或源自天然Treg。
11. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：分離步驟e)中獲得的所述載有凋亡細胞或凋亡體的細胞。
12. 如權利要求2或3中所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：分離所述抗原特異性調節性T細胞。
13. 如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：基于表面標志物⑶25和/或CTLA-4的表達或基于細胞因子TGF-0和/或IL-10的產生或基于Foxp3 的表達來將所述抗原特異性調節性T細胞分成不同的亞組。
14. 如權利要求2?10中任一項所述獲得的抗原特異性Treg的群。
15. 如權利要求1或權利要求5?11中任一項所述獲得的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
16. 作為藥物應用的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。
17. 用于治療或預防自體免疫疾病、過敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。
18. 用于治療或預防全身性或器官特異性自體免疫疾病的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。
19. 用于治療或預防針對某抗原的自體免疫疾病的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群，所述抗原選自下組：甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體、胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質細胞蛋白和熱激蛋白HSP65。
20. 用于治療或預防針對某過敏原的過敏性疾病的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群，所述過敏原選自下組：空氣傳播過敏原、食物過敏原、接觸過敏原和全身性過敏原。
21. 用于治療或預防細胞來源或組織來源的移植物排斥的如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。
22. 如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞在評價所述抗原特異性調節性T細胞作用機制中的應用。
23. 用于治療或預防自體免疫疾病、過敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
24. 用于治療或預防全身性或器官特異性自體免疫疾病的如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
25. 用于治療或預防針對某抗原的自體免疫疾病的如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群，所述抗原選自下組：甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體、胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質細胞蛋白和熱激蛋白HSP65。
26. 用于治療或預防針對某過敏原的過敏性疾病的如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群，所述過敏原選自下組：空氣傳播過敏原、食物過敏原、接觸過敏原和全身性過敏原。
27. 用于治療或預防細胞來源或組織來源的移植物排斥的如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
28. -種治療或預防哺乳動物對象疾病的方法，所述疾病選自下組：自體免疫疾病、過敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動物對象如權利要求14所述的抗原特異性調節性T細胞的群。
29. -種治療或預防哺乳動物對象疾病的方法，所述疾病選自下組：自體免疫疾病、過敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動物對象如權利要求15所述的載有凋亡細胞或凋亡體的細胞的群。
【文檔編號】A61P37/06GK104411818SQ201380022688
【公開日】2015年3月11日申請日期:2013年4月29日優先權日:2012年4月30日
【發明者】J-M·圣萊美申請人:英塞斯股份有限公司, 魯汶天主教大學

完整全部詳細技術資料下載