用于穩定干燥的生物材料的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于生產生物藥物試劑的干燥制劑的方法，所述方法旨在使所述試劑在干燥時的活性損失最小并提供貯存期延長的干燥制劑。該方法包括干燥水性溶液的步驟，除了該生物藥物試劑，該水性溶液至少還包括氨基酸、多元醇和金屬鹽。優選地，所述氨基酸是谷氨酸，所述多元醇是山梨糖醇并且任選的還有甘露醇，并且所述金屬鹽是鎂鹽。該溶液是通過真空干燥法或低壓凍干法干燥。所述方法可特別用于制備病毒(如脊髓灰質炎病毒或呼吸道合胞病毒)的干燥制劑，以用于疫苗接種。本發明還涉及根據本發明的方法制備的干燥制劑以及它們作為藥物(如作為疫苗)的用途。
【專利說明】用于穩定干燥的生物材料的方法和組合物

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于穩定和保存干燥的生物材料的方法和組合物。這些生物材料包括 生物藥物（如疫苗，特別是病毒疫苗）的低壓凍干制劑或者真空干燥制劑。因此，本發明涉 及生物藥物的生產和制劑領域，還涉及疫苗學領域。

【背景技術】
[0002] 考慮到生物化合物通常是脆弱的和易損壞的，這些化合物的長期貯存造成了獨特 的挑戰。幾乎沒有生物化合物可在液體環境中、溶液中或懸浮液中足夠穩定以使得它們能 夠被分離、純化并且在非冷凍條件下（尤其是在室溫或更高的溫度下）以溶液形式儲存較 長時間。
[0003] -種改善生物藥物的穩定性的方法是轉化它們為干燥狀態[17]。在商業上和實際 應用中，以干燥形式貯存生物化合物都帶來巨大的益處。不僅它們的貯存期會延長，成功干 燥的試劑、材料和組織還具有減少的重量，且需要的貯存空間減少。這不僅對成品有用，如 在3個月到2年內使用的最后批的疫苗，而且也可用于貯備（1-50年或更長時間的貯存）毒 種批、原液（bulk)或最后批。與低溫貯存方案及其相應成本相比，干燥材料的室溫貯存是 有更高性價比的。另外，許多遞送途徑--包括粉劑的肺部遞送、通過包衣微針或溶解微針 進行的真皮遞送、通過粉劑或可溶解的針進行的腸胃外遞送--依賴于復雜的制劑方式。 現有幾種生產干燥的生物化合物的技術，包括噴霧干燥法、真空干燥法、風干法、涂覆法、泡 沫干燥法。其中一種最古老和常用的技術是冷凍干燥法，也稱作低壓凍干法。在很長一段時 間里，冷凍干燥法更多地被看作是一門技術而非一門科學，這成為科學方法和研究的障礙。
[0004] 最經常用于制備固體生物藥物的方法是低壓凍干法。這種方法由冷凍步驟和之 后的兩次干燥步驟組成，在第一次干燥中凍結的水被升華作用除去，第二次干燥中非凍結 的一結合Il水被除去。冷凍應力或者干燥應力能改變生物藥物的熱力學穩定性并且能引 起或促進蛋白質解折疊。解折疊能導致生物藥物的不可逆變性，但也能減少處于干燥狀態 的I&存穩定性[19]。對于穩定的凍干品（Iyophilisate)，使用賦形劑作為穩定劑和/或填 充劑。已證實，不同的化合物，如糖、聚合物、氨基酸和表面活性劑，能夠在低壓凍干期間和 隨后的貯存期間改善生物藥物的穩定性[18, 20]。在文獻中，記載了認為賦形劑在冷凍、干 燥和隨后的貯存期間如何保護生物藥物（如蛋白質和疫苗）的幾種機制。在穩定的低壓凍 干疫苗的合理配制和過程設計的開發中，理解不同穩定劑的低溫保護（cryo-)和凍干保護 (Iyoprotection)機制是很重要的[21]。
[0005] 在冷凍期間，生物藥物的物理環境劇烈改變，導致形成影響蛋白質性質的生物藥 物的完整性的應力。在冷凍期間生物藥物接觸到的最關鍵的應力是低溫、冷凍濃度和冰的 形成[18, 19, 21，22]。冷變性是生物藥物由于溫度下降而失去它們的緊密折疊結構的現象。 對于冷變性，當前接受的解釋是基于在更低的溫度下水與非極性基團之間的接觸自由能的 改變，這會弱化疏水作用從而破壞生物藥物的結構[19, 20, 23]。由于冰的形成，所有溶質的 濃度在冷凍期間顯著增高。與濃度相關的所有變化，例如離子強度、溶質結晶化和相分離， 都有可能使生物藥物不穩定[21]。
[0006] 通過冷凍應力，所述制劑的最初相對組成和pH能避免生物藥物變質的發生。例 如，已在一些生物藥物中發現，在冷凍前增加所述制劑中該生物藥物相對于其它賦形劑的 濃度，將會提高凍融過程中該生物藥物的穩定性[24]。類似地，溶液中所述生物藥物的最佳 初始PH，將會在凍融后獲得完整生物藥物的最高復原[20]。
[0007] 即使在優化所有這些因素之后，一些生物藥物仍然在凍融期間變性，因此需要添 加劑來使蛋白質/生物藥物的變性最小化。來自完全不同化學類別的不同賦形劑能提供低 溫保護。根據一溶質排斥假說II，已證明低溫保護劑優先地不與水性溶液中的生物藥物的 表面接觸[24]。已測定了各種賦形劑在各種生物藥物的存在下的溶質排斥的熱力學現象， 所述賦形劑如鹽、氨基酸、甲胺、聚乙二醇、多元醇、表面活性劑和糖[19, 21，24, 25]。
[0008] -玻璃化假說Il是廣泛知曉的動力學機制。根據該機制，冷凍濃度和溫度下降兩 者都提高粘度，減少流動性和減緩所有動力學進程。當該系統到達玻璃態時，玻璃中的所有 分子都變得在物理上（如變性、聚集作用）和在化學上（如氧化作用、水解作用、脫酰胺作 用）靜止，且生物藥物降解的速率常數減小[19, 26]。
[0009] 在冷凍過程中形成的冰-水界面可能引起表面變性。添加表面活性劑可以減小生 物藥物溶液的表面張力從而減少生物藥物的吸附和聚集[25, 27]。
[0010] 通過提高所述制劑的玻璃化轉換溫度（glass transition temperature)和通過 抑制小的穩定添加劑（如二糖）的結晶化，聚合物可以穩定生物藥物[18, 22]。通過降低緩 沖鹽結晶的速度和范圍并因而抑制pH變化，氨基酸也可以使生物藥物免受冷凍變性[18]。 [0011] 在水性溶液中，生物藥物是完全水合的，這意味著該生物藥物具有覆蓋生物藥物 表面并與生物藥物表面相互作用（通過氫鍵）的水單層[28]。干燥會除去部分水合外層 (hydration shell)，這可能破壞所述生物藥物的自然狀態而導致變性。為了在干燥過程中 防止變性，需要保護劑。這類保護劑的重要穩定機制被稱作一水替代假說Il [18-20, 29]。 糖（如蔗糖和海藻糖）、多元醇[20, 30]和氨基酸[31]能與干燥的生物藥物形成氫鍵。如 此，當水合外層被除去時，它們能充當水替代物。無定形玻璃的形成，如上解釋為一玻璃化 假說Il，也是一種重要的保護機制。
[0012] 除了水的替代物和玻璃態的形成，一些賦形劑（尤其是聚合物）能通過提高玻 璃化轉化溫度（T g)來使生物藥物穩定，玻璃化轉化溫度（Tg)被定義為橡膠態（液體樣） 和玻璃態（固體樣）之間的轉化溫度。一般來說，T g越高，玻璃中的分子流動性越低（如 生物藥物、穩定化合物、氧和水的運動），且干燥過程和隨后貯存期間生物藥物制劑越穩定 [18, 22]。涉及到在干燥期間生物藥物的穩定并且適用于多糖和其它聚合物的其它機制，是 在小的賦形劑的溶質濃縮期間抑制結晶，這種小賦形劑在干燥過程中穩定所述生物藥物。
[0013] 由于一些賦形劑對松散環境（bulk environment)而不是生物藥物試劑量表面的 偏愛（之前稱為一溶質排斥II)，它們能擔當填充劑，這表示它們為最終的塊狀物（final cake)提供機械支持，使產品更精巧（elegance)，且在干燥期間防止產品破裂。甘露醇和 甘氨酸經常被使用作填充劑，因為它們的無毒性、高溶解度、和高的低共熔溫度（eutectic temperature) [18, 25, 32]。大多數氨基酸是潛在的填充劑并且它們很容易結晶[33]。
[0014] 如果所述生物藥物在干燥過程中是穩定的，那么以干燥狀態長期貯存通常是可行 的。盡管通常來說，干燥過程本身對所述生物藥物是最有害的，但是，如果配制不當，干燥的 生物藥物仍可在貯存過程中失去它們的結構或效能。在貯存期間，對于生物藥物劑而言，聚 集是主要的物理不穩定性因素。不同的化學降解作用（如脫酰胺作用、氧化作用和水解作 用）也可能在貯存過程中發生，但取決于轉變的殘基的位置，這些改變未必會影響所述生 物藥物的活性。還原糖（如葡萄糖和蔗糖）能與生物藥物中的賴氨酸和精氨酸殘基反應， 以通過麥拉德反應形成碳水化合物加合物，麥拉德反應是一種棕黃反應，能導致貯存過程 中低壓凍干的生物藥物的活性明顯喪失。
[0015] 貯存溫度是影響固態生物藥物試劑穩定性的最重要因素之一。影響長期貯存穩定 性的其它因素是所述制劑的玻璃化轉變溫度（Tg)、制劑pH和干燥后的剩余水含量。在貯存 過程中，干燥制劑的水分含量可能由于幾個原因而明顯改變，包括阻塞物的水分釋放、非結 晶賦形劑的結晶或來自賦形劑水合物的水分釋放。如果在制劑中所用賦形劑的量不合適， 那么用于在干燥過程中穩定生物藥物試劑的賦形劑可能使固態的生物藥物試劑不穩定。并 且，在貯存期間存在非晶形賦形劑結晶的風險，因為結晶狀態在熱力學上比玻璃態更加穩 定[39]。一些糖和多元醇具有結晶的傾向，但這受它們在制劑中的相對含量、貯存溫度和 相對濕度的強烈影響[18, 40]。另外，幾種賦形劑的相對組成和非結晶穩定劑（如聚合物） 的存在，可抑制賦形劑的結晶。
[0016] 在長期貯存期間，干燥狀態的生物藥物試劑的穩定機制與用低壓凍干保護的那 些穩定機制相似，包括無定形玻璃態的形成、水取代以及賦形劑與生物藥物試劑之間的 氫鍵結合[41]。為了實現最大化穩定固態形式的生物藥物試劑，要求聯合使用這些機制 [18, 42]。低壓凍干產品的最終品質由賦形劑（包括緩沖劑、填充劑和穩定劑）的選擇和低 壓凍干過程決定。
[0017] 脊髓灰質炎是一種主要影響幼兒的高度傳染性疾病。對于由脊髓灰質炎病毒的三 種血清型（1型、2型或3型）中任何一種引起的這種疾病，沒有特別的治療方法，但該疾病 可通過疫苗接種預防。目前，口服脊髓灰質炎疫苗（Sabin 0PV)是選擇用于爭取全球根除 脊髓灰質炎的疫苗。然而，主要的顧慮是OPV具有復原為能導致癱瘓的形式的能力，所謂的 疫苗相關的麻痹型脊髓灰質炎（VAPP)。長期使用減毒脊髓灰質炎活病毒的另一風險是轉變 為疫苗衍生的脊髓灰質炎病毒（VDPV) [1]。在西方國家，滅活的Salk polio疫苗（IPV)是 當前消除VAPP風險和傳播VDPV風險的優選方法。IPV被認為是最適合用于繼續進行全球 根除計劃[1-3]。
[0018] 為了實現全球根除脊髓灰質炎，（改良的）IPV必須是有效的、低廉的、可安全生產 的和易于給藥的[4]。當前IPV在發展中國家的可行性受到限制，因為IPV比OPV更貴，而 且只能通過注射給藥[1，3, 5]。為了限制IPV的費用，WHO和RIVM正在開發用于技術轉移 到發展中國家的非商用IPV。因為在生產過程中野生型Salk脊髓灰質炎病毒的抑制可能會 有問題，特別是在發展中國家，所述新疫苗會基于OPV菌株，Sabin (sIPV)，也可預見其生產 成本會不那么昂貴。為了進一步降低成本，RIVM正在開發SlPV制劑，所述SlPV制劑通過 使用佐劑和/或其它免疫途徑而表現出劑量節省[6]。
[0019] 因為替代的遞送方法和改良的疫苗制劑具有使疫苗遞送更容易和更安全的可能 性[7, 8]，目前正在研究幾種替代的疫苗遞送方法。
[0020] 看來，各種滅活的脊髓灰質炎血清型的熱穩定性存在差異，其中1型是最脆弱的。 在沒有任何防腐劑存在的情況下，1型在4°c下貯存兩年后會慢慢變質，而2型和3型可保 持多年有效。D-抗原含量在24°C下20天后會明顯減少，而且在暴露于32°C下相同時間后 不可被檢測到。相反，在這些溫度中的任一溫度下沒有觀察到2型D-抗原性的明顯變化。 3型在24°C下20天后仍保持穩定，但D-抗原含量在32 °C下會明顯降低[9]。
[0021] 基于對DT-脊髓灰質炎疫苗的觀察，當將IPV的所有三種血清型納入到聯合疫苗 中并于4°C下貯存1年到4年以上的時間時，IPV的所有三種血清型都顯示出令人滿意的 效能維持，所述DT-脊髓灰質炎疫苗是使用2-苯氧基-乙醇保存且被吸附到氫氧化鋁上 [9, 10]。更長的保存時間導致抗原性減弱，尤其是對于1型[9]。作為獨立的疫苗，IPV可 在4°C下穩定4年，25°C下穩定1個月[10]。在37°C下，1-2天后1型的效能顯著降低、在 兩周后2型和3型的效能明顯降低[11，12]。而且，冷凍對IPV效能有負面影響，這與D-抗 原結構的喪失有關[12]。
[0022] 在脊髓灰質炎根除后，要求儲備脊髓灰質炎疫苗，以便為新脊髓灰質炎爆發的潛 在風險而預先做好準備，所述爆發是由循環VDPV (即使在OPV停止后）[13-15]或者生物恐 怖主義襲擊引起。為了實現最佳的疫苗儲備，需要考慮各種問題。貯存期是一個重要的細 節，因為延遲到期時間會減少儲備費用[16]。為了保證疫苗的效能能夠持續多年，需要延長 疫苗（如IPV)的貯存期。因此，需要能夠延長生物藥物的貯存期的改良制劑和生產這類制 劑（優選以干燥形式）的改良方法。


【發明內容】

[0023] 第一方面，本發明涉及生產生物藥物試劑的干燥制劑的方法，其中所述方法包括 干燥包括生物藥物試劑、氨基酸、多元醇、金屬鹽和水的溶液。
[0024] 優選地，在本發明的方法中，該溶液基本上由以下構成：lpg_10g/ml的所述生物 藥物試劑、0.01-20% (w/v)的所述氨基酸、0.5-20% (w/v)的所述多元醇、0.005-10% (w/ v)的所述金屬鹽和水。更優選地，所述氨基酸是谷氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、甘氨酸 或它們的混合物；所述多元醇是山梨糖醇、甘露醇、甘露糖、麥芽糖醇或它們的混合物；所 述金屬鹽是Mg++鹽、Ca++鹽或Li +鹽或者它們的混合物，其中優選Cl-鹽或者S0,鹽或者它 們的混合物。
[0025] 在本發明的方法中，優選地谷氨酸是以谷氨酸單鈉鹽的形式溶解在溶液中。
[0026] 在本發明方法的優選實施方案中，所述溶液基本上以下構成：lpg_10g/ml的所述 生物藥物試劑、5-20% (w/v)的山梨糖醇、5-20% (w/v)的谷氨酸單鈉鹽、2-10% (w/v)的 鎂鹽（優選MgCl2和/或MgSO4)，以及任選的5-20% (w/v)的甘露醇。
[0027] 在本發明的方法中，該溶液優選地包括可藥用緩沖劑并且被緩沖在中性pH下。還 優選地，通過真空干燥法或通過低壓凍干法干燥該溶液。
[0028] 在本發明的方法中，所述生物藥物試劑優選地是一種包括蛋白質材料 (proteinaceous material)的藥物。更優選地，所述生物藥物試劑是病毒，優選腸道病毒屬 (Enterovirus)或肺病毒屬（Pneumovirus)。最優選地，所述生物藥物試劑包括血清型1、2 和3型的脊髓灰質炎病毒，優選滅活的血清型1、2和3型的脊髓灰質炎病毒，或者其中所述 生物藥物試劑是人RSV或牛RSV。
[0029] 本發明方法的優選實施方案中，所述干燥制劑在干燥后復原時，保留干燥前存在 于所述溶液中的生物藥物試劑的活性的至少50%。在本發明方法的另一實施方案中，其中 待干燥的溶液包括一種以上的不同生物藥物試劑，并且其中所述不同試劑的活性損失的差 異優選地少于50%，籍此活性損失最多的試劑的保留活性表示為活性損失最少的試劑的保 留活性的百分數，后者設為100%。
[0030] 在本發明方法的優選實施方案中，在45°C下貯存至少一周后復原時，所述干燥制 劑保留干燥前存在于溶液中的生物藥物試劑的活性的至少50%。在本發明方法的另一實施 方案，其中所述干燥制劑包括一種以上的不同生物藥物試劑，并且其中所述不同試劑的活 性損失的差異優選地少于50%，籍此活性損失最多的藥物的保留活性表示為活性損失最少 的藥物的保留活性的百分數，后者設為100%。
[0031] 在第二方面，本發明涉及可通過根據本發明的任何方法得到的生物藥物試劑的干 燥制劑。
[0032] 在第三方面，本發明涉及根據本發明的制劑用作藥物，優選地用于（在個體中）誘 導針對傳染病或腫瘤的免疫反應。

【具體實施方式】
[0033] 在第一方面，本發明涉及生產生物藥物試劑的干燥制劑的方法。本發明的方法旨 在實現至少兩種改進：1)使干燥所述制劑（并且優選隨后復原所述干燥制劑）時所述生物 藥物試劑的活性損失最少；和2)增加穩定性，即所述生物藥物試劑的干燥制劑的貯存期， 即使在貯存所述干燥制劑時所述生物藥物試劑的活性損失最少。該方法優選地包括干燥水 性溶液的步驟，該水性溶液包括生物藥物試劑，以及氨基酸、多元醇和金屬鹽中的一種或多 種。
[0034] 在本發明的方法中，待干燥的溶液包括以下、基本由以下組成或者由以下組成：a) 如下文所列舉的生物藥物試劑且具有如下文所列舉的濃度；b)如下文所列舉的氨基酸且 具有如下文所列舉的濃度；c)如下文所列舉的多元醇且具有如下文所列舉的濃度；d)如下 文所列舉的金屬鹽且具有如下文所列舉的濃度；e)水；任選的，f)如下文所列舉的緩沖劑、 具有如下文所列舉的濃度和處于如下文所列舉的PH下；和，任選的，g)如下文所列舉的其 它成分且具有如下文所列舉的濃度。
[0035] 生物藥物試劑
[0036] 在此應理解一生物藥物試劑Il指的是生物試劑，當其應用于哺乳動物時具有生 理學活性，特別是當應用于人類患者時，優選是以可藥用的形式。該生物試劑優選地是由細 胞生產或可從細胞得到的試劑，但是可從細胞獲得的試劑的合成復制物（copy)和可從細 胞獲得的化學修飾的試劑都被包括在該術語生物試劑中。該生物試劑可以是一種基于蛋白 質的試劑，即含有蛋白質材料（如蛋白質、多肽和肽）的試劑。所述生物試劑還可包括核酸 或由核酸組成，如DNA、RNA或核酸類似物。
[0037] 優選的生物藥物試劑是病毒或病毒體，優選感染哺乳動物的病毒，優選感染人的 病毒。所述病毒可以是有包膜病毒但優選無包膜病毒。在此可以理解，在此使用的術語一 病毒Il包括以其天然存在形式的野生型病毒（如天然的分離株），以及一人造的Il減毒、 突變和缺陷病毒。術語一病毒Il還包括重組病毒，即使用重組DNA技術構建的病毒，如缺 陷病毒（例如缺乏一個或多個病毒基因（的一部分）），和基因治療載體，其中部分的病毒 基因組被一個或多個目的基因取代。優選的病毒是微小RNA病毒（Picornavirus)，更優選 腸道病毒屬，例如脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒（Coxsackievirus)、埃可病毒（echovirus) 和鼻病毒（rhinovirus)。最優選的病毒是脊髓灰質炎病毒。脊髓灰質炎病毒可以為減毒 的脊髓灰質炎病毒，但優選滅活的脊髓灰質炎病毒（IPV)。脊髓灰質炎病毒還可以為滅活 的減毒脊髓灰質炎病毒。所述生物藥物試劑能包括血清型1、2和3型的脊髓灰質炎病毒中 的一種或多種，但優選地所述試劑包括所有三種血清型1、2和3型的脊髓灰質炎病毒。血 清型1型脊髓灰質炎病毒的合適病毒株包括但不限于Sabin 1、Mahoney、Brunhilde、CHAT 和Cox病毒株中的一種或多種。血清型2型脊髓灰質炎病毒的合適病毒株包括但不限于 Sabin 2、MEF-1和Lansing病毒株中的一種或多種。血清型3型脊髓灰質炎病毒的合適病 毒株包括但不限于Sabin 3、Saukett H和G、和Leon病毒株中的一種或多種。在一個優選 實施方案中，所述生物藥物試劑是三價的滅活脊髓灰質炎疫苗，例如包括滅活的脊髓灰質 炎病毒Mahoney病毒株（對于1型）、滅活脊髓灰質炎病毒MEF-I病毒株（對于2型）和 滅活脊髓灰質炎病毒Saukett病毒株（對于3型）的Salk-IPV，或包括滅活脊髓灰質炎病 毒Sabin-1、Sabin-2和Sabin-3病毒株的sIPV。滅活脊髓灰質炎病毒株以在疫苗中安全 使用的方法是本領域中公知的，且包括如使用福爾馬林或β_丙內酯進行的滅活（參見，例 如 Jonges et al.，2010, J. Clin. Microbiol. 48:928 - 940)。
[0038] 在另一實施方案中，生物藥物試劑是肺病毒的病毒或者病毒體。所述肺病毒優選 地為呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV)，更優選人RSV或牛RSV。人 RSV既可以是亞群A或亞群B病毒，優選臨床分離株，更優選尚未在體外被大量傳代的分離 株（優選傳代少于1〇、8、6或5次）。優選地，所述（人或牛）RSV病毒是包括這樣的病毒基 因組的病毒，即所述病毒基因組具有缺失的或失活的G附著蛋白基因，如在它的病毒基因 組中有突變，籍此所述病毒基因組不編碼功能性G附著蛋白，如記載在WO 2005/061698和 Widjojoatmodjo et al. (2010，Virol.J.，7:114)中的 RSVAG 和 RSVAG+G 病毒體。
[0039] 生物藥物試劑優選地存在于待干燥溶液中，其量為每毫升I X 10°到I X IO25之間 的活的并且/或者死的或滅活的顆粒。可以通過如空斑形成單位、細胞培養或組織培養 50%感染劑量（CCID 5tl或TCID5tl)以及用于確定試劑滴度的其他合適病毒學測定法來確定 活的顆粒的數量。死的或者滅活顆粒數目是可以使用定量抗原量的測定法（如蛋白質測 定法）或確定血細胞凝集單位或脊髓灰質炎D-抗原單位的測定法來確定。優選地，生物 藥物試劑以以下量存在于所述溶液中：每毫升至少IX IO1UX IO2UX IO3UX IO3UX 1〇4、 IX 105、IX 106、IX IO7UX IO8UX IO9或IX 101°個活的和/或死的或滅活的顆粒，并且 / 或者最高達每毫升 IX IO24UX IO23UX IO22UX IO21UX 102°、ix IO19UX IO18UX 1〇17、 I X 1016、I X IO15或I X IO14個活的和/或死的或滅活的顆粒。
[0040] 待干燥溶液中生物藥物試劑的量也可以表達為每ml溶液中生物藥物試劑的重 量。優選地，存在于溶液中的生物藥物試劑（以重量/ml表示）為lpg/ml到10g/ml之 間。更優選地，生物藥物試劑存在于所述溶液中的量為至少l〇_ n、1〇_1(|、1〇_9、1〇_8、1〇_7、1〇_ 6、 l(T5、l(T4g/ml和/或最高達ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ1或10°g/ml。可通過本領域中已知的方法確定溶液 中所述生物藥物試劑的重量，包括如蛋白質測定法。因此，所述生物藥物試劑的前述重量可 以也表示為一克蛋白質/ml Il以在合適的蛋白質測定法中確定（如the Bradford assay ; Zor and Selinger, 1996, Anal. Biochem. 236:302-308)〇
[0041] 在其中所述生物藥物試劑是脊髓灰質炎病毒的優選實施方案中，所述溶液中脊 髓灰質炎病毒的量優選地是至少0. 〇l、〇. 1、1. 0、或lODU/ml并且最高達10. 000、1. 000或 100DU/ml，其中lDU是用如Westdijketal.[6]所描述的QC-ELISA來定義和測定的。在 其中所述生物藥物試劑包括多價脊髓灰質炎病毒（疫苗）的實施方案中，應理解每個脊髓 灰質炎病毒血清型的存在的量是至少〇. 〇l、〇. 1、1. 〇或l〇DU/ml并且最高達10. 000、1. 000 或 100DU/ml。
[0042] 在其中所述生物藥物試劑是RSV的優選實施方案中，所述溶液中RSV的量優選 地為至少 IX 101、IX 1〇2、IX 1〇3、IX 1〇3、IX l〇4TCID5(l/ml 并且最高達 IX 1025、IX 102°、 I X 1015、I X 1012、I X 101。或 I X 109TCID5(l/ml，其中 RSV 的 TCID5tl 是按照 Widjo joatmodjo et al. (2010, Virol. J·，7:114)所述的來定義和確定。
[0043] 氨基酸
[0044] 待干燥溶液中的氨基酸可以是任何可藥用的D-或L-氨基酸。這樣的氨基酸包括 20種標準的一蛋白源Il氨基酸或一天然Il氨基酸（組氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮 氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、谷氨酰 胺、色氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸和絲氨酸），以及非天然氨基酸，如鳥氨酸、瓜氨 酸、硒代半胱氨酸、牛磺酸和吡咯賴氨酸。優選地，待干燥溶液中的氨基酸是谷氨酸、谷氨酰 胺、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、亮氨酸和甘氨酸中的一種或多種，更優選谷氨酸、精 氨酸和組氨酸中的一種或多種。因此，待干燥溶液可以包括氨基酸的混合物。待干燥溶液 中的一種或多種氨基酸可以是光學的D-或L-異構體或其混合物，但是優選地，所述氨基酸 是L-異構體。
[0045] 在優選的實施方案中，待干燥溶液中的氨基酸是L-谷氨酸、L-精氨酸和L-組氨 酸中的一種或多種。L-谷氨酸也可以是谷氨酸鈉、蛋白胨、非動物蛋白胨、植物蛋白胨的形 式。L-精氨酸也可以是聚-L-精氨酸、蛋白胨、非動物蛋白胨、植物蛋白胨的形式。L-組氨 酸也可以是組氨酸鈉形式。L-賴氨酸也可以是聚-L-賴氨酸形式。
[0046] 在特別優選的實施方案中，待干燥溶液中的氨基酸包括谷氨酸。谷氨酸可以是谷 氨酸鈉、谷氨酸鉀、谷氨酸銨、谷氨酸鈣、谷氨酸鎂和谷氨酸中的一種或多種。更優選地，所 述谷氨酸以谷氨酸單鈉鹽（MSG)形式溶于溶液中。
[0047] 所述一種或多種氨基酸優選地存在于待干燥溶液中，其濃度在范圍0.01-20% (w/v)之間，即重量百分比/溶液體積。因此，優選地，所述一種或多種氨基酸存在于待干 燥溶液中，其濃度為至少或超過 〇· 〇1、〇· 02、0· 05、0· 1、0· 2、0· 5、1· 0、2· 0、5· 0、8· 0、9· 0 或 9. 5 % (w/v)，并且/或者所述一種或多種氨基酸存在于待干燥溶液中，其濃度為不超過或 少于20. 0、17. 5、15. 0、12. 5、11. 0或10. 5% (w/v)。最優選地，所述一種或多種氨基酸存在 于待干燥溶液中，其濃度是約10% (w/v)。
[0048] 多元醇
[0049] 待干燥溶液中的多元醇優選地是糖或糖醇。優選的糖包括蔗糖、海藻糖、甘露糖和 葡聚糖。優選的糖醇包括山梨糖醇、甘露醇和麥芽糖醇（matltitol)。待干燥溶液優選地包 括山梨糖醇、甘露糖、甘露醇和麥芽糖醇中的至少一種或多種，更優選山梨糖醇、甘露糖和 甘露醇中的至少一種或多種，還更優選山梨糖醇和甘露醇中的至少一種或兩種。最優選地， 待干燥溶液至少包括山梨糖醇作為多元醇，任選地與甘露醇組合。
[0050] 在一個實施方案中，所述一種或多種多元醇優選地存在于待干燥溶液中，其濃度 在0. 1-20% (w/v)范圍內，即重量百分比/溶液體積。因此，優選地，所述一種或多種多元醇 存在于待干燥溶液中，其濃度為至少或超過0. l、〇. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、8. 0、9. 0或9. 5% (w/v)，并且/或者所述一種或多種多元醇存在于待干燥溶液中，其濃度為不超過或少于 20. 0、17. 5、15. 0、12. 5、11. 0或10. 5% (w/v)。最優選地，在此實施方案中，所述一種或多種 多元醇存在于待干燥溶液中，其濃度為約10% (w/v)。舉例來說，當使用山梨糖醇為多元醇 的時候，本實施方案中的所述濃度是合適的。
[0051] 在另一實施方案中，所述一種或多種多元醇優選地存在于待干燥溶液中，其濃度 處于0.1-40% (w/v)范圍中，即重量百分比/溶液體積。因此，優選地，所述一種或多種多 元醇存在于待干燥溶液中，其濃度為至少或超過〇. l、〇. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、10. 0、12. 5、 15. 0、18. 0、19. 0或19. 5% (w/v)，和/或所述一種或多種多元醇存在于待干燥溶液中，其 濃度為不超過或少于 50. 0、40. 0、35. 0、30. 0、25. 0、22. 5、21. 0 或 20. 5% (w/v)。最優選地， 在此實施方案中，所述一種或多種多元醇存在于待干燥溶液中，其濃度為約40% (w/v)。例 如，使用兩種不同的多元醇（如山梨糖醇和甘露醇）時，此實施方案中的所述濃度是合適 的。在此情況下，兩種多元醇之間的重量比為1:100到1:1，包括如1:50、1 :20、1:10、1:5和 1:2。
[0052] 金屬鹽
[0053] 溶于待干燥溶液中的金屬鹽可以是二價或一價金屬陽離子的任何可藥用的鹽。優 選的二價陽離子是Ca ++、Mg++和Zn++，其中Ca++和Mg++是更優選的，且其中Mg++是最優選的。 優選的單價陽離子是Li+、Na +和K+，其中Li+、Na+是更優選的，且其中Li+是最優選的。金 屬鹽中的抗衡陰離子（counter-anion)優選地不是氨基酸,優選地不是谷氨酸或天冬氨酸 鹽。更優選地，金屬鹽中的抗衡陰離子是無機陰離子。優選的（無機）抗衡陰離子是C1-、 SO,和CO32'其中Cl-和SO,是更優選的，且其中Cl-是最優選的。所述溶液能包括上述 金屬鹽中的一種或多種的混合物。
[0054] 所述一種或多種金屬鹽優選地存在于待干燥溶液中，其濃度處于0.005-10% (w/ v)范圍中，即重量百分比/溶液體積。因此，優選地，所述一種或多種金屬鹽存在于待干燥 液體中，其濃度為至少或超過 〇· 005、0· 01、0· 02、0· 05、0· 1、(λ 2、0· 5、L 0、2· 0、3· 0、4· 0 或 4. 5% (w/v)，和/或存在于待干燥溶液中的所述一種或多種金屬鹽的濃度為不多于或少于 10. 0、8. 0、7. 0、6. 0或5. 5% (w/v)。最優選地，存在于待干燥溶液中的所述一種或多種金屬 鹽的濃度為約5% (w/v)。
[0055] 應理解，假如待干燥溶液中的氨基酸是以氨基酸金屬鹽（如MSG)的形式溶解，那 么所述氨基酸金屬鹽不包括在所述一種或多種金屬鹽的重量百分比中而是包括在所述一 種或多種氨基酸的重量百分比中，因此金屬抗衡陽離子的重量被包括在所述氨基酸的重量 中。
[0056] 緩沖劑
[0057] 所述待干燥溶液優選地具有中性pH，如pH在范圍6. 0-8. 0,或6. 5-7. 5或約7. 0的 pH。所述待干燥溶液優選地包括緩沖劑以保持pH在指定的值。原則上，任何可藥用緩沖劑 都能用于所述待干燥溶液中，緩沖劑優選地在如指定的PH值范圍內具有有效的緩沖能力。 緩沖劑優選地以〇. 5-100mM的濃度存在，更優選l-50mM，最優選2-20mM，如約10mM。
[0058] 用于所述待干燥溶液的合適緩沖劑包括McIlvaine緩沖劑（參見實施例）、朽1檬酸 鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、HEPES緩沖劑和組氨酸緩沖劑。
[0059]水
[0060] 用于制備所述待干燥溶液的水優選地是超純水，并優選無熱原的水，如用于注射 的水。
[0061] 在本發明的待干燥溶液中的成分（如賦形劑）的濃度在本文中通常表示為重量百 分比/溶液體積（w/v)。應理解，溶質（如賦形劑）與溶劑（如水）的關系表示為克溶質/ 升總溶液。舉例來說，在IL溶液中的50克葡萄糖被看為5% w/v溶液。
[0062] 在優選的實施方案中，所述待干燥溶液基本上由以下組成：具有上文限定的量的 生物藥物試劑、5-20% (w/v)山梨糖醇、5-20% (w/v)谷氨酸單鈉鹽、2-10% (w/v)鎂鹽（優 選MgCl2和/或MgSO4)、任選的5-20% (w/v)甘露醇和任選的2-50mM可藥用緩沖劑，該緩 沖劑將所述溶液緩沖至所指定的中性pH。
[0063] 干燥
[0064] 在本發明的方法中，干燥包括所述生物藥物試劑的水性溶液。可以使用任何已知 的干燥方法。干燥的方法可以是，例如，噴霧干燥法，風干法、涂覆法、泡沫干燥法、脫水法 (desiccation)、真空干燥法、真空/冰凍干燥法或冰凍干燥法，其中所有的這些方法本身 都為本領域技術人員所知曉。在優選的實施方案中，所述干燥的方法是真空干燥法或冰凍 干燥法，其中冰凍干燥法或低壓凍干法（Iyophilization)更為優選。
[0065] 在冰凍干燥過程的實施方案中，優選地首先將所述待干燥溶液冷凍至 初始冷凍干燥溫度或擱板溫度，所述初始冷凍干燥溫度或擱板溫度等于或低 于-50°C、-40°C、-30°C、-20°C或-KTC。優選的初始擱板溫度是等于或低于-50°C或-40°C。 通過立即將所述溶液（含所述溶液的容器/小瓶）放置到具有如上所指定的初始擱板溫 度的擱板上對所述待干燥溶液進行快速冷凍。或者，可通過以下方式對所述待干燥溶液進 行緩慢冷凍：通過將所述溶液（含所述的容器/小瓶）放置到具有〇°C以上的溫度（如2、 4或6°C )的擱板上，然后通過降低溫度（優選以每分鐘約0. 5°C、I°C、2°C的速度），慢慢地 冷凍所述溶液到如上指定的初始冷凍干燥溫度。可將所述待干燥的溶液置于100微巴或更 低的壓力下。當到達設定的壓力，可提高擱板溫度到更高的溫度。例如，可以以如〇.〇5°C、 0. 1°C或0. 2°C /分鐘的速度提高擱板溫度到高于初始冷凍干燥溫度5°C、10°C或15°C的溫 度。當在室內測量不到壓力升高時，優選地結束首次干燥步驟。優選地在此時，以每分鐘 如0. 01°C、0. 02°C或0. 05°C的速度提高擱板溫度到如5°C、KTC、15°C、20°C或25°C，且任選 地，在一個或多個步驟中進行。在二次干燥階段，優選保持溫度在這個值直到監測不到壓力 升高。本文的實施例中描述了一個優選的冷凍干燥過程。
[0066] 在真空干燥過程的一個實施方案中，所述待干燥溶液的溫度優選地處于約 5°C -25°C范圍內（如室溫）或更優選地，溫度在約10°C -20°C范圍之間，如約15°C的溫度。 隨后降低壓力到如小于1、〇· 5、0· 2、0· 1、0· 05mbar的壓力。一旦處于降低的壓力下，正被干 燥的溶液的溫度可被降低至可以低于〇°C但（剛好）高于該溶液的低共熔溫度的溫度，以防 止溶液凍結。當室中測量不到壓力提升時，可以每分鐘如〇. 01°C、0. 02°C或0. 05°C的速度 提高溶液的溫度到51：、101：、151：、201：或251：，且任選地，在一個或多個步驟中進行。優 選地，將所述溫度保持在這個值直到監測不到壓力提升。本文的實施例中描述了一個優選 的真空干燥過程。
[0067] 在第二方面，本發明涉及根據如上所述的方法可得到或得到的生物藥物試劑的干 燥或被干燥的制劑。
[0068] 本發明的用于生產生物藥物試劑的干燥制劑的方法優選地目標在于使干燥該制 劑時所述生物藥物試劑的活性損失最小。優選地，本發明的方法以及制劑自身的目標也在 于使隨后貯存根據本發明方法可得到的干燥制劑時，所述生物藥物試劑的活性損失最小。 因此，本發明的方法優選地為生產生物藥物試劑的穩定制劑的方法，即具有長的或延長的 貯存期的制劑，優選地在冷藏條件（如2°C -KTC )下，在室溫（如18°C -25°C )下，或甚至 在可能出現在熱帶地區的高溫（如32°C -45°C )下。
[0069] 生物藥物試劑的活性損失或失活被理解為包括由化學途徑（如氧化、水解作用或 酶作用）和物理途徑（如變性、聚集、凝膠化）引起的活性損失。優選地，所述生物藥物試 劑的活性損失不超過可接受的水平。換句話說，在干燥和/或隨后的貯存后，保留的生物活 性或生存力的水平并且/或者原始功能或結構的水平至少足夠用于該生物藥物試劑的預 期商業治療應用和/或診斷應用。
[0070] 根據所述生物藥物試劑的種類，技術人員會知道使用哪種測定法來評估所述生物 藥物試劑的活性。所述生物藥物試劑的活性可表示為其生存力（如在有活力的活病毒的情 況下），或者活性可表示為可用技術人員已知的合適測定法中確定的酶活性或生物活性。在 其他情況下，所述活性還涉及該試劑的物理和化學完整性，且可通過評估所述生物藥物試 劑的結構和/或功能來測定。抗原結構優選地是通過ELISA或Biacor分析進行評估。二 級和三級結構優選地是由UV-光譜法、熒光光譜法，傅里葉變換紅外（FTIR)光譜法和/或 圓二色性（CD)光譜法進行評估。免疫源性優選地是通過使用動物模型（如小鼠、大鼠、棉 鼠、雪貂或兔子）的體內分析進行評估。例如，大鼠是脊髓灰質炎病毒的優選模型，棉鼠是 RSV的優選模型。
[0071] 在本發明方法的優選實施方案中，對所述（待干燥）溶液的干燥會使干燥的制劑 在干燥后（優選馬上）再水化時，保留干燥前所述溶液中存在的生物活性的至少50、60、70、 75、80、85、90或95%。如果一種以上生物藥物試劑存在于所述制劑中時，不同試劑的活性 損失的差異優選地小于50、60、70、75、80、85、90或95 %，籍此活性損失最多的試劑的剩余 活性表示為活性損失最少的試劑的剩余活性的百分比，后者設為100%。
[0072] 在本發明的另一優選實施方案中，在45°C下貯存至少一周后的干燥的制劑在將所 述干燥制劑再水化時，保留了干燥前所述溶液中存在的生物活性的至少50、60、70、75、80、 85、90或95%。假如一種以上生物藥物試劑存在于所述制劑中時，不同藥物的活性損失的 差異優選地少于50、60、70、75、80、85、90或95 %，籍此活性損失最多的試劑的剩余活性表 示為活性損失最少的試劑的剩余活性的百分比，后者設定為100%。優選地，如上所述的 貯存后所保留的活性的百分數在37°C或45°C下貯存兩周、三周、四周、五周、六周、七周、八 周、九周、十周或更長時間后仍然能夠保持。
[0073] 在第三方面，本發明涉及根據上述本發明方法可得到或得到的生物藥物試劑的制 劑用作藥物。對于用作藥物，該制劑可以作為干燥的制劑使用或它可以通過例如使用如上 定義的水溶解干燥的制劑來復原。優選地，將該制劑復原到它的原始體積，即干燥前的體 積。優選地，該制劑是（在個體中）誘導針對傳染病或腫瘤的免疫反應的制劑。應理解，被 給予本發明制劑的個體或受試者可以是人但也可以是動物，如農場動物或寵物，包括如哺 乳動物、鳥、家畜、家禽、牛（cattle)、牛科動物（bovines)。更優選地，該制劑是用于針對傳 染病或腫瘤的疫苗接種的制劑。因此，優選地，該制劑是用于傳染病或腫瘤的預防或治療的 制劑。在另一實施方案中，本發明涉及根據如上所述的本發明方法可得到或得到的制劑用 于制備用于誘導免疫反應、用于疫苗接種和/或用于傳染病或腫瘤的預防和治療的藥物的 用途。還在另一實施方案中，本發明涉及通過將有效量的所述制劑給予需要其的受試者來 誘導針對傳染原或腫瘤的免疫反應的方法。優選地，誘導針對所述生物藥物試劑中的抗原 的免疫反應。所述抗原優選地是引起傳染病的病原體的抗原或腫瘤的抗原，或誘導針對該 病原體或腫瘤的免疫反應的抗原。所述病原體優選地為如上所述的病毒。通過鼻內、胃腸 夕卜、肌內、皮下的和/或經皮的途徑，在復原或不復原的情況下，給予本發明的制劑。
[0074] 在本文及其權利要求書中，動詞一包括Il和其詞形變化以其非限制的含義來使 用，表示包括跟在該詞后面的項目，但不排除未被具體提到的項目。另外，用不定冠詞一一 (a) Il或一一個（an) Il提及的元素不排除存在一種以上該元素的可能性，除非上下文清楚 地要求有且只有一個該元素。因此，不定冠詞一一（a) Il或一一個（an) Il通常表示一至少 一個 Il。
[0075] 本說明書中引用的所有專利和參考文獻都以引用的方式全文納入本文。
[0076] 以下提供的實施例只作為示例性的目的，而并未意在以任何方式限制本發明的范 圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0077] 胤！在血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率（實驗 A) 。檢測蔗糖（SUC)、海藻糖（TREH)、甘露醇（MAN)、葡聚糖（DEX)和氯化鈉（NaCl)的穩定 效果。
[0078] 圖2響應曲面圖(response surface plots)，代表含10%甘露醇和0%葡聚糖的 IPV-制劑的低壓凍干后即時的三種血清型的D-抗原回收百分數。
[0079] 在血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率（實驗 B) 。檢測了蔗糖（SUC)、海藻糖（TREH)、谷氨酸單鈉鹽（MSG)、羥乙基淀粉（HES)和氯化鈉 (NaCl)的穩定效果。
[0080] Mi在真空干燥（V)、慢速冷凍速度的低壓凍干（L)和快速冷凍速度的低壓凍干 (S)后即時的D-抗原回收率。研究了蔗糖與海藻糖的穩定效果（與不添加穩定劑的IPV疫 苗（陰性對照）相比）。
[0081] 在所示的血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率 (實驗C)。
[0082] M6在血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后的D-抗原回收率（實驗D)。除 了 D11-D16不包括5%蛋白胨，所有制劑包括5%山梨糖醇、125mM NaCl和5%蛋白胨，所有 制劑如文中進一步所示。
[0083] SI所示的凍干的血清型1、2和3型IPV-制劑的加速穩定性測驗（實驗D)，其由 在45°C下孵育一周后的D-抗原回收率確定。
[0084] _所示的血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率（實 驗E)。通過使用快冷凍速度（A圖）和慢冷凍速度（B圖）測試山梨糖醇（SOR)、蔗糖（SUC)、 甘露醇（MAN)、谷氨酸單鈉鹽（MSG)、蛋白胨（PEP)和MgCl2的穩定效果。
[0085] _在45°C下培育一周后，所示的凍干的血清型1、2和3型IPV-制劑的穩定性 (實驗E)，其使用快冷凍速度（A圖）和慢冷凍速度（B圖）檢測。只顯示在低壓凍干后最 有前景的制劑。
[0086] 凰迎在血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率（實驗 F，η = 3)。研究在有或沒有10 %甘露醇的情況下蛋白胨對包括10 %山梨糖醇、10 % MSG和 5% MgCl2的IPV-制劑的穩定效果。在低壓凍干過程的干燥階段前，快速冷凍所有制劑。
[0087] fill在45°C下孵育一周后，凍干的血清型1、2和3型IPV-制劑的穩定性（實驗 F，η = 3)。這個實驗研究了在加速穩定性期間，添加蛋白胨或單氨基酸是否能夠改善包括 10%山梨糖醇、10% MSG和5% MgCl2 (有或沒有10%甘露醇）的IPV-制劑。
[0088] ai2具有所示的不同緩沖劑組分的血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即 時的D-抗原回收率（實驗G)。在圖A、B、C和D中所示的四種制劑均包括10%山梨糖醇 和10% MSG，并使用IOmM McIIvaine緩沖劑、IOmM檸檬酸緩沖劑、IOmM組氨酸緩沖劑、IOmM HEPES緩沖劑和IOmM磷酸鹽緩沖劑進行測試。未對對照制劑進行透析。
[0089] _在低壓凍干并隨后在45°C下貯存一周后，具有所示的不同緩沖劑組分的凍 干的血清型1、2和3型IPV-制劑的穩定性（實驗G)。測試與IOmM McIlvaine緩沖劑、IOmM 檸檬酸緩沖劑、IOmM組氨酸緩沖劑、IOmM HEPES緩沖劑和IOmM磷酸鹽緩沖劑結合的四種制 齊U，所述四種制劑包括10%山梨糖醇、10% MSG和MgCl2，包含或不包含甘露醇，包含或不包 含蛋白胨。不透析對照制劑，且用含所示賦形劑的McIlvaine緩沖劑1:1稀釋該對照制劑。
[0090] 凰11真空干燥（V)、慢冷凍速度的低壓凍干（L)和快冷凍速度的低壓凍干（S)后 即時的D-抗原回收率。與不添加穩定劑的IPV疫苗（陰性對照）以及蔗糖或海藻糖配制 的IPV相比，不同制劑的穩定效果。
[0091] 圖15在所示血清型1、2和3型IPV-制劑的低壓凍干后即時的D-抗原回收率。
[0092] 圖16低壓凍干并隨后貯存在45°C下一周后，所示的血清型1、2和3型IPV-制劑 的穩定性，其通過D-抗原回收率確定。
[0093] 實施例
[0094] L材料和方法
[0095] L 1 材料
[0096] 從 RlVM-Vaccinology 的過程發展開發部（Bilthoven, The Netherlands)得到的 三價的滅活脊髓灰質炎疫苗（Salk-IPV)，所述疫苗包括滅活的Mahoney病毒株（對于I 型）、MEF (對于2型）和Saukett (對于3型）。Salk-IPV三價原液（10 X)被配制成十倍 濃縮的40-8-32DU/單人劑量（1ml)。使用Westdijk et al.所述的QC-ELISA確定了本研 究中使用的IPV05-126B原液的濃度為411-90-314DU/ml。
[0097] 賦形劑蔗糖、D-山梨糖醇、D-海藻糖二水合物、D-葡萄糖一水合物、甘露醇、 L-谷氨酸單鈉鹽一水合物（在此被稱為谷氨酸鹽、谷氨酸鈉、谷氨酸單鈉鹽或MSG)、肌 醇（myo-inositol)、D-棉子糖、輕乙基淀粉、甘氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、二水氯化隹丐、 麥芽糖醇、氯化鎂六水合物、氯化鋰和卵清蛋白全采購于Sigma(St. Louis, MO)。蛋白胨 (植物）、葡聚糖（6kDa，來自明串珠菌屬（Leuconostoc ssp))、L-組氨酸、L-丙氨酸、氯 化鋅、乳糖酸1丐單水合物來自Fluka(Buchs,瑞士）。乳糖醇（LilCly電-M )來自Purac Biochem (Gorinchem, The Netherlands)，L-精氨酸（EP,非動物來源）和 Tween80 來自默 克（達姆施塔特，德國），聚乙烯吡咯烷酮25(PVP，29kDa)來自Serva Feinbiochemica GmbH (海德爾堡，德國），Sol-U-Pro ( -種水解豬明膠）來自Dynagel Inc. (Calumet City，IL)和聚焦糖（Ficoll)來自法瑪西亞（烏普薩拉，瑞典）。作為緩沖劑成分，使用來 自Merck的磷酸二氫鈉二水化合物（NaH 2PO4)、氯化鈉（NaCl)、磷酸二氫鉀（KH2PO4) 和EDTA。 檸檬酸三鈉二水化合物、檸檬酸和HEPES來自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)和磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)來自Fluka (Buchs，瑞士）。所用的所有賦形劑都為試劑質量級或更高級別。
[0098] 為了制備IOmM McIlvaine緩沖劑，將IOmM檸檬酸以1:6的比例加到IOmM Na2HPO4 中，且pH值為7.0。對于IOmM檸檬酸緩沖劑，將成分檸檬酸三鈉二水合物（IOmM)和檸 檬酸（IOmM)混合在一起直到pH為7. 0。pH7. 0的IOmM磷酸鹽緩沖劑由IOmM KH2PO4和 IOmMNa2HPO4組成。IOmM HEPES緩沖劑和IOmM組氨酸緩沖劑是通過以下方式制備：稱量和 溶解所述緩沖劑成分，隨后用HCl和/或NaOH調整pH值在7. 0。
[0099] 1.2 方法
[0100] L 2. 1 誘析
[0101] 除非另外說明，使用IOkDa截留分子量、低結合的再生纖維素膜透析盒 (SlWe-A-Lyzer⑩，Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL)，將三價 IPV 原液用 IOmM McIlvaine緩沖劑（pH 7. 0)透析，以替換IPV原液（M199培養基）的緩沖劑成分。
[0102] 1. 2. 2待干燥溶液
[0103] 以指定最終濃度的兩倍濃度，將所有賦形劑在McIlvaine緩沖劑中溶解。經透析 的IPV與待測試制劑等量混合。隨后，用〇. 2ml的IPV-賦形劑混合物填充2ml玻璃注射小 瓶（Milller+Miiller, Holzminden, Germany)，并提供 13mm 的預干燥（90 °C 過夜）的橡皮塞 (V9250 型，來自 Helvoet Pharma, Aiken, Belgium)。
[0104] 1. 2. 3低壓凍干討稈和直宇干燥討稈
[0105] 對于低壓凍干，裝填的且半塞上的小瓶被裝到Leybold GT4冷凍干燥器或Zirbus pilot/laboratory冷凍干燥裝置升華器2-3-3里，擱板溫度（shelf temperature) 是-50°C，或擱板溫度4°C然后通過以1°C /分鐘的速度降低溫度冷凍到_50°C，上述兩種方 式分別被表示為快速冷凍和慢速冷凍。保持小瓶在-50°C持續2小時。對于首次干燥階段， 以0. 1°C /min提升擱板溫度到-45°C，然后以0. 02°C /min升到-40°C，隨后孵育42小時。 通過以0. 02°C /min進一步提高擱板溫度到KTC，隨后在KTC孵育8小時，來進行第二次干 燥階段。之后，以〇. 02°C /min提高擱板溫度到25°C。
[0106] 對于真空干燥，裝填的且半塞上的小瓶被裝到Zirbus冷凍干燥裝置升華器2-3-3 里，擱板溫度15°C，且保持在該溫度下持續10分鐘。以不同速度（lmbar/min、0. 3mbar/min、 0. lmbar/min)的15分鐘梯度降壓（ramping)步驟，降低室壓力到lmbar，且從25mbar的室 壓開始。降低溫度到_l〇°C，在0. 05mbar持續1小時，在0. 03mbar持續1小時，使得制劑不 被凍結（產品溫度高于制劑的低共烙溫度（eutectic temperature))。隨后，以0· 05? / min提高擱板溫度到30°C。在循環結束時，在真空中封閉所述小瓶，用alu-caps密封且保 持在4°C直到進行分析。真空干燥過程期間的擱板溫度和室壓的實例在表1中示出。
[0107] 表 1
[0108]

【權利要求】
1. 一種生產生物藥物試劑的干燥制劑的方法，其中所述方法包括干燥包括生物藥物試 齊U、氨基酸、多元醇、金屬鹽和水的溶液。
2. 根據權利要求1的方法，其中所述溶液基本上由lpg-l〇g/ml的所述生物藥物試劑、 0.01-20% (w/v)的所述氨基酸、0· 5-20% (w/v)的所述多元醇、0.005-10% (w/v)的所述 金屬鹽和水構成。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中： a) 所述氨基酸是谷氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、亮氨酸、甘氨酸或它們的 混合物； b) 所述多元醇是山梨糖醇、甘露醇、甘露糖、麥芽糖醇或它們的混合物； c) 所述金屬鹽是Mg++鹽、Ca++鹽或者Li+鹽或者它們的混合物，優選Cr鹽或者SO,鹽 或者它們的混合物。
4. 根據權利要求3的方法，其中谷氨酸以谷氨酸單鈉鹽的形式溶解在所述溶液中，并 且/或者其中精氨酸是聚-L-精氨酸的形式并且/或者其中賴氨酸是聚-L-賴氨酸的形式。
5. 根據權利要求4的方法，其中所述溶液基本上由以下構成：lpg-10g/ml的所述生物 藥物試劑、5-20% (w/v)的山梨糖醇、5-20% (w/v)的谷氨酸單鈉鹽、2-10% (w/v)的鎂鹽， 優選MgCl2和/或MgS04，以及任選的5-20% (w/v)的甘露醇。
6. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述溶液包括可藥用緩沖劑并且被緩沖在 中性pH下。
7. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述溶液是通過風干法、真空干燥法、噴霧 干燥法或低壓凍干法干燥。
8. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述生物藥物試劑是包括蛋白質材料 的試劑，優選地所述生物藥物試劑是病毒，如腸道病毒屬（Enterovirus)或肺病毒屬 (Pneumovirus)〇
9. 根據權利要求8的方法，其中所述生物藥物試劑包括血清型1、2和3型的脊髓灰質 炎病毒，優選滅活的血清型1、2和3型脊髓灰質炎病毒，或者其中所述生物藥物試劑是人 RSV或牛RSV，優選包括具有缺失或失活的G附著蛋白基因的病毒基因組的RSV。
10. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述干燥制劑在干燥后復原時保留干燥 前存在于所述溶液中的生物藥物試劑活性的至少50%。
11. 根據權利要求10的方法，其中所述待干燥的溶液包括一種以上的不同生物藥物試 齊U，并且其中所述不同試劑的活性損失的差異優選地少于50%，籍此活性損失最多的試劑 的保留活性表示為活性損失最少的試劑的保留活性的百分數，后者設為100%。
12. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中在45°C下貯存至少一周后復原時，所述 干燥制劑保留干燥前存在于溶液中的生物藥物試劑的活性的至少50%。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述干燥制劑包括一種以上的不同生物藥物試劑， 并且其中所述不同試劑的活性損失的差異優選地少于50%，籍此活性損失最多的試劑的保 留活性表示為活性損失最少的試劑的保留活性的百分數，后者設為100%。
14. 根據權利要求1-13中任一項的方法可得到的生物藥物試劑。
15. 根據權利要求14的制劑用于在個體中誘導針對傳染病或腫瘤的免疫反應。
【文檔編號】A61K9/19GK104271119SQ201380023800
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2012年3月5日
【發明者】H·克蘭, 簡-皮埃爾·阿莫瑞杰 申請人:由衛生福利和體育大臣代表的荷蘭王國