免疫調節劑及其用途
【專利摘要】公開了用于治療或預防關節損傷的免疫調節劑。特別是，公開了用于誘發聚集蛋白聚糖多肽抗原(包括其瓜氨酸化形式)特異性耐受原應答以治療或預防患有早期RA或初期RA的個體的關節損傷(包括關節損傷)的免疫調節劑。
【專利說明】免疫調節劑及其用途
[0001] 本申請要求2012年3月 23 日提交的題目為"Immunomodulatory Agents and Uses Therefor (免疫調節劑及其用途）"的澳大利亞臨時申請第2012901189號的優先權，其全部 內容通過引用并入本文。

【技術領域】
[0002] 本發明通常涉及可用于治療或預防關節損傷的免疫調節劑。特別是，本發明涉及 引發針對聚集蛋白聚糖多肽（包括瓜氨酸化形式）的抗原特異性耐受原應答的免疫調節劑 治療或預防患有早期RA或初期RA的對象中的關節損傷（包括關節損傷）的用途。

【背景技術】
[0003] 炎性關節炎是多種自身免疫病的主要臨床表現，包括類風濕性關節炎（RA)、銀肩 病關節炎（PsA)、系統性紅斑狼瘡（SLE)、斯耶格倫氏綜合征以及多發性肌炎。在體檢時，這 些患者中的大多數都患有關節畸形，但通常僅RA和PsA患者在顯像研宄時表現出骨侵蝕。
[0004] 慢性炎性骨疾病如RA的發病機理尚未完全闡明。這類疾病伴有由于破骨細胞 吸收增加所致的受影響的關節周圍的骨丟失，所述破骨細胞吸收增加主要由促炎細胞 因子的局部產生增加而介導（Teitelbaum, 2000. Science 289:1504-1508 ;Goldring 和 Gravallese, 2000. Arthritis Res. 2(1) :33-37)。這些細胞因子能夠直接作用于破骨細胞 譜系的細胞，或通過影響成骨細胞/基質細胞產生必須的破骨細胞分化因子即NF- κ B配 體的受體激活劑（RANKL)和/或其可溶性誘殺型受體即護骨蛋白（OPG)而間接發揮作用 (Hossbauer 等，2000. J. Bone Min. Res. 15 (1) : 2-12) 〇
[0005] RA是全身性炎性疾病，其影響約0. 5-1 %的北歐和北美的成年人群，以及世界上 其他地區的稍低比例的人群（Alamanos 和 Drosos, 2005. Autoimmun. Rev. 4:130-136)。其特 征是關節滑膜組織的慢性炎癥，其最終由于慢性疼痛和疲勞而導致日常功能喪失。其是一 種慢性炎性疾病。大多數患者還經歷受影響關節中的軟骨和骨的漸進性惡化，這最終可導 致永久性殘疾。RA的長期預后欠佳，約50%的患者在從診斷開始的10年內經歷明顯的功 能性殘疾。
[0006] 描述了 RA中的幾個自身抗原，包括在患病關節中瓜氨酸化的多種蛋白。瓜氨 酸化是在凋亡和炎癥過程中發生的精氨酸瓜氨酸化（deimination)的生理過程。該過 程導致含有精氨酸的蛋白得以修飾，這可在攜帶處于危險中的HLA等位基因的個體中產 生若干組新的自身抗原（Vossenaar ER 等，2004. Arthritis Res. Ther. 6:107-11)。定 位于DRf3-鏈第三高變區的氨基酸70-74的特異性HLA-DR基因變體與RA高度相關 (Gregersen PK 等，1987. Arthritis Rheum. 30:1205-1213)。該區編碼形成 HLA-DR抗原結 合溝中第四銷定囊（anchoring pocket) (P4)的保守氨基酸序列。這種"共同的易感性表 位"（SE)發現于多種RA相關的DR等位基因中，包括白種人中的DRB 1*0401、DRB 1*0404以 及DRB*0101 (Gregersen PK等，1987，同上）。編碼SE的HLA等位基因與ACPA-陽性RA 尤其相關（Klareskog L 等，2006. Arthritis Rheum. 54:38-46 ;van Gaalen FA 等，2004. Arthritis Rheum.50: 2113-21 ;Hida S 等，2004. J.Autoimmun.23:141-50 ;Hill JA 等，2003. J. Immunol. 171:538-41) 〇
[0007] SE是高度帶正電荷的，位于DRf3 -鏈的影響結合配體的P4氨基酸的特異性的區 中，從而在該位置優先結合含有帶負電荷的或非極性的氨基酸的肽。瓜氨酸化用不帶電荷 的羰基取代帶電荷的精氨酸氨基側鏈基團，并且增加人波形蛋白肽表位與SE +HLA DR分子 的結合親和性（Hill JA等，2003，同上；Snir 0等，2011. Arthritis Rheum.n/a-n/a)。
[0008] 約70% RA患者血清含有抗瓜氨酸化蛋白自身抗體（ACPA) (Meyer 0等，2006. Arthritis Res. Ther. 8:R40)。這種反應性反映了針對一組翻譯后修飾的瓜氨酸化自身抗 原的自身抗體的產生，包括纖維蛋白原、波形蛋白、II型膠原蛋白和烯醇化酶（Wegner N 等，2010. Immunol. Rev. 233:34-54)。在RA發作之前，ACPA發展高達15年，并且隨著疾病 發作的迫近，伴隨效價和肽反應性的提高（van de Stadt LA等，2011. Arthritis Rheum. n/a-n/a)。在RA的發炎的組織中已經顯示了瓜氨酸化蛋白，并且在許多小鼠炎性關節炎 模型中誘導了 ACPA(Masson_Bessiere C 等，2001. J. Immunol. 166:4177-84 ;Vossenaar ER 等，2003. Arthritis Rheum. 48:2489-500 ;Kuhn KA 等，2006. J. Clin. Invest. 116:961-73 ; Giant TT等，2011. Arthritis Rheum. 63:1312-1321)。盡管針對響應應激和炎癥，瓜氨酸 化普遍存在，但是ACPA對于RA是高度特異性的，并且與較為嚴重的關節損傷和射線照相后 果相關（Klareskog L 等，2006，同上；van Gaalen FA 等，2004，同上；Meyer 0 等，2006， 同上）。
[0009] 用瓜氨酸化纖維蛋白原而非天然纖維蛋白原免疫HLA-DRB1*0401轉基因小鼠誘 導了炎性關節炎，其特征在于B細胞和T細胞同時對瓜氨酸化HLA-DR-限制性纖維蛋白 原表位和天然HLA-DR-限制性纖維蛋白原表位的自身反應性，這并不存在于幼稚（naiVe) HLA-DRB1*0401轉基因小鼠中。瓜氨酸化纖維蛋白原而非天然纖維蛋白原誘導關節炎的能 力表明：一個或多個瓜氨酸化新自身表位在引發表位擴展過程中或者由于表位擴展而破壞 了 T細胞對相應天然表位的耐受性（Hill JA等，2008. J. Exp. Med. 205:967-979)。而且， 最近的研宄表明：阿巴西普（abatacept)的送遞可以恢復對瓜氨酸化抗原的耐受性（Yue D 等，2010. Arthritis Rheum. 62:2941-2952)。盡管有這些轉基因小鼠的研宄，但是由于自 身反應性效應記憶T細胞體外進行的弱增殖應答，難以在RA患者中證明瓜氨酸特異性自身 反應性T細胞。然而，幾篇最近的文章已經顯示了 RA患者T細胞響應瓜氨酸化波形蛋白和 聚集蛋白聚糖表位而進行的令人信服的細胞因子應答（Snir 0等，2011，同上；von Delwig A等，2010. Arthritis Rheum. 62:143-149)。在波形蛋白的情況下，表位的免疫原性取決于 肽序列中瓜氨酸修飾的位置（Snir 0等，2011，同上）。
[0010] 本發明人現在已經描繪了 SE+健康對照和RA患者對一組瓜氨酸化和非修飾（天 然）自身抗原的應答，并且表征了應答T細胞。發明人的目標是：⑴鑒別在ACPA +RA中特 別相關的瓜氨酸化表位；(2)確定在瓜氨酸化自身抗原T細胞應答中個體變異程度；以及 (3)鑒別有助于ACPA +RA發展的T細胞。
[0011] 發明概述
[0012] 本發明部分源于意料不到的發現，即，長期患病的RA患者更可能對多重瓜氨酸化 自身抗原進行進行T淋巴細胞應答，而患有最近發作的RA的患者（包括之前未治療的那些 患者）更可能不響應抗原或僅響應瓜氨酸化聚集蛋白聚糖。基于這些發現，提出了全部或 部分對應于聚集蛋白聚糖（包括瓜氨酸化聚集蛋白聚糖）的抗原可用于治療或預防包括患 有早期RA的對象（例如還不存在臨床癥狀如關節腫脹或疼痛時）或處于發展RA (例如初 期RA)風險的對象中的關節損傷的免疫治療策略。
[0013] 因此，一方面，本發明提供了治療或預防對象的關節損傷的方法。這些方法通常包 括、僅包括或基本包括（包括、由以下組成或由以下基本組成）在對象中誘發針對聚集蛋白 聚糖多肽（例如瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽，其在本文中也可交換地稱為"cit-聚集蛋白 聚糖"或"cit-agg"多肽）的抗原特異性耐受原應答，由此治療或預防關節損傷。在一些實 施方案中，對象患有早期RA或初期RA，并且在這種類型的說明性實例中，所述方法還包括， 適當地在誘發抗原特異性耐受原應答之前，鑒別對象患有早期RA或初期RA。在一些實施方 案中，對象對于共同的表位（SE)是陽性的，并且在這種類型的說明性實例中，所述方法還 包括在誘發抗原特異性耐受原應答之前鑒別對象對SE是陽性的。適宜的是，對象具有針對 聚集蛋白聚糖多肽（如cit-agg多肽）或其片段的免疫應答，或處于發展針對聚集蛋白聚 糖多肽（如cit-agg多肽）或其片段的免疫應答的風險，所述免疫應答包括效應免疫應答 (例如效應T淋巴細胞應答，諸如但不限于CD4+效應T淋巴細胞）。在非限制性實例中，免 疫應答包括產生（例如分泌）至少一種選自白介素-6 (IL-6)、干擾素 -γ (IFN-γ、腫瘤壞 死因子（TNF)以及白介素-10 (IL-10)的細胞因子。在一些實施方案中，免疫應答包括促炎 T淋巴細胞應答，其包括、僅包括或基本包括產生（例如分泌）至少一種選自IL-6、IFN-γ 以及TNF的細胞因子。在這種類型的說明性實例中，促炎T淋巴細胞應答包括、僅包括或基 本包括產生（例如分泌）IL-6。適宜的是，免疫應答至少部分由⑶4+⑶28_Τ淋巴細胞產生。 在一些實施方案中，免疫應答至少部分由CD4+CD28+T淋巴細胞產生。在具體實施方案中，免 疫應答至少部分由⑶4+⑶28飛淋巴細胞和⑶4+CD28+T淋巴細胞產生。
[0014] 抗原特異性耐受原應答可以利用任何合適的策略實現，其說明性實例包括：
[0015] (1)增加對象的耐受原抗原呈遞細胞的數量，所述細胞呈遞對應于聚集蛋白聚糖 多肽（在本文中也稱為"聚集蛋白聚糖特異性耐受原抗原呈遞細胞"或"agg-tolAPC"）的 一部分的肽（例如自身抗原），其中所述部分與針對聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-agg多 肽）的促炎或自身反應性T淋巴細胞應答相關；
[0016] (2)誘導對象中促炎或自身反應性T淋巴細胞（例如效應T淋巴細胞）的無反應 性或凋亡，所述細胞對聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-agg多肽）或其部分是反應性的；以及
[0017] (3)增加對象的調節性或抑制性T淋巴細胞的數量，所述細胞抑制或以其它方式 減少針對聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反應性T淋巴細胞應答。
[0018] 因此，在一些實施方案中，本發明的方法包括、僅包括或基本包括增加對象的 agg-tolAPC的數量，由此治療或預防關節損傷。在一些實施方案中，agg-tolAPC刺激抑制 或以另外方式減少針對聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的促炎或自身 反應性T淋巴細胞應答的調節性或抑制性T淋巴細胞的產生。適宜的是，調節性或抑制性 T淋巴細胞表達組成型調節性或抑制性T淋巴細胞的至少一（例如1、2、3、4、5等）個標記 (例如選自CD4、CD25、CD62L、GITR、CTLA4中的至少一個標記）和轉錄因子叉頭框（Forkhead box) P3 (FoxP3)。說明性的調節性或抑制性T淋巴細胞包括但不限于CD4+CD25+調節性T淋 巴細胞、Trl淋巴細胞、T h3淋巴細胞以及⑶8+調節性T淋巴細胞。在具體實施方案中，調 節性T淋巴細胞是⑶4+⑶25+。非限制性抗原呈遞細胞包括樹突細胞、巨噬細胞、朗格漢斯 細胞、B淋巴細胞以及人工抗原呈遞細胞。
[0019] 聚集蛋白聚糖特異性耐受原抗原呈遞細胞可以利用任何合適的策略產生。在一 些實施方案中，它們通過使抗原呈遞細胞（例如樹突細胞、巨噬細胞、朗格漢斯細胞、B細胞 等）與以下接觸而產生：（1)至少一種NF-κ B抑制劑，其量足以抑制所述抗原呈遞細胞的 NF- κ B途徑；和/或（2)至少一種mTOR抑制劑，其量足以抑制抗原呈遞細胞的mTOR ;和/ 或（3)至少一種Syk抑制劑，其量足以抑制抗原呈遞細胞的Syk途徑，以及使抗原呈遞細胞 與以下接觸而產生：選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多 肽）的抗原或可表達抗原的核酸分子的抗原性分子，其量足以使抗原呈遞細胞在其表面呈 遞抗原或其加工形式。在這種類型的說明性實例中，所述方法包括、僅包括或基本包括向對 象（例如患有關節損傷或處于發展關節損傷風險的對象，如患有早期RA或初期RA的對象） 共施用NF-κ B抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚 糖多肽）的抗原或可表達抗原的核酸分子的抗原性分子，其中以足以抑制對象的抗原呈遞 細胞中NF- κ B活性的量施用所述抑制劑，且其中以足以使NF- κ B活性受到抑制的抗原呈 遞細胞向對象的免疫系統呈遞抗原或其加工形式的量施用所述抗原性分子。在其他說明性 實例中，所述方法包括、僅包括或基本包括向對象（例如患有關節損傷或處于發展關節損 傷風險的對象，如患有早期RA或初期RA的對象）共施用mTOR抑制劑和選自全部或部分對 應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達抗原的核酸分子 的抗原性分子，其中以足以抑制對象的抗原呈遞細胞中的mTOR活性的量施用所述抑制劑， 且其中以足以使mTOR活性受到抑制的抗原呈遞細胞向所述對象的免疫系統呈遞抗原或其 加工形式的量施用所述抗原性分子。在其他說明性實例中，所述方法包括、僅包括或基本包 括向對象（例如患有關節損傷或處于發展關節損傷風險的對象，如患有早期RA或初期RA 的對象）共施用Syk抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋 白聚糖多肽）的抗原或可表達抗原的核酸分子的抗原性分子，其中以足以抑制所述對象的 抗原呈遞細胞中的Syk活性的量施用所述抑制劑，且其中以足以使NF- κ B活性受到抑制的 抗原呈遞細胞向所述對象的免疫系統呈遞抗原或其加工形式的量施用所述抗原性分子。適 宜的是，當所述抗原性分子是可表達抗原的核酸分子時，所述核酸分子通常采用包含核苷 酸序列的核酸構建體的形式，所述核苷酸序列編碼所述抗原并且可操作地連接于在抗原呈 遞細胞可操作的調節元件。在這些實施方案中，一種或多種抑制劑（例如至少一種NF-κ B 抑制劑和/或至少一種mTOR抑制劑和/或至少一種Syk抑制劑）和/或所述抗原性分子 通常采用適合引入（例如通過轉化、內在化、內吞作用、吞噬作用）抗原呈遞細胞或其前體 的形式，其包括抑制劑和/或抗原性分子的可溶性形式和顆粒形式。
[0020] 在一些實施方案中，使抗原呈遞細胞與NF- K B途徑的至少一種抑制劑接觸，所述 抑制劑的說明性實例列于下文的表2、3A、3B或4中。在具體實施方案中，NF- κ B抑制劑是 姜黃色素或姜黃色素衍生物。
[0021] 聚集蛋白聚糖抗原可以包括、僅包括或基本包括對應于推定的全長瓜氨酸化聚集 蛋白聚糖多肽（包括其未加工形式、部分加工形式和成熟形式）的氨基酸序列。可選地，聚 集蛋白聚糖抗原可以包括、僅包括或基本包括瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽的結構域，例如 但不限于Gl、G2和G3結構域。在一些實施方案中，所述抗原包括、僅包括或基本包括對應 于T細胞表位的氨基酸序列。在其他實施方案中，所述抗原包括、僅包括或基本包括多個 肽，其中單個肽包含對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如Cit-聚集蛋白聚糖多肽）的氨基酸序 列的不同部分。在這種類型的說明性實例中，所述肽是重疊肽。
[0022] 在相關的實施方案中，抑制劑（例如NF- κ B抑制劑、mTOR抑制劑和/或Syk抑制 劑）和抗原性分子以可溶性形式或顆粒的形式（例如抗原性分子和抑制劑都采用可溶性形 式，或抗原性分子或抑制劑之一采用可溶性形式，而另一個采用顆粒形式，或抗原性分子和 抑制劑都采用顆粒形式）共施用。在具體實施方案中，以顆粒的形式共施用抑制劑和抗原 性分子。例如，可以將抑制劑和抗原性分子包含于一個或多個顆粒（例如納米顆粒或微粒， 如脂質體和聚合物顆粒）中，適宜的是，所述顆粒能被抗原呈遞細胞攝取。在具體實施方案 中，將抑制劑和抗原性分子包含于同一顆粒中。抑制劑和抗原性分子可以通過注射、通過局 部應用或通過鼻或口腔途徑，包括緩釋給藥模式，在一段時間內被施用，適宜的是，其量有 效抑制或以其它方式減少針對聚集蛋白聚糖多肽的T淋巴細胞應答或改善RA的癥狀。在 具體實施方案中，皮下共施用抑制劑和抗原性分子。
[0023] 在其他實施方案中，通過在B淋巴細胞中表達編碼全部或部分對應于聚集蛋白聚 糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原的核酸分子，產生agg-tolAPC，其中核酸分 子的表達導致所述抗原或其加工形式在B淋巴細胞表面上的呈遞。令人期望的是，在這些 實例中，所述核酸分子還編碼免疫球蛋白（例如IgG)或直接或間接與所述抗原融合（例如 與所述抗原的C末端相鄰）的免疫球蛋白的片段（例如？1? &13、？&13'以及？(&13'）2免疫球 蛋白片段、免疫球蛋白重鏈等）。
[0024] 在一些實施方案中，所述方法包括、僅包括或基本包括，以足以抑制或以另外方式 減少針對聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的促炎或自身反應性T淋巴細 胞應答或抑制所述應答發展的量，向所述對象施用agg-tolAPC或其前體。在這種類型的說 明性實例中，agg-tolAPC或其前體通過以下方式產生：從對象或從組織相容性供體收獲抗 原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體并將其離體暴露于：(Al)至少一種NF-κ B抑制劑，其量足 以抑制抗原呈遞細胞的NF- κ B途徑；和/或（A2)至少一種mTOR抑制劑，其量足以抑制抗 原呈遞細胞的mTOR ;和/或（A3)至少一種Syk抑制劑，其量足以抑制抗原呈遞細胞的Syk 途徑，以及暴露于（B)選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖 多肽）的抗原或可表達抗原的核酸分子的抗原性分子，其量足以使抗原呈遞細胞或其前體 向所述對象的免疫系統呈遞所述抗原或其加工形式。
[0025] 在其他說明性實例中，agg-tolAPC或其前體通過以下方式產生：從所述對象或從 組織相容性供體收獲B淋巴細胞或B淋巴細胞前體，并向其中離體引入核酸分子，所述核酸 分子與可在B淋巴細胞中操作的調節元件可操作地連接，且編碼全部或部分對應于聚集蛋 白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原，其中所述核酸分子的表達導致所述抗 原或其加工形式呈遞于B淋巴細胞的表面。在具體實施方案中，核酸分子還編碼免疫球蛋 白或直接或間接與所述抗原融合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。適宜的是，當使用前體 時，在足以從所述前體分化抗原呈遞細胞的條件下培養所述前體一段時間。
[0026] 在其他實施方案中，所述方法包括、僅包括或基本包括向所述對象施用MHC-肽復 合體，所述復合體疾病基本上由全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白 聚糖多肽）的抗原和具有抗原結合位點的分離的（例如可溶性）MHC組分（組件）組成，其 中所述抗原結合所述抗原結合位點。
[0027] 仍然在其他實施方案中，所述方法包括、僅包括或基本包括向所述對象施用包含 免疫調節肽和免疫或T細胞結合配體（I/TCBL)的嵌合構建體，其中所述免疫調節肽包括、 僅包括或基本包括對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的一部分（例 如自身抗原）的氨基酸序列，適宜的是，所述部分與類風濕性關節炎（RA)相關，且結合促炎 或自身反應性T淋巴細胞上的抗原受體（例如T細胞受體），并且其中I/TCBL結合選自下 述的一類或亞類T細胞：輔助T細胞、抑制性T細胞以及細胞毒性T細胞，并且調節T細胞 活性。適宜的是，I/TCBL至少包含選自以下的分子的一部分:MHC I類分子、MHC II類分 子、輔助分子如β 2-微球蛋白、淋巴細胞功能相關分子-3(LFA-3)、免疫球蛋白分子重鏈Fc 區、Ia+分子、⑶2抗體、⑶3抗體、CD4抗體、⑶8抗體、凝集素抗體、淋巴因子。
[0028] 在其他實施方案中，所述包括、僅包括或基本包括向所述對象使用改變的肽配體 (APL)，所述改變的肽配體包括、僅包括或基本包括對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚 集蛋白聚糖多肽）的一部分（例如自身抗原）的氨基酸序列，所述部分適宜地與類風濕性 關節炎（RA)相關，并且結合促炎或自身反應性T淋巴細胞上的抗原受體（例如T細胞受 體），其中APL氨基酸序列與所述所述部分的氨基酸序列的區別在于至少一個氨基酸取代、 缺失或增加，其通過抗原受體干擾正常的信號傳導，并且具有至少一種選自以下的活性： (i)對抗T淋巴細胞對聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的應答，（ii)引 起聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性T淋巴細胞的無反應性，（iii)引起 聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性T淋巴細胞的凋亡，（iv)刺激或誘導聚 集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性T h2免疫應答，（V)抑制聚集蛋白聚糖-或 瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性ThI免疫應答的發展，包括抑制促炎細胞因子的產生，（vi) 刺激聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性調節性淋巴細胞（例如T調節性淋 巴細胞（Treg))的激活，或（vii)防止或抑制炎性刺激物激活聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化 聚集蛋白聚糖-特異性抗原呈遞細胞。
[0029] 在相關方面，本發明延及劑（agent)在治療或預防關節疾病（例如早期RA或初 期RA)中的用途或在制造用于治療或預防關節疾病（例如早期RA或初期RA)的藥物中的 用途，其中所述劑選自：（1)如上文廣泛描述的，NF-κ B途徑抑制劑和選自全部或部分對應 于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達所述抗原的核酸分 子的抗原性分子；（2)如上文廣泛描述的，mTOR抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白 聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達所述抗原的核酸分子的抗原性 分子；（3)如上文廣泛描述的，Syk途徑抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽 (例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(4) 如上文廣泛描述的，編碼全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多 肽）的抗原，用于引入B淋巴細胞的核酸分子；（5)如上文廣泛描述的，MHC-肽復合體，其 基本上由全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原和 具有抗原結合位點的分離的（例如可溶性）MHC組分組成，其中所述抗原與抗原結合位點結 合；(6)如上文廣泛描述的，嵌合構建體；（7)如上文廣泛描述的，聚集蛋白聚糖-特異性耐 受原抗原呈遞細胞；或（8)如上文廣泛描述的，包括、僅包括或基本包括對應于聚集蛋白聚 糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的部分的氨基酸序列的APL。
[0030] 本發明的另一方面還涉及適合用于治療或預防對象的關節損傷的組合物。這些組 合物通常包括、僅包括或基本包括選自以下的劑：（1)如上文廣泛描述的，NF- K B途徑抑制 劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或 可表達所述抗原的核酸分子的抗原性分子；（2)如上文廣泛描述的，mTOR抑制劑和選自全 部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達所述 抗原的核酸分子的抗原性分子；（3)如上文廣泛描述的，Syk途徑抑制劑和選自全部或部分 對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原或可表達所述抗原的核 酸分子的抗原性分子；(4)如上文廣泛描述的，編碼全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽 (例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的抗原，用于引入B淋巴細胞的核酸分子；（5)如上文廣泛 描述的，MHC-肽復合體，其基本上由全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集 蛋白聚糖多肽）的抗原和具有抗原結合位點的分離的（例如可溶性）MHC組分組成，其中所 述抗原與抗原結合位點結合；（6)如上文廣泛描述的，嵌合構建體；（7)如上文廣泛描述的， 聚集蛋白聚糖-特異性耐受原抗原呈遞細胞；或（8)如上文廣泛描述的，包括、僅包括或基 本包括對應于聚集蛋白聚糖多肽（例如cit-聚集蛋白聚糖多肽）的部分的氨基酸序列的 APL0

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是顯示用瓜氨酸化肽和天然肽刺激的健康對照和RA患者的T細胞增殖應答 的圖示。如所示，將20例RA患者和6名健康對照的PBMC和SFMC與0、3或30 μ g/mL肽或 4Lfi/mL破傷風類毒素一起溫育（培育）5天。通過[3H]胸苷攝取評估T細胞增殖。每一個 點表示一個個體。比較多個平均值（Kruskal-Wallis檢驗），對于RA患者而言*#p〈0. 001， 而對于健康對照而言**P〈〇. 01，通過（曼-惠特尼檢驗），比較健康對照和RA患者PBMC對 破傷風類毒素的應答，**P〈〇. 01。比較RA患者對瓜氨酸化和天然聚集蛋白聚糖肽的應答 (曼-惠特尼檢驗），*Ρ〈〇· 05。
[0032] 圖2是顯示比較用瓜氨酸化和天然肽刺激的RA和健康對照單核細胞的未受刺激 的細胞因子分泌和凈IL-6分泌的圖示。A :將17例RA患者和6名健康對照的PBMC在培養 基中溫育5天，并通過CBA評估上清液中的細胞因子。比較IFN-Y的產量與其他細胞因子 的產量（Kruskal-Wallis檢驗和Dunns后驗校正），#p〈0. 01。B :如所示，將17例RA患者 和6名健康對照的PBMC與0、3或30 μ g/mL肽一起溫育，并通過CAB評估上清液中的IL-6。 凈細胞因子分泌計算為[用肽刺激的IL-6濃度]減去[無肽刺激的IL-6濃度]。每一個點 代表一個個體。每一個點代表一個個體。比較IL-6對瓜氨酸化和天然肽的應答（Wilcoxon 符號秩檢驗），*Ρ〈〇· 05, #ρ〈0· 01。
[0033] 圖3是顯示用瓜氨酸化和天然肽刺激的RA和健康對照PBMC的凈TNF、IFN- γ、 IL-10以及IL-17分泌的圖示。如所示，將17例RA患者和6名健康對照的PBMC與0、3或 30 μ g/mL肽一起溫育，并通過CBA評估上清液中的細胞因子。按圖2B，計算凈細胞因子分 泌。每一個點代表一個個體。比較IL-10對瓜氨酸化和天然聚集蛋白聚糖的應答（Wilcoxon 符號秩檢驗），*P〈〇. 05。
[0034] 圖4是顯示RA患者和健康對照所產生的細胞因子的呈遞的圖示。針對每一細胞 因子，計算具有陽性應答的RA患者或健康對照的百分比（>2SD，高于針對相應天然多肽的 平均應答），并且針對對瓜氨酸化纖維蛋白原、聚集蛋白聚糖以及II型膠原蛋白的應答，將 其繪制成圖。
[0035] 圖5是顯示RA患者和健康對照間瓜氨酸化肽反應性IL-6應答的多樣性的圖示。 A :如所示，將17例RA患者和6名健康對照的PBMC和SFMC與0、3或30 μ g/mL肽一起溫 育，并且將上清液中每一個體的IL-6應答繪制成圖。標示疾病病程和HLA類型。B :顯示對 于每一肽，患有近期發作或長期存在的疾病且具有陽性應答的RA患者的頻率（>2SD，高于 針對相應天然肽的平均應答）。
[0036] 圖6是顯示⑶4+T細胞亞群的細胞因子分泌的圖示。將HLA-DR SE+RA患者和健 康對照的PBMC與0或30 μ g/ml瓜氨酸化纖維蛋白原或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖一起溫育， 用針對 CD4、CD28、IFN- γ 和 IL-6 (A)或 CD4、CD45RO、IL-6 和 IFN- γ (E)的 mAb 染色，然 后通過流式細胞術進行分析。B :概述了門控策略（gating strategy)。C :焚光補償對照 (Fluorescence minus one, FMO)圖，其顯示門控于⑶4+T細胞上的細胞內細胞因子染色的 背景染色。D :門控的⑶€非-T細胞的IL-6染色。在（E)中，分別針對不與肽、瓜氨酸化 纖維蛋白原以及瓜氨酸化聚集蛋白聚糖一起溫育，IL-6+⑶4+⑶45R0+T細胞的比例分別為 2.2%、5.3%以及7.1%，11^-6 +〇04+0)451?0_1'細胞的比例分別為0.8%、2.1%以及4%。顯 示了兩例個體RA患者和1名健康對照。數據代表2名健康供體和5例RA患者。
[0037] 圖7顯示NF- κ B、mTOR或Syk抑制劑對RA患者的抗原呈遞細胞的抑制阻抑它們 響應瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽誘導T細胞細胞因子產生的能力。
[0038] 圖8顯示RA患者中針對瓜氨酸化聚集蛋白聚糖Gl表位的細胞因子應答。
[0039] 圖9顯示瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特異性T細胞存在于類風濕性關節炎患者的外 周血中，這通過四聚體染色確定。
[0040] 圖10顯示外周血中cit-聚集蛋白聚糖-特異性T細胞的數量和熒光強度。
[0041] 表 A
[0042] 序列簡述
[0043]

【權利要求】
1. 治療或預防對象的關節損傷的方法，所述方法包括以下步驟，或由以下步驟組成或 基本組成：在所述對象中引起針對聚集蛋白聚糖多肽的抗原特異性耐受原應答，由此治療 或預防所述關節損傷。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述聚集蛋白聚糖多肽是瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多 肽。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中所述對象患有早期RA或初期RA。
4. 如權利要求3所述的方法，還包在引起所述抗原特異性耐受原應答之前，鑒別所述 對象患有早期RA或初期RA。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述對象對共同的表位（SE)是陽性的。
6. 如權利要求5所述的方法，還包括在引起所述抗原特異性耐受原應答之前，鑒別所 述對象對SE是陽性的。
7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述對象具有針對所述聚集蛋白聚糖多 肽的免疫應答，或處于發展所述免疫應答的風險。
8. 如權利要求7所述的方法，其中所述免疫應答包括效應T淋巴細胞應答。
9. 如權利要求8所述的方法，其中所述免疫應答包括產生至少一種選自以下的細胞因 子：白介素-6 (IL-6)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子（TNF)以及白介素-10 (IL-IO)。
10. 如權利要求7所述的方法，其中所述免疫應答包括促炎T淋巴細胞應答，其包括、僅 包括或基本包括產生至少一種選自IL-6、IFN-y以及TNF的細胞因子。
11. 如權利要求10所述的方法，其中所述促炎T淋巴細胞應答包括、僅包括或基本包括 產生IL-6。
12. 如權利要求7所述的方法，其中所述免疫應答至少部分地由CD4 +淋巴細胞產生。
13. 如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述抗原特異性耐受原應答通過以下 方式實現： (1) 增加所述對象中耐受原抗原呈遞細胞（agg-tolAPC)的數量，所述細胞呈遞對應于 所述聚集蛋白聚糖多肽一部分的肽，其中所述部分與針對所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或 自身反應性T淋巴細胞應答有關； (2) 誘導所述對象的促炎或自身反應性T淋巴細胞的無反應性或凋亡，所述細胞對所 述聚集蛋白聚糖多肽是反應性的；以及 (3) 增加所述對象的調節性或抑制性T淋巴細胞的數量，所述細胞阻抑或以另外方式 減少針對所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反應性T淋巴細胞應答。
14. 如權利要求13所述的方法，包括、僅包括或基本包括增加所述對象的agg-tolAPC 的數量，由此治療或預防所述關節損傷。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述agg-tolAPC刺激阻抑或以另外方式減少針對 所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反應性T淋巴細胞應答的調節性或抑制性T淋巴細胞 的產生。
16. 如權利要求14或15所述的方法，其中通過使所述對象的抗原呈遞細胞與抗原性分 子接觸以及與以下接觸而產生所述agg-tolAPC : (I)NF-κ B抑制劑，其量足以抑制所述抗 原呈遞細胞中的NF- κ B活性，和/或（2)mT0R抑制劑，其量足以抑制所述抗原呈遞細胞中 的mTOR活性，和/或（3) Syk抑制劑，其量足以抑制所述抗原呈遞細胞中的Syk活性，所述抗 原性分子選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表達所述抗原的核酸分子， 其量足以使抗原呈遞細胞在其表面呈遞所述抗原或其加工形式。
17. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原包含對應于全長聚集蛋白聚糖多肽的氨 基酸序列。
18. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原包含對應于成熟聚集蛋白聚糖多肽的氨 基酸序列。
19. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原包含對應于選自Gl結構域、G2結構域或 G3結構域的聚集蛋白聚糖多肽的結構域的氨基酸序列。
20. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原包含對應于聚集蛋白聚糖多肽的T細胞 表位的氨基酸序列。
21. 如權利要求20所述的方法，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:5-35任意之一， 包括其瓜氨酸化形式。
22. 如權利要求20所述的方法，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:32-35中的任一 個。
23. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原是HLA DR限制性的，并且所述對象對HLA DR等位基因是陽性的。
24. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原采用一種或多種肽的形式，所述肽全部 或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽，包括其瓜氨酸化形式。
25. 如權利要求16所述的方法，其中所述抗原采用多個連續重疊肽的形式，所述重疊 肽的序列跨越聚集蛋白聚糖多肽，包括其瓜氨酸化形式的至少一部分。
26. 如權利要求16所述的方法，其中所述重疊肽包括選自SEQ ID NO:49-531的氨基酸 序列，包括其瓜氨酸化形式，或由選自SEQ ID N0:49-531的氨基酸序列，包括其瓜氨酸化形 式組成或基本組成。
27. 如權利要求16所述的方法，其中所述抑制劑是NF- κ B抑制劑（例如選自表2、3A、 3B或4所列抑制劑中的任一種的NF- κ B抑制劑）。
28. 如權利要求27所述的方法，其中所述NF- κ B抑制劑是姜黃色素或姜黃色素衍生 物。
29. 如權利要求16所述的方法，其中以可溶形式共施用所述抑制劑和所述抗原性分 子。
30. 如權利要求16所述的方法，其中以顆粒的形式共施用所述抑制劑和所述抗原性分 子。
31. 如權利要求30所述的方法，其中在同一顆粒中共施用所述抑制劑和所述抗原性分 子。
32. 如權利要求30所述的方法，其中所述顆粒是聚合物顆粒。
33. 如權利要求30所述的方法，其中所述顆粒是脂質體。
34. 如權利要求13所述的方法，其中通過在B淋巴細胞中表達編碼全部或部分對應于 聚集蛋白聚糖多肽的抗原的核酸分子產生所述agg-tolAPC，其中所述核酸分子的表達導致 所述抗原或其加工形式呈遞于所述B淋巴細胞的表面上。
35. 如權利要求34所述的方法，其中所述核酸分子還編碼直接或間接融合于所述抗原 的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
36. 如權利要求13所述的方法，包括向所述對象施用調節性或抑制性T淋巴細胞，所述 調節性或抑制性T淋巴細胞阻抑或以另外方式減少針對所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或 自身反應性T淋巴細胞應答。
37. 如權利要求1所述的方法，包括向所述對象施用MHC-肽復合體，所述復合體由全部 或部分對應于所述聚集蛋白聚糖多肽的抗原和具有抗原結合位點的分離的MHC組分基本 上組成，其中所述抗原與所述抗原結合位點結合。
38. 如權利要求1所述的方法，包括向所述對象施用包含免疫調節肽和免疫或T細胞結 合配體（I/TCBL)的嵌合構建體，其中所述免疫調節肽包括、僅包括或基本包括對應于聚集 蛋白聚糖多肽的一部分的氨基酸序列，并且，其結合促炎或自身反應性T淋巴細胞上的抗 原受體，并且其中所述I/TCBL結合一類或一亞類選自輔助T細胞、抑制性T細胞以及細胞 毒性T細胞的T細胞并調節T細胞活性。
39. 如權利要求38所述的方法，其中所述I/TCBL至少包含選自以下的分子的一 部分:MHC I類分子、MHC II類分子、輔助分子如β2-微球蛋白、淋巴細胞功能相關分 子-3 (LFA-3)、免疫球蛋白分子重鏈Fc區、Ia+分子、⑶2抗體、⑶3抗體、⑶4抗體、⑶8抗 體、凝集素抗體、淋巴因子。
40. 組合物，包含劑或劑的組合，或由劑或劑的組合組成或基本組成，其中所述劑引起 針對聚集蛋白聚糖多肽的抗原特異性耐受原應答。
41. 如權利要求40所述的組合物，其中所述劑或劑的組合選自：（I)NF- κ B途徑抑制 劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表達所述抗原的核酸分子的抗 原性分子；（2) mTOR抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表達所 述抗原的核酸分子的抗原性分子；（3) Syk途徑抑制劑和選自全部或部分對應于聚集蛋白 聚糖多肽的抗原或可表達所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(4)用于引入到B淋巴細胞 中的編碼抗原的核酸分子，所述抗原全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽；(5)MHC-肽復 合體，由全部或部分對應于聚集蛋白聚糖多肽的抗原和具有抗原結合位點的分離的MHC組 分基本上組成，其中所述抗原與所述抗原結合位點結合；(6)本文定義的嵌合構建體；（7) 聚集蛋白聚糖特異性耐受原抗原呈遞細胞；或（8)APL，其包括對應于聚集蛋白聚糖多肽的 一部分的氨基酸序列，或由對應于聚集蛋白聚糖多肽的一部分的氨基酸序列組成或基本組 成。
42. 權利要求40或41所述的引起針對聚集蛋白聚糖多肽的抗原特異性耐受原應答的 劑或劑的組合，用于治療或預防關節損傷。
43. 權利要求40或41所述的引起針對聚集蛋白聚糖多肽的抗原特異性耐受原應答的 劑或劑的組合在制備用于治療或預防關節損傷的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K39/00GK104519907SQ201380027092
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月25日 優先權日:2012年3月23日
【發明者】R·托馬斯 申請人:昆士蘭大學