具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌突變菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有對群體感應系統(tǒng)高效抑制作用的短小芽孢桿菌的突變菌株，其保藏編號為CCTCC?NO.2013534。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明以F3-1菌株為出發(fā)菌株，首次通過誘變育種的方法篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的對QS信號分子高效敏感的突變菌株菌株FF1-2，該發(fā)明用于制備高效防治水產(chǎn)細菌性病害的微生物制劑，為進一步從干擾細菌群體感應系統(tǒng)的角度研究防治水產(chǎn)細菌性病害的新方法奠定了基礎。
【專利說明】具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌突變菌株
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說，是一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑。
【【背景技術(shù)】】
[0002]細菌性疾病一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要原因之一。近年來，高密度集約化的生產(chǎn)模式在促進水產(chǎn)業(yè)提高產(chǎn)量的同時，也使得細菌疾病發(fā)生的機會增大、頻率增加、危害加大；此外，抗生素使用導致的耐藥性、藥物殘留以及對生態(tài)環(huán)境的破壞也成為社會關(guān)注的焦點。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式已經(jīng)成為水產(chǎn)病害防治研究重要方向之一。群體感應(Quorum sensing,簡稱QS)是指細菌能自發(fā)產(chǎn)生并釋放一些特定的信號分子，感知自身濃度的變化，進而調(diào)控相關(guān)基因的表達。目前，調(diào)節(jié)細菌群體感應的信號分子主要有三種，(a) N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)，是廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中的群體感應的信號分子；(b)自體誘導肽(Autoinducing peptides, AIP), AIP是一類短肽分子，是革蘭氏陽性細菌中常見的信號分子；(c)自體誘導物II類分子(Auto inducing II，AI2)，是以費氏弧菌(Vibrio fischeri)為代表的由IuxS酶催化的AI2系統(tǒng)的信號分子。研究表明，在革蘭氏 陰性細菌中，如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素產(chǎn)生、致病因子釋放等行為均受到AHLs類信號分子的調(diào)節(jié)。Dong (2000)等人在臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)中發(fā)現(xiàn)了 aiiA基因，能夠合成AHLs信號分子降解酶，阻斷QS信號分子在細菌間的傳遞；尹守亮等(2009)從膠州灣海域篩選出一株能夠降解AHLs信號分子的真菌，表明海洋微生物也可以作為QS抑制劑的潛在研究對象；Bhavanath等(2013)發(fā)現(xiàn)紫杉狀海門冬(Asparagopsistaxiformis)的粗提物能夠降解AHLs信號分子，并且對銅綠假單胞菌生物膜有一定的抑制作用。Defoirdt等(2011)首次從南美白對蝦和海水鱸魚等水產(chǎn)動物的腸道中分離出了能夠抑制哈氏弧菌(Vibrio harveyi) QS信號分子傳遞的芽孢桿菌，Natrah等(2011)分離出一株能夠抑制AHLs信號分子的微藻，該微藻能夠阻斷哈氏弧菌QS系統(tǒng)，降低其致病力。這些研究為探討從群體感應角度防控水產(chǎn)細菌性疾病提供了理論依據(jù)和科學數(shù)據(jù)的支撐。芽孢桿菌(Bcaillus sp)具有易生產(chǎn)、便運輸、耐儲藏等特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以起到凈化水質(zhì)、防治疾病和促進生長等作用，是常用的益生微生物菌株。因此，篩選能夠抑制AHLs信號分子的芽孢桿菌，并應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上，必將有著廣闊的前景。
[0003]紫色桿菌(Chromobacteria violaceum)是一種革蘭氏陰性菌,其色素的表達受群體感應AHLs信號分子嚴格調(diào)控，一旦信號分子被抑制，紫色便會褪去。因此，紫色桿菌常用作群體信號分子降解物質(zhì)篩選的指示菌株。但是關(guān)于一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑目前還未見報道。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種具有群體感應系統(tǒng)高效抑制作用的短小芽孢桿菌。
[0005]本發(fā)明的第二個目的是，提供一種具有群體感應系統(tǒng)高效抑制作用的短小芽孢桿菌的應用。
[0006]本發(fā)明的第三個目的是，提供一種具有群體感應系統(tǒng)高效抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑。
[0007]本發(fā)明的第四個目的是，提供一種具有群體感應系統(tǒng)高效抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌的保藏編號為CCTCCM2013534。
[0009]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌在防治水產(chǎn)細菌性病害中的應用。
[0010]所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌用于制備防治水產(chǎn)細菌性病害的微生物制劑。 [0011]所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌抑制細菌群體感應。
[0012]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑，所述的微生物制劑以所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌為活性成分。
[0013]為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑，所述的微生物制劑以權(quán)利要求1所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌的發(fā)酵液為活性成分。
[0014]本發(fā)明優(yōu)點在于:
[0015]本發(fā)明以紫色桿菌為篩選模型，利用“T”型劃線法和濾紙片法篩選出一株能夠抑制紫色桿菌紫色色素產(chǎn)生的菌株F3-1，具有抑制細菌群體感應的作用，該發(fā)明以F3-1菌株為出發(fā)菌株，首次通過誘變育種的方法篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的對QS信號分子高效敏感的突變菌株菌株FF1-2，用于制備高效防治水產(chǎn)細菌性病害的微生物制劑，為進一步從干擾細菌群體感應系統(tǒng)的角度研究防治水產(chǎn)細菌性病害的新方法奠定了基礎。
[0016]【微生物信息】
[0017]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式以及【具體實施方式】中所使用的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌FF1-2 (Bacillus pumilus FF1-2)已經(jīng)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC N0.2013534，保藏地址為:中國武漢市武漢大學，保藏日期為2013年11月03日。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0018]圖1.“T” 型劃線培養(yǎng)；注:1(X93) ；2(F3-1) ；3(X77) ;4 (F6-5)，5 (X3914)；6 (F6-4) ;7(F3-2)。
[0019]圖2.濾紙片擴散法；注:1(F3-1) ；2(X77) ；3(X3914) ;4(F6_4) ;5(F6_5)；6 (F3-2) ；7(x93)。
[0020]圖3.菌株F3-1蛋白粗提液對紫色色素產(chǎn)生的抑制；注:1 (蛋白酶K) ；2 (青霉素)；3 (蒸餾水)；4 (粗提蛋白)。[0021]圖4.菌株F3-1粗提物對紫色色素的抑制作用。
[0022]圖5.不同濃度的菌株F3-1粗提物對紫色色素作用的OD585值。
[0023]圖6.菌株F3-1的16S rDNA電泳圖。
[0024]圖7.F3-1 16Sr DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0025]圖8.菌株F3-1掃描電鏡圖片4000倍。
[0026]圖9.變異后不同菌株對紫色色素的影響。
[0027]圖10.菌株F3-1和FFl_2aiiA基因電泳圖。
[0028]圖11.菌株 F3-1 和菌株 FF1-2SDS-PAGE 結(jié)果:注:1:菌株 F3-l、2:菌株 FF1-2。【【具體實施方式】】
[0029]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0030]實施例
[0031]1.材料與 方法
[0032]1.1 材料
[0033]1.1.1菌種與活化
[0034]紫色桿菌(Chromobacteriym violaceum)購買自美國ATCC ;芽抱桿菌菌株X77、X93、X3914為本實驗室保存。
[0035]將凍干粉保藏的紫色桿菌轉(zhuǎn)接于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)24h ;再取ImL菌液轉(zhuǎn)移到5mLLB液體培養(yǎng)基中26°C培養(yǎng)24h;用接種環(huán)占取菌液在LB平板中劃線分離，挑取單個紫色菌落在LB斜面上劃線保存以備用。
[0036]1.1.2培養(yǎng)基與試劑
[0037]營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(購買自上海鼎國)，LB培養(yǎng)基(購買于上海生工)；細菌基因組抽提試劑盒(購買于上海生工)；PCR試劑:Master Mix2x，通用引物1492r、27f，(上海美吉生物技術(shù)公司)，D2000marker (購買于北京天根),亞硝酸鈉(NaNO2)15
[0038]1.1.3主要儀器設備
[0039]超凈工作臺(SW-CJ-1F型，蘇州凈化設備有限公司)；高壓滅菌(YXQ-LS-18SI，上海博訊實業(yè)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z型，上海博訊實業(yè)有限公司)；離心機(TDL80-2B型，上海安亭科學儀器有限公司)；電泳儀(DYY-6C型，北京市六一儀器廠)，電泳槽(DYCP-32B，北京市六一儀器廠);凝膠成像儀(GEL DOC XR型，Bio-Rad)，分光光度計(722型，上海精密儀器儀表有限公司)。
[0040]1.2 方法
[0041]1.2.1芽孢桿菌分離純化
[0042]參照Olsson 等的方法(詳見:01ssonC, WesterdahlA, ConwayPL.1ntestinalcolonization potential of turbot(Scophthalmus maximus L.) and dab (Iimanda)associated bacteria with inhibition effects against Vibrio anguillarum[J].Appl.Environ.Micro, 1992, 58 (2):551-556.)。鯽魚首先用75%的酒精進行體表消毒；解剖，取出腸道，75%酒精棉球擦拭腸管外壁，無菌生理鹽水沖洗。稱重后按1: 10(w/v)的比例加入滅菌生理鹽水混合，用滅菌勻漿器充分研磨均勻，研磨的樣品設為10_\再用滅菌生理鹽水對KT1樣品進行梯度稀釋至10_6，各稀釋度樣品均置于漩渦混合儀上振蕩均勻并置于水浴鍋中，80°C水浴lOmin，分別取各稀釋度菌液0.1mL涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)24~48h。挑出單菌落，分離純化，經(jīng)革蘭氏染色挑選革蘭氏陽性菌。
[0043]1.2.2篩選群體感應抑制活性芽孢桿菌
[0044]1.2.2.1 “T” 型劃線法
[0045]參照Chu 等方法(詳見:Chu ff, Lu F, Zhu W and Kang C.1solation andcharacterization of new potential probiotic bacteria based on quorum-sensingsystem.J Appl Microbiol [J].2011,110(1):202-208.)用無菌棉簽挑取少量紫色桿菌(Chromobacteria violaceum)菌液在LB平板上連續(xù)涂抹,旋轉(zhuǎn)90度后繼續(xù)用無菌棉簽占取一定量的待測芽孢桿菌菌液在平板上涂抹，兩菌株劃線垂直成“T”型。若靠近芽孢桿菌附近的紫色桿菌的紫色褪去，則表明待測菌株具有抑制AHLs信號分子的作用。
[0046]1.2.2.2 濾紙片法
[0047]參照單文榮等方法(詳見:單文榮，李俊霞，劉花粉.濾紙片法篩選不同活性物對棉花黃萎病菌抑制效果研究.中國農(nóng)學通報，2010，26 (19):285-289.)將待測菌株置于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)24h后，測定菌液濃度為4.2X108cfu/mL，取15mL10 OOOr/min離心15min，并取上清液通過0.22 μ m濾膜，保留濾液；取0.1mL培養(yǎng)24h的紫色桿菌(Chromobacteria violaceum)菌液(菌液濃度為 3.1 X 108cfu/mL),涂布 LB 平板上；吸取IOuL待測菌株濾液滴到濾紙片上，吹 干后反扣在涂有紫色桿菌菌液的平板上，將培養(yǎng)皿于26°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，每個樣品做3組平行。如果濾紙片周圍出現(xiàn)不透明的白色渾濁圈，則表明篩選樣品中含有QS抑制物。
[0048]1.3芽孢桿菌菌株F3-1 (保藏編號CCTCC N0.2013240)的粗提物對紫色菌素產(chǎn)量的影響
[0049]1.3.1芽孢桿菌菌株F3-1的粗提物的制備
[0050]將分離純化好的芽孢桿菌分別接種到含有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的50mL螺口管中，28°C、120r/min振蕩培養(yǎng)6~10h。將菌體及上清發(fā)酵液超聲破碎，加入15mL乙酸乙酯萃取，充分振蕩后，靜置萃取過夜，8 000r/min離心，取上層有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C濃縮至干，干燥物用甲醇溶解至100g/L。
[0051]1.3.2紫色桿菌紫(Chromobacteria violaceum)紫色菌素的提取
[0052]將過夜培養(yǎng)的紫色桿菌用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋到0D600~0.05，分別分裝到5組試管中，每管2mL，每組3個平行，每組分別加入終濃度0、50、100、200、300mg/L的粗提物，30°C、120r/min振蕩培養(yǎng)24h。然后提取紫色菌素。
[0053]紫色菌素提取方法:吸取ImL上述培養(yǎng)好的菌液于1.5mL離心管中，12000r/min離心10min，使紫色菌素和菌體充分沉淀。棄上清液，加ImL 二甲基亞砜(DMSO)于1.5mL離心管中，渦旋，充分振蕩使紫色菌素溶解于DMSO中。12 OOOr/min再次離心10min，沉淀菌體及碎屑，測定上清585nm處的光吸收值。
[0054]1.4硫酸銨沉淀法分離蛋白
[0055]參考宋福平的方法(詳見:宋福平，劉郵洲.枯草芽孢桿菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物質(zhì)初探.農(nóng)藥學學報2007，9 (I):92-95.)，過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌菌液50mL，離心機40C，10 000r/min離心15min，取上清液，然后分別通過0.22 μ m濾膜，然后向其中加入固體硫酸銨至80%飽和度，用磁力攪拌器攪勻，靜置過夜(4°C )后，10 000r/min離心20min，棄上清液，收集沉淀，沉淀分別用5mL (PH值7.4)的PBS溶解后，置于分子量8000至10 000道爾頓的透析袋4°C過夜透析，產(chǎn)物即為分離蛋白的粗提產(chǎn)物。
[0056]1.5粗提蛋白QS抑制效果試驗
[0057]吸取10 μ L粗提蛋白溶液滴到濾紙片上，置于涂有紫色桿菌(Chromobacteriaviolaceum)菌液的平板上，將培養(yǎng)皿置于26°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，每個樣品做3組平行，并做蒸懼水、青霉素(0.lmg/L)蛋白酶K (20mg/mL)抑制試驗。如果濾紙片周圍將出現(xiàn)不透明的白色渾濁圈，則表明篩選樣品中含有AHLs信號分子抑制因子。
[0058]1.6菌種鑒定
[0059]1.6.1 16Sr DNA 鑒定
[0060]16Sr DNA擴增用通用引物，正向引物為27f，反向引物為1492r。引物的序列為:27f:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' (SEQ ID N0.1) ；1492r:5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ' (SEQ ID N0.2)。50 μ L 的 PCR 反應體系:MasterMix25 μ L，引物 27fl μ L，引物 1492rl μ L，模板 DNAl μ L, ddH2022 μ L。PCR 反應條件為:95°C預變性5min，95°C變性lmin，55°C復性lmin，72°C延伸1.5min,30個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0 PCR擴增產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用DNA Marker (D2000，購買自上海生工)作為參照。
[0061]1.6.2序列分析與系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建
[0062]所測序列在NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)的 BLAST 程序在線比對測序結(jié)果。根據(jù)比對的結(jié)果，從數(shù)據(jù)庫選取與所分析的細菌基因序列同源性較高的已知相關(guān)序列，利用軟件Clustalx和Mega4.0進行多重比較后通過最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0063]1.6.3電鏡樣品制備
[0064]挑取單菌落置于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中過夜24h，取ImL于1.5ml離心管中，8，000r/min離心lmin，使菌體貼壁，然后用超純水潤洗兩次后，4°C下置于2.5%的戊二醛中過夜固定后，用5%、25%、50%、80%、95%酒精脫水，每次間隔15至20min、干燥，噴金后用掃描電鏡觀察。
[0065]1.7誘變育種
[0066]1.7.1短小芽孢桿菌F3-1生長曲線的繪制
[0067]將篩選出的短小芽孢桿菌F3-1在營養(yǎng)瓊脂斜面上轉(zhuǎn)接兩次，用接種環(huán)接種于裝有5mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的試管中，28°C、160r/min培養(yǎng)24h后，以1%接種量接種至裝有IOOmL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。每隔2小時測定600nm波長處測定OD值，繪制芽孢桿菌生長曲線。
[0068]1.7.2誘變育種
[0069]紫外線(UV)誘變:取0.1mL培養(yǎng)24h對數(shù)期，密度為1.7 X 108CFU/mL的菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上。實驗前20min打開紫外燈使光波穩(wěn)定，把涂布菌液的平板置于紫外燈下30cm處分別照射5min、lOmin、15min、20min、25min,照射完畢后置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜24h。挑取單菌落，分離培養(yǎng)。
[0070]亞硝酸鈉(NaNO2)誘變:取IOml培養(yǎng)24h的短小芽孢桿菌F3_l菌液，按照濃度為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L亞硝酸鈉溶液分別加入lmL，28°C過夜培養(yǎng)24h后，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，28 0C，24h后，挑取單菌落，分離培養(yǎng)。[0071]1.7.3突變株的篩選
[0072]將上述誘變育種得到的菌株，在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)后獲得單菌落轉(zhuǎn)接到斜面上，在28°C條件下,培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接到IOmL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),然后將菌液置于離心機10,000r/min,然后透過0.22um針頭濾器,獲得不含菌體的粗提液,在半徑為5mm的濾紙片上吸取20uL的粗提液，置于涂布紫色桿菌菌液的LB平板上，根據(jù)褪色圈的大小來確定突變效果。
[0073]1.7.4蛋白產(chǎn)量測定
[0074]參考利用Bradford?3]法測定菌株蛋白產(chǎn)量
[0075](1)取12支1.5ml離心管，按照下表的比例分別加入個溶液。
[0076](2)取一定量的BSA蛋白質(zhì)標準液(5mg/ml)，用IxPBS稀釋為終濃度200ug/ml
[0077](3)將樣品用IxPBS適當稀釋
[0078](4)取若干只1.5ml離心管分別加入上表中0_7號管中各濃度的蛋白質(zhì)溶液和樣品稀釋液個IOOul。
[0079](5)再在各管中加入1mlBradford試劑,迅速混勻。 [0080](6) 5min后，以O號管為空白對照,在分光光度計上冊各管的A595值。
[0081](7)重復步驟4-6，分別甲酸各族編號的A595平均值
[0082](8)根據(jù)A595平均值為縱坐標，對應蛋白濃度為橫坐標，利用EXCEL繪制標準曲線
[0083]1.7.5芽孢桿菌F3-1突變菌株對紫色桿菌生長的影響
[0084]用新鮮LB將培養(yǎng)至對數(shù)期的紫色桿菌菌液稀釋至0D_ ^0.05,每組3個平行；每組試管中加入突變菌株粗提物至終濃度100mg/L，粗提物制備方法:將分離純化好的芽孢桿菌分別接種到含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，28°C、120r/min振蕩培養(yǎng)6~IOh0將菌體及上清發(fā)酵液超聲破碎，加入15mL乙酸乙酯萃取，充分振蕩后，靜置萃取過夜，8000r/min離心，取上層有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C濃縮至干，干燥物用甲醇溶解至100g/L0
[0085]每隔2h測定OD6tltl吸光值，檢測粗突變菌株菌提物對于紫色桿菌生長的影響。26°C、120r/min搖床培養(yǎng)；每隔2h分別測定各管OD6tltl吸光值，直至對數(shù)后期；以培養(yǎng)時間為橫坐標，600nm處的吸光值為縱坐標。
[0086]1.7.6芽孢桿菌F3-1突變菌株對紫色菌素的抑制作用
[0087]將過夜培養(yǎng)的紫色桿菌用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋到0D_ ^0.05,分別分裝到試管中，每管2mL，每組3個平行，每組分別加入終濃度100mg/L的粗提物，26 °C、120r/min振蕩培養(yǎng)16h。然后提取紫色菌素方法，提取方法:吸取ImL上述培養(yǎng)好的菌液于1.5mL離心管中，12,000r/min離心10min,使紫色菌素和菌體充分沉淀。棄上清液，加ImL 二甲基亞砜(DMSO)于1.5mL離心管中，渦旋，充分振蕩使紫色菌素溶解于DMSO中。12，000r/min再次離心10min，沉淀菌體及碎屑，測定上清585nm處的光吸收值。
[0088]1.8不同環(huán)境因子條件下突變菌株對紫色色素抑制能力作用
[0089]1.8.1不同培養(yǎng)時間條件下突變菌株對紫色色素抑制能力作用
[0090]菌株恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣，參照1.7.5方法測定對紫色色素的抑制作用。
[0091]1.8.2不同pH條件下突變菌株對紫色色素抑制能力的影響
[0092]菌株培養(yǎng)24h后制備粗提物，用0.lm/L的HCL或0.lm/L的NaOH調(diào)節(jié)粗提物的pH值分別為3、5、7、9、11，作用Ih后將pH回調(diào)至7，按1.7.5方法測定對紫色色素的抑制作用。
[0093]1.8.3不同鹽度條件下突變菌株對紫色色素抑制能力的作用
[0094]用氯化鈉調(diào)節(jié)鹽度，配制鹽度分別0%、0.5%、1%、2%、5%、10%的使用培養(yǎng)基，將F3-1和FF1-2別接種于上述培養(yǎng)基中，28°C恒溫振蕩培養(yǎng)一定時間，按照1.7.5方法測定鹽度變化對紫色色素抑制能力的影響
[0095]1.8.4不同溫度條件下突變菌株對紫色色素抑制能力的作用
[0096]按照1.7.5方法制備粗提物后，分別在20°C處理24h，30°C，處理24h，40°C處理12h，50°C處理lh，60°C處理30mins，后加入到紫色桿菌菌液中過夜培養(yǎng)24測定紫色菌素OD585 值。
[0097]1.8.5突變菌株穩(wěn)定性測定
[0098]將篩選出的效果最好的誘變菌株在固定培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)接25次，利用濾紙片法，每轉(zhuǎn)接5次測定其褪色能力，另外按照1.7.5中提到的方法檢測對紫色色素的抑制作用。
[0099]1.9aiiA基因片段檢測
[0100]根據(jù)NCBI公布的aiiA基因序列，利用Primer Premier5.0設計引物正向引物為aiiA f，反向引物為aiiA r。引物的序列為:
[0101 ] F(5-ATGGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTAT-3)andaiiAR(5-GTCGAA—TTCCTCAACAAGATACTCCTAATG-3)。50uL 的 PCR 反應體系=Master Mix25uL，引物 aiiA Flum/L，引物 aiiARlum/L，模板DNAlum/L，ddH2022uL。PCR 反應條件為:94°C預變性 lOmin，94°C變性 30S，52°C復性30s，72°C延伸1.0min, 30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用DNA Marker (DL2000，上海生工)作為參照。
[0102]突變菌株蛋白粗提液SDS-PAGE分析:參考趙永方等對突變菌株粗蛋白粗體液SDS-PAGE凝膠電泳，并于凝膠分析儀上成像分析。
[0103]2結(jié)果與分析
[0104]2.1篩選結(jié)果
[0105]從鯽魚腸道中分離出10株在80°C水浴中仍能存活的細菌，結(jié)果見表1。其中菌株F3-1、F3-2、F6-4、F6-5革蘭氏染色為陽性，其余六株細菌染色為陰性。
[0106]表1鯽魚腸道芽孢桿菌分離結(jié)果 [0107]
【權(quán)利要求】
1.一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，其特征在于，所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC N0.2013534或其直接傳代物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌在防治水產(chǎn)細菌性病害中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌用于制備防治水產(chǎn)細菌性病害的微生物制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌抑制細菌群體感應。
5.一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑，其特征在于，所述的微生物制劑以權(quán)利要求1所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌為活性成分。
6.一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌微生物制劑，其特征在于，所述的微生物制劑以權(quán)利要求1所述的具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌的發(fā)酵液為活性成分。
【文檔編號】A61P31/04GK103937698SQ201410030459
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】宋增福, 范斌, 陳彪, 張慶華 申請人:上海海洋大學