Rna干擾酶及其使用方法
【專利摘要】本發明涉及的是新型酶家族的發現，該家族在這里被命名為mRNA干擾酶家族，它們表現出核糖核酸內切酶活性。因此，本發明
【發明者】的新發現，提出了新的應用，其中mRNA干擾酶核酸和氨基酸序列以及其組合物可以被有利地使用。本發明還包括篩選方法以鑒定能夠調節mRNA干擾酶活性的化合物/因子以及使用這些化合物/因子的方法。還提供了包含mRNA干擾酶核酸和/或氨基酸序列、與mRNA干擾酶活性相容的緩沖液以及使用說明材料的試劑盒。
【專利說明】RNA干擾酶及其使用方法
[0001]本申請是申請日為2004年6月14日、申請號為200480023092.X、發明名稱為“RNA干擾酶及其使用方法”的發明專利申請的分案申請。
發明領域
[0002]本發明涉及的是分子生物學領域，特別是新型酶活性的發現。特別地，本發明涉及的是對這里命名為mRNA干擾酶(interferase)的一個新型蛋白質家族的鑒定。這里描述的家族的示例成員包括MazF和PemK，以及它們的同源物和直向同源物(ortholog)。更為特別的是本發明涉及的是對作為核糖核酸內切酶或者mRNA干擾酶的MazF和PemK多肽的生化性質表征。發明還包括了對相關蛋白的分析，這些蛋白的作用是抑制mRNA干擾酶的活性。特別地，這里描述了對MazE蛋白質功能及其對MazF活性影響的表征，以及對PemI蛋白質功能及其對PemK活性影響的表征。這里還提供了對于新型mRNA干擾酶例如MazF和PemK、以及MazF和PemK活性的調節劑例如MazE和PemI的使用方法，它們可以用于研究和治療性應用。
[0003]發明背景[0004]在大腸桿菌中，程序性細胞死亡是通過由兩個基因組成的“上癮組件”介導的，其中一個基因編碼穩定的毒性蛋白(毒素)，另一個基因編碼短壽的抗毒素(Engelberg-Kulkaand Glaser, Annu RevMicrobiol53, 43-70 (1999))。毒素和抗毒素由一個操縱子共同表達，相互作用形成一個穩定的復合物，它們的表達由毒素-抗毒素復合物或者抗毒素自身自動調節。例如當逆境條件抑制了它們的共表達時，抗毒素被蛋白酶降解，使毒素作用于其靶標。這種細菌細胞程序性死亡的遺傳系統已經在許多大腸桿菌染色體外元件中有所報導，即所謂的分離后殺死效應(Tsuchimoto et al., J Bacteriol 170，1461-6 (1988) ; Robertsand Helinski, J Bacterioll74, 8119-32 (1992))。當細菌丟失了質粒或者其他染色體外元件時，細胞被選擇性地殺死，因為不穩定的抗毒素相對于其相關的穩定毒素降解得更快。因此細胞嗜好短壽的抗毒素，因為它們的從頭合成對于細胞的存活是必需的。
[0005]在大腸桿菌染色體上已知的上癮組件(addiction module)中(Gotfredsenand Gerdes,Mol Microbiol29, 1065-76 (1998) ;mittenhuber, J Mol MicrobiolBiotechnoll, 295-302(1999))，大腸桿菌MazEF系統是第一個已知的原核染色體上癮組件(Aizenman et al., Proc Natl AcadSci USA93, 6059-63 (1996))。mazEF組件由兩個重疊的基因mazE和mazF組成，它們位于relA基因的下游。MazF是一個穩定的毒素，而MazE是一個不穩定的抗毒素，很容易在體內被ATP依賴的ClpPA絲氨酸蛋白酶降解(Aizenman etal.,Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-63 (1996))。mazEF 的表達被鳥嘌呤核苷 3’，5’- 二焦磷酸(PPGpp)負調控，ppGpp是在嚴重的氨基酸饑餓條件下由RelA合成的(Aizenman etal.,Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-63 (1996))。而且，mazEF 介導的細胞死亡可以被一些抗生素包括利福霉素、氯霉素和壯觀霉素(Sat et al., J Bacterioll83, 2041-5(2001))所引發。使用大腸桿菌細胞進行的體內實驗結果提示MazF抑制了蛋白質的合成和 DNA 的復制(Pedersen et al.,Mol Microbiol45, 501-10 (2002))。最近報導了無胸腺嘧唳的死亡是通過mazEF組件介導的(B.Sat, M.Reches, H.Engelberg-Kulka, JBacterioll85, 1803-7(2003))。
[0006]在大腸桿菌中，已知染色體外的一些元件含有上癮組件，并且通過所謂的分離后殺死效應導致細菌的程序性細胞死亡。研究最透徹的染色體外上癮組件包括噬菌體 Pl 上的 phd-doc 系統(Lehnherr et al.(1993) J Mol Biol233, 414-428;Gazitand Sauer.(1999)J Biol Chem274, 168 13-168 18;Magnuson et al.(1996)J Biol Chem271, 18705-18710;Lehnherr and Yarmo I insky.(1995)Proc NatlAcad Sci USA92, 32743277)，F 因子上的 ccdA-ccdB 系統(Tam and Kline.(1989) JBacterioll71,2353-2360;Bahassi et al.(1999)J Biol Chem274, 10936-10944;Afifet al.(2001)Mol MicrobioI 4 I，73-82;Dao-Thi et al.(2002)J BiolChem277, 3733-3742)，質粒 Rl 上的 kis-kid 系統(Ruiz-Echevarria et al.(1991)MolMicrobiol5, 2685-2693;Hargreaves et al.(2002)Structure (Camb) 10, 1425-1433;Ruiz-Echevarria et al.(1995)J Mol Biol247,568-577;Santos-Sierra et al.(2003)Plasmid50, 120-130)以及質粒 RlOO 上的 peml-pemK 系統(Tsuchimoto et al.(1992) J Bacterioll74, 42054211;Tsuchimoto et al.(1988)J Bacterioll70,1461-1466;Tsuchimoto and Ohtsub0.(1993)Mol Gen Genet237, 81-88;Tsuchimoto and Ohtsub0.(1989)Mol Gen Genet215，463-468)。有趣的是，大腸桿菌染色體也含有一些上癮組件系統，例如 relBE 系統(Gotfredsen and Gerdes.(1998)Mol Microbiol29, 1065-1076;Christensen et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA98, 14328-14333;Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol48, 1389-1400;Pedersen et al.(2003)Cellll2, 131-140)，mazEF系統(Aizenman et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-6063;Marianovsky etal.(2001) J Biol Chem276, 5975-5984;Kamada et al.(2003)Mol Cel111, 875-884;Zhanget al.(2003) J Biol Chem278,32300-32306)以及 chpB 系統(Santos Sierra etal.(1998)FEMS Microb iol Lettl68, 51-58;Masuda et al.(1993)J Bacteriol175，6850-6856;Christensen et al.(2003)J Mol Biol332, 809-819)。
[0007]與上癮組件相關的毒素的細胞作用已經被深入研究。ccdA-ccdB系統中的毒素ccdB與DNA解旋酶相互作用阻止了 DNA的復制(Bahassi et al.(1999)同上；Kampraniset al.(1999) J Mol Biol293，733-744)，relBE系統中的毒素RelE以高度的密碼子特異性切割核糖體A位點的mRNA，但是不能降解自由的RNA(PederSen et al.(2003)，同上)。但是最近表明，A位點的mRNA切割可以在沒有RelE的情況下出現(Hayes and Sauer.(2003)Mol Celll2，903-911)。因此，A位點mRNA切割的確切機制還不知道。mazEF系統編碼的毒素MazF (ChpAK)和chpB系統編碼的毒素ChpBK被認為通過一個與RelE的作用相似的機制，通過核糖體依賴和密碼子特異的方式抑制翻譯(Christensen et al.(2003),同上)。但是本發明的
【發明者】最近證明MazF是一個序列特異的核糖核酸內切酶，它只對單鏈RNA起作用，優先切割ACA序列處的mRNA，切割方式不依賴于核糖體和密碼子，因此在功能上與RelE不同(Zhang et al.(2003)Mol Celll2, 913-923)。
[0008]peml-pemK系統和kis-kid系統分別參與了對兩個密切相關的incFII低拷貝質粒即質粒 RlOO (Tsuchimoto et al.(1992)同上；Tsuchimoto et al.(1988)同上)和 Rl (Ruiz-Echevarria et al.(1991)同上；Bravo et al.(1987)Mol GenGenet210, 101-110)的穩定維護。現在知道這兩個系統是相同的(Engelberg-Kulka andGlaser.(1999)，同上)。已經證明Kid(PemK)抑制了 ColEl質粒的復制，它在DNA合成的起始時起作用，但是不抑制P4DNA的體外復制(Ruiz-Echevarria et al.(1995)同上)。至今為止，還沒有證據顯示Kid(PemK)抑制染色體DNA的復制。毒素Kid(PemK)和解毒劑Kis(PemI)不僅僅在細菌中起作用，而且在許多真核生物中有效作用。Kid(PemK)抑制酵母、非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)和人細胞的增殖,其中Kis (PemI)解除了這種抑制(de IaCueva-Mendez et al.(2003)Embo J22, 246-251)。已經證明 Kid(PemK)引發了人細胞的凋亡(de la Cueva-Mendez et al.(2003)同上)。這些結果提示Kid (PemK)在原核和真核生物中有一個共同的靶標。
[0009]這里引用的文獻不應該被理解為承認它們是本發明的現有技術。
[0010]本發明的其他特點和優點從發明詳述、附圖和權利要求中會變得明確。
[0011]發明概述
[0012]在第一方面，本發明涉及的是一個新型酶家族的發現，該酶在這里也被稱為“RNA干擾酶”。正如這里所描述的，mRNA干擾酶家族中示例性的核糖核酸內切酶包括MazF和PemK及其同源物和直向同源物。因此本發明包括具有與MazF或PemK多肽同源的序列和/或同源的結構的核糖核酸內切酶。
[0013]值得注意的是，在本發明的發現以前，MazF的細胞靶標還沒有被發現。而且，本發明還涉及了以下發現 ，即PemK通過以序列特異的方式切割細胞mRNA阻斷蛋白質的合成。因此本發明
【發明者】的新發現提出了 mRNA干擾酶(例如MazF和/或PemK)的新型應用，其中mRNA干擾酶的核酸和氨基酸序列及其組合物可以被有利地使用。這種使用包括，但是不限于，多種不同的研究和治療性應用，如在這里以下描述的。還提供了包含mRNA干擾酶(例如MazF和/或PemK)核酸和/或氨基酸序列、與mRNA干擾酶活性相容的緩沖液以及用法說明材料。
[0014]本發明還提供了檢測mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包括:(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(a)步驟中的核酸序列；(c)將步驟(b)中表達的核酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；以及(d)測量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的陽性指示。
[0015]本發明還包括了鑒定能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(a)步驟中的核酸序列；(C)在能夠促進核糖核酸內切酶活性的條件下將步驟(b)中表達的核酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；(d)加入至少一種有可能調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的因子；以及(e)測量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測核糖核酸內切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽性指示，其中在至少一種能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的因子存在時被切割底物量的改變鑒定出了一種能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的因子。這些方法在體外或者在細胞內進行。[0016]這種使用本發明的方法確定的因子，能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性，可以引起底物切割增加或者減少。本發明還包括了使用本發明的方法鑒定出的因子。
[0017]另一方面，提出了調節mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(a)步驟中的核酸序列；(c)在能夠促進核糖核酸內切酶活性的條件下將步驟(b)中表達的核酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；(d)加入能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的因子；以及(e)測量所述底物的切害I]，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測核糖核酸內切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽性指示，其中在該因子存在時被切割底物量的改變提供了調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的手段。
[0018]示例性的編碼mRNA干擾酶的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO:1或者3，和編碼SEQ ID NO:2或者4的核酸序列，以及在這里以下描述的其同源物和直向同源物。其一個示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl，包含分別包含SEQ ID NO:69和74的核酸和氨基酸序列。
[0019]在另一個實施方案中，提供了檢測mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進核糖核酸內切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；以及(c)測量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活 性并且提供了檢測手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的陽性指示。
[0020]本發明還包括了鑒定能夠調節mRNA干擾酶或者其功能片段活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進核糖核酸內切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；(c)加入至少一種有可能調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的因子；以及(d)測量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測mRNA干擾酶或其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的手段，其中在所述至少一種因子存在時被切割底物量的改變確定了能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的因子。這些方法可以在例如體外或者在細胞內進行。
[0021]使用這些方法確定的因子，能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性，可以實現底物切割的增加或者減少。這種調節性因子是在本發明范疇內的。應當理解這種因子可以，例如通過作用于mRNA干擾酶(毒素)或者其抗毒素(例如各自PemI，MazE，或者二者中一個的功能性和/或結構性同源物或直向同源物的抗毒素)，或者通過改變自我調節反饋機制(毒素-抗毒素復合物借此下調毒素和抗毒素基因的表達)，調節mRNA干擾酶的核糖核酸內切酶(例如PemK，MazF或者功能性和/或結構性同源物或直向同源物)活性。能夠改變自我調節反饋機制(毒素-抗毒素復合物借此下調毒素和抗毒素基因的表達)的因子能夠改變這些基因的協調調控。在該實施方案的一方面，能夠降低毒素-抗毒素復合物形成的因子抑制了抗毒素的作用，導致毒素活性的增加，最終導致細胞死亡。另一方面，涉及了能夠阻斷抗毒素和毒素基因表達的因子，其中該因子導致毒素水平由于毒素的穩定性質，相對于抗毒素水平的增加。這種不平衡也會導致細胞毒性。
[0022]因此，這種因子可以有利地用于治療具有細菌感染的受試對象，特別是那些被對抗生素有抗性的細菌菌株感染的受試對象。這種因子屬于本發明的范疇內并且可以單獨使用或者聯合使用。
[0023]還提供了調節mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進核糖核酸內切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內切酶底物共同孵育；(c)加入能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的因子；以及(d)測量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測核糖核酸內切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽性指示，其中在該因子存在時被切割底物量的改變提供了調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的手段。這些方法可以在例如基于細胞的檢測中(在培養中或者在受試對象如非人類的動物或者人類患者中)或者在體外使用。
[0024]根據本發明，包含mRNA干擾酶的示例性氨基酸序列包括，但不限于，SEQ ID NO:2或者4以及這里在下面描述的其同源物和直向同源物。其示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl,它包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
[0025]本發明還包括在細胞中檢測mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包括:(a)提供包含表達載體的細胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個調控序列；(b)在促進至少一種細胞底物核糖核酸內切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細胞；以及(c)測量所述的至少一種細胞底物的切割，其中所述的至少一種細胞底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測細胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的手段。
[0026]一方面，提出了在細胞中調節mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含表達載體的細胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個調控序列；(b)在促進至少一種細胞底物核糖核酸內切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細胞；(c)加入能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內切酶活性的因子；以及(d)測量所述的至少一種細胞底物的切割，其中所述的至少一種細胞底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測細胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的手段，且其中在該因子存在的情況下至少一種被切割底物量的改變提供了調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的手段。
[0027] 還提出的是篩選方法，以鑒定在細胞中能夠調節mRNA干擾酶或者其功能片段活性的因子，其中所述的活性是核糖核酸內切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含表達載體的細胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個調控序列；(b)在促進至少一種細胞底物核糖核酸內切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細胞；(c)加入至少一種有可能調節mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子；以及(d)測量所述的至少一種細胞底物的切割，其中所述的至少一種細胞底物的切割顯示了核糖核酸內切酶活性并且提供了檢測細胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內切酶活性的手段，且其中在該因子存在的情況下至少一種被切割底物量的改變鑒定出了能夠調節mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的因子。
[0028]根據本發明，包含表達載體(表達載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸)的細胞包含的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO:1或3，以及這里描述的其同源物和直向同源物；以及編碼SEQ ID NO:2和4的核酸序列及這里描述的其同源物和直向同源物。示例性的其同源物和直向同源物是MazF-mtl，分別包含含有SEQ ID NO:69和74的核酸和氨基酸序列。
[0029]還提供的是組合物，組合物包含至少一種mRNA干擾酶或者其功能性片段、編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或使用本發明的方法確定的mRNA干擾酶調節性因子，以及藥物上可以接受的緩沖劑。
[0030]一方面，提供了用于治療具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治療上有效量的本發明組合物，以減輕所述疾病的癥狀。組合物包含至少一種能夠增加或者降低核糖核酸內切酶底物切割的因子，這取決于困擾患者的疾病，以緩解疾病的癥狀。
[0031]因此，本發明包括使用治療有效量的mRNA干擾酶或者其功能性片段、編碼mRNA干擾酶的核酸序列或者mRNA干擾酶調節性因子來制備藥物，用于治療具有疾病的患者以緩解所述疾病的癥狀。這種藥物還可以進一步包含藥物上可以接受的緩沖劑。
[0032]疾病例如細菌感染是可以通過向患者施用包含治療有效量的至少一種分子或者因子的組合物而被治療的，所述的分子或者因子能夠增加核糖核酸內切酶底物的切割，通過減少患者體內細菌的數目來緩解細菌感染的癥狀。在細菌感染包含至少一種抗生素抗性細菌菌株時使用這種方法 具有特別的優勢。
[0033]本發明的方法在過度增生性疾病的治療中也是有用的，其中將包含治療有效量的至少一種分子或者因子(能夠增加對核糖核酸內切酶底物的切割)的本發明組合物施用給患者，以通過減少患者中的過度增生性細胞，緩解過度增生性疾病的癥狀。可以使用本發明的組合物和方法治療的過度增生性疾病(其特征是細胞增殖的失調)，包括，但是不限于，不同組織的發育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過敏/哮喘、動脈粥樣硬化、血管成形手術后的再狹窄以及癌癥。
[0034]本發明還包括治療具有疾病的患者的方法,所述的方法包含向患者施用治療有效量的本發明組合物，其中至少一種所述組合物的因子實現了對核糖核酸內切酶底物的切割的降低，以緩解所述疾病的癥狀。
[0035]還包括在細胞中制備多肽的方法，所述的方法包括:(a)用編碼所述多肽的核酸序列轉染所述的細胞，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，使用另外的三聯體密碼子替換mRNA干擾酶識別序列，其中由所述的突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒有因為所述的突變而改變；(b)使用編碼mRNA干擾酶的核酸序列轉染所述的細胞，其中所述的mRNA干擾酶識別所述的mRNA干擾酶識別序列；以及(c)在所述的細胞中表達步驟(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的細胞中表達步驟(a)和(b)的核酸序列提供了在所述細胞中制備多肽的方法。
[0036]根據本發明，編碼多肽或者mRNA干擾酶的核酸序列可以分別被包括在第一和第
二表達載體中。而且，步驟(a)和(b)的轉染步驟可以分開或者同時(例如通過共轉染)進行。正如在這里以上所表明的，核酸序列中mRNA干擾酶識別序列突變為不同的三聯體序列或者密碼子不會改變由突變核酸序列編碼的多肽的氨基酸序列。因此，就被編碼多肽的氨基酸序列而言，突變是沉默突變。突變核酸序列的目的是顯著降低該核酸轉錄出的mRNA對于所討論的mRNA干擾酶的核糖核酸內切酶活性降解的敏感性。步驟(b)的核酸(例如編碼例如PemK多肽或者其功能性片段、或者MazF多肽或者其功能性片段、或者MazF或PemK的同源物或直向同源物的核酸序列)的表達降低或者抑制了由包含mRNA干擾酶識別序列的核酸序列編碼的細胞多肽的合成。因此，該方法產生了幾乎沒有細胞蛋白的所需多肽，所述細胞蛋白的RNA轉錄本包含被所表達的mRNA干擾酶識別的mRNA干擾酶識別序列。因此該方法提供了在細胞中制備“純化的”多肽的方法。對于一些應用，該方法還包含在步驟(c)之前或者當中，將細胞在包含至少一種放射性標記同位素的培養基中孵育。這些應用包括，但是不止限于，制備標記的多肽，用于使用核磁共振(NMR)技術進行接下來的分析。
[0037]在一個特別的實施方案中，在細胞中制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)以及包含SEQ ID NO:2的mRNA干擾酶MazF或者其功能性片段。在該實施方案中，編碼MazF或者其功能性片段的核酸的表達降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列編碼的細胞多肽的合成。
[0038]在另一個實施方案中，在細胞中制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列尿嘧啶-腺嘌呤-X (UAX)，其中X是胞嘧啶(C)，A，或U，以及包含SEQ ID NO:4的mRNA干擾酶PemK或者其功能性片段。在該實施方案中，編碼PemK或者其功能性片段的核酸的表達降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列編碼的細胞多肽的合成。
[0039]在另一個實施方案中，在細胞中制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列尿嘧啶-腺嘌呤-C(UAC),以及包含SEQ ID NO:74的mRNA干擾酶MazF-mtl或者其功能性片段。在該實施方案中，編碼MazF-mtl或者其功能性片段的核酸的表達降低或者抑制了由包含UAC序列的核酸序列編碼的細 胞多肽的合成。
[0040]在本發明的一個方面中，提出了制備多肽的方法，包含:(a)提供編碼所述多肽的核酸序列，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以用另外的三聯體密碼子替代mRNA干擾酶的識別序列，其中由所述突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒有由于所述的突變而被改變；(b)提供編碼mRNA干擾酶的核酸序列，其中所述的mRNA干擾酶識別所述的mRNA干擾酶識別序列；以及(c)表達步驟(a)和(b)的核酸序列，其中表達步驟(a)和(b)的核酸序列提供了制備多肽的手段。該方法可以在體外進行，例如在試管內或者類似地進行。在本領域內以及以下的描述中已知適宜的體外轉錄/翻譯系統或者無細胞表達系統。mRNA干擾酶或者其片段可以可選擇地作為表達蛋白提供，而不是以需要表達的核酸序列形式。
[0041]在一個特別的實施方案中，制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列ACA以及包含SEQ ID NO:2的mRNA干擾酶MazF或者其功能性片段。
[0042]在另一個實施方案中，制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列UAX以及包含SEQ IDNO:4的mRNA干擾酶PemK或者其功能性片段，其中X是C、A或U。
[0043]在另一個實施方案中，制備多肽的方法使用了 mRNA識別序列UAC以及包含SEQ IDNO:74的mRNA干擾酶MazF-mtl或者其功能性片段。
[0044]本發明還涉及使用本發明的mRNA干擾酶制備多個多核糖核苷酸序列的方法。該方法包含:(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一個區域與所述的第二核酸序列的一個區域互補，且所述的第一和第二核酸序列的互補區域都不包含與mRNA干擾酶識別位點互補的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它們的5’末端都被磷酸化；(b)通過所述的第一和第二核酸序列的互補區域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成雙鏈的核酸序列，其包含側翼為單鏈突出端的互補區域，其中每一個單鏈突出端包含至少一個與mRNA干擾酶識別位點互補的序列，且所述的單鏈突出端互相互補；(c)通過互補的單鏈突出端連接已經退火的第一和第二核酸序列，形成包含多個退火的第一和第二核酸序列的串聯重復的多聯體(concatamer) ； (d)使用第一引物(包含T7啟動子以及與所述的第一核酸序列互補的區域)和第二引物(與所述的第二核酸序列互補)擴增所述的多聯體，其中所述的擴增產生多個包含T7啟動子的多聯體；(e)使用T7RNA聚合酶從所述的多個多聯體轉錄出RNA分子，其中每一個所述的RNA分子包含多個側翼為mRNA干擾酶識別位點的多核糖核苷酸序列的串聯重復；以及(f)使用能夠在所述的干擾酶識別位點處切割RNA的mRNA干擾酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化產生多個所述多核糖核苷酸序列。
[0045]在制備多個多核糖核苷酸序列的方法的一個特別方面，mRNA識別序列是ACA序列，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO:2的MazF或者其功能性片段。[0046]在制備多個多核糖核苷酸序列的方法的另一個方面，mRNA識別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO:4的PemK或者其功能性片段。
[0047]在制備多個多核糖核苷酸序列的方法的另一個方面，mRNA識別序列是UAC序列，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO:74的MazF-mtl或者其功能性片段。
[0048]本發明還涉及分離的核酸序列，其編碼的多肽與SEQ ID NO: 2或者SEQ ID NO:4或其功能性片段具有序列和/或結構同源性，其中所述的多肽能夠表現出核糖核酸內切酶活性。在一個實施方案中，具有與SEQ ID NO:2或其功能性片段序列和/或結構同源性的多肽是MazF的直向同源物，它能夠表現出核糖核酸內切酶活性。能夠表現出核糖核酸內切酶活性的多肽包括，但是不止限于，耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)MazF(NP_244588.1),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) MazF(AAG23809.1),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) MazF(NP_372592.1),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is) MazF (1NE8_A),腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)MazF(NP_266040.1),摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)MazF(AAC82516.1)和結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) MazF (NP_217317.1)。
[0049]在另一個實施方案中，具有與SEQ ID NO:4或其功能性片段序列和/或結構同源性的多肽是PemK同源物或者直向同源物，它能夠表現出核糖核酸內切酶活性。能夠表現出核糖核酸內切酶活性的多肽包括，但是不止限于，PemK蛋白質家族的73個已知成員，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他的類PemK蛋白。下面是一個在網站上找到的這些蛋白名稱的清單(http://pfam.wustl.edu/cg1-bin/getdesc?acc=PF02452): Q9RX98; Q8F5A3; Q9K6K8;CHPA_EC0LI;Q7NPF9;Q88TP7;Q7WWW1;Q8YS80;Q8DW95;Q82YR2;Q7X3Y1;Q93S64;Q8PRN1;Q8GFYl;052205;PEMK_EC0LI Q7N4H2;Q88PS7;Q8XCF2CHPB_EC0LI;Q82VU0;Q8UGU5;Q9RWK4;Q9PHH8;Q7TXU4;P71650;Q7U1Y5;P96295;Q9JWF2;Q9JXII;Q8E882;Q82VB5;Q8KJS3;Q7NMY4;Q9KFF7;P96622;Q81IT4;Q81VF4;Q8ESK5;Q92DC7;Q8Y8L0;Q97LR0;Q8XNN7;Q8R861;Q88Z43;007123;Q837I9;Q9F7V5;Q8CRQ1;005341;P95840;Q9FCV0;Q837L1;Q93M89;Q99IU9;Q82UB5;Q93MT8;YJ91_MYCTU;Q97MV8;Q7NHW0;Q7NI95;Q8YML2;Q7NHR3;YE95_MYCTU;Q9PCB9;Q8YZW8;Q7TZ90;P95272;Q8VJR1;Q7U0N2;053450;006780;和 Q7U118。
[0050]本發明還包括了表達載體，它們包含了分離的核酸序列，其編碼的多肽具有SEQID NO:2或4或其功能性片段的序列和/或與SEQ IDNO:2或4或其功能性片段具有結構同源性，其中所述的多肽能夠表現核糖核酸內切酶活性。還包括包含這些表達載體的細胞以及包含本發明分離核酸序列的轉基因動物，其中核酸序列在轉基因動物的至少一個細胞中表達。
[0051]在本發明的另一方面，提出了分離的氨基酸序列，其包含的多肽具有SEQ ID NO:2或4或其功能性片段的序列和/或與SEQ ID NO:2或4或其功能性片段具有結構同源性，其中所述的多肽能夠表現核糖核酸內切酶活性。還包括了編碼本發明氨基酸序列的表達載體，其中氨基酸序列的表達由表達載體內的調控序列控制，也包括包含這種表達載體的細胞以及包含本發明氨基酸序列的轉基因動物，其中氨基酸序列在轉基因動物中的至少一個細胞中表達。
[0052]在本發明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3的分離核酸序列。其中的核酸序列編碼能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段。
[0053]本發明還描述了包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3的核酸序列的表達載體，其中的核酸序列編碼能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且SEQ ID NO:1或者SEQ I D NO:3與調控序列有效連接。而且包含這種表達載體的細胞也屬于本發明的范疇。
[0054]另一方面，提出了轉基因動物，其核酸序列包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3，其中的核酸序列編碼能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且其中核酸序列在轉基因動物中的至少一個細胞中表達。
[0055]還提供了編碼包含SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的多肽的分離的核酸序列，其中的多肽是mRNA干擾酶或者其功能性片段，能夠顯示核糖核酸內切酶活性。
[0056]另一方面，提供了包含分離核酸序列的表達載體，所述的核酸序列編碼包含SEQID NO:2或者SEQ ID NO:4的多肽，其中的多肽是能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，并且核酸序列與調控序列有效連接。本發明還包括了包含這些表達載體的細胞。
[0057]另一方面，提出了轉基因動物，其包含的分離核酸序列編碼包含SEQ ID N0:2或者SEQ ID NO:4的多肽，其中多肽是能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且核酸序列在轉基因動物中的至少一個細胞中表達。
[0058]在本發明的一個實施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的分離氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段，且mRNA干擾酶或者其功能性片段能夠表現出核糖核酸內切酶活性。
[0059]本發明還描述了表達載體，其編碼的分離氨基酸序列包含SEQ ID NO:2或者SEQID NO:4，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段，且mRNA干擾酶或者其功能性片段能夠表現出核糖核酸內切酶活性，且氨基酸序列的表達受到表達載體中調控序列的控制。本發明還包括包含這種表達載體的細胞。[0060]另一方面，提出了包含分離多肽的轉基因動物，所述多肽包含SEQID N0:2或者SEQ ID NO:4，其中多肽是能夠表現出核糖核酸內切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且多肽在轉基因動物中的至少一個細胞中表達。
[0061]本發明還包括試劑盒，其包含下列成分:分離的核酸序列，所述核酸序列包含SEQID NO:1或者SEQ ID NO:3，其中的核酸序列編碼mRNA干擾酶或者其功能性片段；包含SEQID NO:2或者SEQ ID NO:4的分離氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段；與mRNA干擾酶活性相容的緩沖劑；以及用法說明材料。
[0062]本發明還包括了本發明中mRNA干擾酶在涉及基因治療方面的應用。也可以通過工程化使細胞表達分子，該分子在受試對象(例如人受試對象)中有缺陷或者缺乏，使該細胞通過整合本發明的mRNA干擾酶而自毀，mRNA干擾酶的表達受到可誘導調控元件的控制。在基因治療應用中使用的用于細胞自毀的可誘導手段的整合，提供了一種自動防故障機制，這樣可以在這種細胞為受試對象帶來有利影響之后和/或在它們導致有害影響之前被清除掉。 [0063]附圖的簡要描述:
[0064]圖1A和IB顯示在不同固體培養基上的細胞增殖以及MazF RNA干擾酶家族不同成員的序列比對。圖1A顯示了分別轉化了 pBAD-MazF, pBAD-MazF R29S或者pBAD_MazFR86G質粒的大腸桿菌BW25113 (AaraBAD)細胞的生長性質。圖1B描繪了來自大腸桿菌的 MazF(GenBank Accession N0.NP_289336.1)與來自耐鹽芽抱桿菌(GenBank 登錄編號NP_244588.1),表皮葡萄球菌(GenBank登錄編號AAG23809.1),金黃色葡萄球菌(GenBank登錄編號NP_372592.1),枯草芽孢桿菌(GenBank登錄編號1NE8_A)，腦膜炎奈瑟氏球菌(GenBank登錄編號ΝΡ_266040.I),摩氏摩根氏菌(GenBank登錄編號AAC82516.1)以及結核分枝桿菌(GenBank登錄編號ΝΡ_217317.1)的MazF的序列比對。
[0065]圖2Α-Ε顯示了曲線圖，描繪了 MazF對于甲苯處理的大腸桿菌細胞35S-Met的摻入(Fig.2A)、[ a -32PldTTP 的摻入(Fig.2B)以及[a -32P]UTP 摻入(Fig.2C)的影響；以及MazF對于體內35S-Met摻入到大腸桿菌細胞中(Fig.2D)的影響；以及SDS-PAGE分析MazF誘導后體內蛋白質的合成(Fig.2E)。
[0066]圖3A-C顯示了線性示蹤(line trace)，描繪了多核糖體性質的光密度分析(圖3A),它顯示了 MazF對于多核糖體性質的影響，并且顯示了蛋白質凝膠,表明MazF(His)Jf于原核(圖3B)和真核(圖3C)的無細胞蛋白質合成的影響。
[0067]圖4A-D顯不MazF對mRNA合成的影響。圖4A顯不在MazF存在時mazG mRNA的足止紋分析。圖4B顯示了用酹抽提后mazG mRNA的趾紋分析。圖4C顯示了 MazE對于MazF對mazG mRNA切割的影響。圖4D顯示加入阿拉伯糖后(如所示)在不同時刻從含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細胞中提取總細胞mRNA進行Northern印跡分析的結果，使用放射性標記的ompA和Ipp ORF DNA作為探針。
[0068]圖5A和B顯示線性示蹤，顯示了春日霉素不存在(圖5A)和存在(圖5B)時多核糖體性質的光密度分析。70S、50S和30S核糖體的位置如所示。
[0069]圖6顯示了趾紋分析,顯示了核糖體對MazF對mazG mRNA切割的抑制。
[0070]圖7顯示了趾紋分析,顯示了 mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列由GGAG突變為UUUG對MazF功能的影響。[0071]圖8顯示了趾紋分析,顯示了 mazG mRNA起始密碼子的突變對于MazF功能的影響。
[0072]圖9顯示了趾紋分析，顯示了在切割序列處UACAU(U1A2C3A4U5)的突變對MazF功能的影響。
[0073]圖10顯示了丙烯酰胺凝膠，顯示了 MazF和MazE對于16S和23SrRNA切割的影響。
[0074]圖11顯示了對于純化的MazE-MazF(His)6復合物、MazF以及(His)6MazE蛋白的分析，使用tricine SDS-PAGE分離蛋白和考馬斯亮藍染色觀察。
[0075]圖12A和12B顯示了天然的聚丙烯酰胺凝膠,表明了在(His)6MazE和MazF之間化學計量形成的復合物。
[0076]圖13顯示了蛋白質分子量標準曲線的圖線，圖示了 MazF和MazE-MazF(His)6復合物的確定的分子量。
[0077]圖14A, 14B 和 14C 顯示了 EMSA 凝膠，圖示了 (His)6MazE 和 / 或 MazF 與 mazEF 啟動子DNA的結合。
[0078]圖15顯示了 MazE同源物氨基酸序列的比對。顯示了 8個MazE家族蛋白質的序列比對。
[0079]圖16A和16B顯示了 EMSA凝膠，圖示了蛋白質和DNA的相互作用。如圖16A和16B所示，MazE的N端結構域介導了 DNA分別與MazE-MazF(His)6復合物以及(His)6MazE蛋白質的結合。
[0080]圖17圖示了 MazE及其截斷產物，以及酵母雙雜交試驗的結果，表明了 MazF和MazE或者其截斷產物/片段的相互作用。
[0081]圖18A和18B分別顯示了非變性聚丙烯酰胺凝膠，圖示了蛋白質相互作用；以及圖示了蛋白質一 DNA相互作用的EMSA凝膠。
[0082]圖19圖示了 MazE-MazF復合物的X射線結構。
[0083]圖20A和20B顯示了大腸桿菌MazF的核酸和氨基酸序列。
[0084]圖2IA和2IB顯示了大腸桿菌MazE的核酸和氨基酸序列。
[0085]圖22A-22H顯示了大腸桿菌MazF直向同源物的核酸序列。
[0086]圖23A-23H顯示了大腸桿菌MazF直向同源物的氨基酸序列。
[0087]圖24A-24G顯示了大腸桿菌MazE直向同源物的核酸序列。
[0088]圖25A-25G顯示了大腸桿菌MazE直向同源物的氨基酸序列。
[0089]圖26A-C顯示了 PemK對于DNA和蛋白質合成的影響。圖26A和26B是曲線圖，圖示了 PemK對于體內DNA(A)和蛋白質⑶合成的影響。圖26C顯示了在PemK誘導之后總細胞蛋白的SDS-PAGE分析。
[0090] 圖27A-C顯示了 SDS-PAGE分離的蛋白質的放射性自顯影。結果表明了 PemK和PemI對于無細胞蛋白質合成的影響。
[0091]圖28A-E顯示了聚丙烯酰胺凝膠(A)或者聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B-E)的結果，表明PemK介導的核糖核酸內切酶活性。
[0092]圖29A-B顯示了聚丙烯酰胺測序凝膠(A)和聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B)的結果，表明PemK介導的核糖核酸內切酶活性對單鏈RNA的特異性。
[0093]圖30A-D顯示了 Northern印跡分析(A)或者聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B-D)的結果，圖示了 PemK在體內介導了對各種不同的mRNA的內切核酸酶活性。[0094]圖3IA和3IB顯示了大腸桿菌PemK的核酸和氨基酸序列。
[0095]圖32A和32B顯示了大腸桿菌PemI的核酸和氨基酸序列。
[0096]圖33顯示了 PemK、ChpBK和MazF多肽的序列比對。
[0097]圖34 顯不了 PemK, ChpBK, MazF 和來自隱藏分枝桿菌(Mycobacterium celatum),惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440 和弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri) 2astr.301的三個類PemK蛋白的序列比對。
[0098]圖35顯示了成熟人嗜酸性粒細胞趨化蛋白(eotaxin)的核酸和氨基酸序列(分別是 SEQ ID NO:67 和 68)。
[0099]圖36是pCold I載體的示意圖。
[0100]圖37顯示了聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影的結果，顯示了在沒有背景蛋白質合成的情況下成熟人嗜酸性粒細胞趨化蛋白的產生。
[0101]圖38A-F是顯微鏡照片，顯示了被誘導表達MazF毒素(D-F)和未誘導(A-C)的人細胞的形態。
[0102]圖39A-B顯示了(A)用pET28a表達的MazF (E24A)突變體N端延伸的氨基酸序列；以及(B)聚丙烯酰胺凝膠的照片，顯示了對應于切割的MazF突變體融合蛋白的條帶(泳道O以及凝血酶切割的MazF突變體融合蛋白(泳道2)。
[0103]圖40顯示了 MazF-mtIm RNA干擾酶活性的引物延伸分析。圖41A-B顯示了(A)大腸桿菌MazF及其在結核分枝桿菌中的同源物的序列比對以及(B)大腸桿菌MazF及其在枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)和金黃色葡萄球菌中的同源物的序列比對。
[0104]圖42顯示了 mazF開放閱讀框(ORF)的RNA序列。所有的ACA序列用灰色顯示，替換了 ACA序列而沒有改變由其編碼的MazF氨基酸序列的堿基改變在RNA序列的上方顯
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[0105]圖43A-E顯示了在結核分枝桿菌中的大腸桿菌MazF同源物的核酸序列。
[0106]圖44A-E顯示了在結核分枝桿菌中的大腸桿菌MazF同源物的氨基酸序列。
[0107]圖45A-D顯示了來自隱藏分枝桿菌，惡臭假單胞菌KT2440和弗氏志賀氏菌2astr.301的三個類PemK和ChpBK的核酸序列。
[0108]圖46A-D顯示了來自隱藏分枝桿菌，惡臭假單胞菌KT2440和弗氏志賀氏菌2astr.301的三個類PemK蛋白和ChpBK的氨基酸序列。發明詳述
[0109]在描述這里的發現及其使用方法之前，應當理解本發明不止限于這里描述的特定試驗方法，或者試驗化合物及試驗條件，因為這些方法和化合物可能是多樣的。還應當理解這里使用的術語目的僅僅是描述特定的實施方案，而不是要限制，因為本發明的范疇僅僅限于所附的權利要求。
[0110]因此，在說明書和權利要求中使用的術語"MazF"或"PemK"指的既有一般類型的核糖核酸內切酶，還有具有特定名稱的特定酶，包括與其具有結構和序列同源性的酶。同樣地，本發明包括的酶家族這里稱為“RNA干擾酶”，這是這里的
【發明者】發現的新家族。而且，本發明還包括了與其在本發明中的角色相一致的結構和功能相似性的分子。
[0111]而且，在說明書和權利要求中使用的術語"MazE"或"PemI"指的既有一般類型的MazE (或者MazF調節性分子)或者PemI (或者Pem K調節性分子)，還有具有這一名稱的特定分子，包括與SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:8具有結構和/或序列同源性的MazE (或者MazF調節性分子)或者PemI (或者Pem K調節性分子)。的確，本發明還包括了與其在本發明中的角色相一致的具有結構和功能相似性的分子。
[0112]細菌細胞的死亡和生長抑制是由細菌基因組中的內源毒素基因對于某些壓力條件的響應而引發。MazF是一個內源的毒素，它導致細胞的死亡，由大腸桿菌中被稱為"MazEF上癮組件〃的操縱子編碼。MazE是一個對抗MazF的不穩定的抗毒素。正如這里所描述的，在通透化的細胞中檢查MazF對DNA、RNA和蛋白質合成的作用。簡而言之，在MazF誘導之后10分鐘，ATP依賴的35S-甲硫氨酸的摻入被完全抑制，而[a -32P] dTTP和[a -32P]UTP的摻入沒有被抑制，表明MazF是蛋白質合成的特異抑制因子。而且，純化的MazF在原核和真核的無細胞系統中都抑制蛋白質的合成，且這種抑制在MazE存在的情況下被阻斷。在使用蔗糖密度梯度離心進行分析的時候，MazF的誘導阻斷了多核糖體的形成，同時增加了 70S核糖體的組分，而50S和30S核糖體組分沒有受到MazF表達的影響。
[0113]顯著的是，趾紋分析顯示MazF是一個序列特異的核糖核酸內切酶，它識別ACA序列，獨立于核糖體起作用。而且，Northern印跡分析表明在MazF誘導后總細胞mRNA被降解。因此本發明的
【發明者】有了一個令人驚奇的發現，MazF是一個新型核糖核酸內切酶家族第一個被確定的成員，考慮到其干擾細胞mRNA作用的能力，它在這里被命名為“mRNA干擾酶”。正如這里顯示的，干擾酶的功能由mRNA轉錄物在特異序列(ACA)處的切割產生，這導致細胞生長的迅速停止和/或細胞死亡。正如這里表明的，mRNA干擾酶的作用在正常的細胞生理和/或由壓力條件誘導的受損細胞生理中具有廣泛的含意。
[0114]本發明的
【發明者】還發現純化的PemK (由“peml-pemK上癮組件”編碼的毒素)抑制了在大腸桿菌無細胞系統中蛋白質的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI，恢復了蛋白質的合成。這里描述的其他研究顯示PemK是一個序列特異的切割mRNA的核糖核酸內切酶，因此抑制了蛋白質的合成。PemI阻斷了 PemK介導的核糖核酸內切酶活性，這樣恢復了蛋白質的合成。PemK只切 割單鏈RNA，優選在“UAX (X是C、A或者U)”識別位點的A殘基的5’或者3’ 一側切割。在誘導之后，PemK切割細胞mRNA，有效地阻斷大腸桿菌中蛋白質的合成。pemK的同源物已經在很多細菌的基因組中被發現，并且本發明的
【發明者】在這里提出PemK及其同源物組成了一個新的核糖核酸內切酶家族，該家族通過以序列特異的方式切割細胞mRNA干擾了 mRNA的功能。
[0115]為了更清楚地給出本發明的參數，使用以下的定義:
[0116]短語“側翼核酸序列”指的是那些位于內切核酸酶切割位點5’和3’的連續核酸序列。正如在本說明書和所附的權利要求中所使用的，除非在上下文中明確指明，單數形式〃a〃，"an"和〃the〃包括了復數指代。因此例如，“the method”包括一種或者更多的方法，和/或這里描述的步驟類型和/或在閱讀本公開材料之后本領域內的技術人員可以明確的
也聰坐坐
[0117]術語“內切核酸酶”指的是可以在內部切割DNA的酶。
[0118]術語“核糖核酸內切酶”指的是可以在內部切割RNA的酶。
[0119]術語“互補的”指的是表現出大體正常的堿基配對性質的兩條DNA鏈。但是互補的DNA可以含有一個或者更多的錯配。
[0120]術語“雜交”指的是在兩條互補的DNA鏈之間出現的氫鍵連接。
[0121]“核酸”或者“核酸分子”在這里使用，指的是任何單鏈或者雙鏈的DNA或RNA分子，如果是單鏈的，核酸分子的互補序列的分子可以是線形或者環狀形式。在討論核酸分子時，某個核酸分子的序列或者結構在這里進行描述時可以根據常規按照從5’到3’的方向給出其序列。在提到本發明的核酸時有時會用到術語“分離的核酸”。該術語在用于DNA時，所指的DNA分子已經與其來源的生物體天然存在的基因組上緊鄰的序列分離開來。例如，“分離的核酸”可能包含插入到載體例如質粒或者病毒載體中的DNA分子，或者整合到原核或者真核細胞或者生物體基因組DNA中的DNA分子。
[0122]在用于RNA時，術語“分離的核酸”主要是指根據以上確定的分離DNA分子編碼的RNA分子。或者該術語所指的RNA分子已經同在天然狀態(即在細胞或者組織中)下與該RNA分子聯系在一起的其它核酸充分地分尚開來了。分尚的核酸(DNA或者RNA)還可以代表通過生物學或者合成方式直接產生的、并且同其產生過程中存在的其他組分分離開來的分子。
[0123]某些核酸序列的“天然等位變異體”、“突變體”和“衍生物”指的是與該序列有密切聯系、但是可能具有天然或者人工設計的序列或者結構改變的序列。有緊密聯系的意思是序列中在確定長度上至少65%但是通常是85%以上的核苷酸與用一個特定SEQ ID NO:表示的核酸序列相匹配。緊密聯系的核酸序列之間核苷酸序列的改變或者差異可能代表了在某個核酸序列正常 的復制過程中或者天然的重復中產生的序列核苷酸的改變。其他的改變可以根據特別的目的，例如改變核酸中的氨基酸密碼子或者調控區域的序列，進行特異設計并且引入到序列中。這種特異的改變可以在體外使用多種不同的誘變技術進行，或者在被置于特定選擇條件(該條件誘導或者選擇這些改變)下的宿主生物體中進行。這種特異產生的序列變異體可以被稱作初始序列的“突變體”或者“衍生物”。
[0124]在提及某個特定序列時使用術語“百分比相似性”、“百分比一致性”以及“百分比同源性”，如同University of Wisconsin GCG軟件程序中提及的那樣,這在本領域內是已知的。
[0125]本發明還包括本發明MazF多肽或者蛋白質的活性部分、片段、衍生物以及功能性或者非功能性模擬物。MazF多肽的“活性部分”的意思是小于MazF多肽全長，但是仍然保留了可測量生物活性的肽。
[0126]mRNA干擾酶的“片段”或者“部分”的意思是一段氨基酸殘基的片段，至少有大約5-7個連續的氨基酸，一般至少有大約7-9個連續的氨基酸，通常至少有大約9-13個連續的氨基酸，最優選至少大約20-30個或者更多連續的氨基酸。mRNA干擾酶的“衍生物”或者其片段的意思是通過改變蛋白質的氨基酸序列，例如對編碼蛋白質的核酸進行操作或者改變蛋白質自身而形成的經修飾的多肽。這種天然氨基酸序列的衍生物可能涉及了一個或者更多氨基酸插入、添加、刪除或者替換，可能或者可能沒有改變原來mRNA干擾酶的基本活性。
[0127]在自然界中存在不同的mRNA干擾酶“變異體”。這些變異體可能是等位基因，其特征是編碼蛋白質的基因的核苷酸序列的差異，或者可能涉及不同的RNA加工或者翻譯后的修飾。技術人員可以制備出具有單一或者多個氨基酸替代、刪除、添加或者替換的變異體。此外，這些變異體可能包含:(a)其中一個或者更多氨基酸殘基被保守或者非保守的氨基酸替代的變異體，(b)其中一個或者更多氨基酸殘基被加入到mRNA干擾酶中的變異體，(c)其中一個或者更多氨基酸包含了取代基團的變異體，以及(d)其中mRNA干擾酶與另外一個肽或者多肽(例如融合伴侶、蛋白標簽或者其他化學部分，它們可能使mRNA干擾酶具有有用的性質，例如抗體的表位、多聚組氨酸序列、生物素部分等等)融合的變異體。本發明的其他mRNA干擾酶包括變異體，其中在保守或者非保守的位置來自一個物種的氨基酸殘基被另外一個物種的相應殘基替代。在另一個實施方案中，非保守位置的氨基酸殘基被保守或者非保守的殘基替代。獲得這些變異體的技術，包括遺傳學的(抑制、刪除、突變等)、化學的以及酶學的技術，對于本領域內具有普通技術的人員是已知的。
[0128]這種等位變異、類似物、片段、衍生物、突變體以及修飾，包括可變核酸加工形式和可變翻譯后修飾形式產生保留了 mRNA干擾酶任何生物學性質的mRNA干擾酶衍生物，它們包括在本發明的范疇中。
[0129]這里使用的術語〃直向同源物〃或者〃同源物〃指由核酸序列編碼的核酸酶，這些序列的多肽產物與MazF編碼序列有大于60%的序列一致性，和/或這些序列的基因產物與MazF有相似的三維結構和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但不限于，耐鹽芽孢桿菌的MazF (GenBank登錄編號ΝΡ_244588.I),表皮葡萄球菌的MazF (GenBank登錄編號AAG23809.1)，金黃色葡萄球菌的MazF (GenBank登錄編號ΝΡ_372592.1)，枯草芽孢桿菌的MazF (GenBank登錄編號1ΝΕ8_Α)，腦膜炎奈瑟氏球菌的MazF (GenBank登錄編號ΝΡ_266040.1),摩氏摩根氏菌(GenBank登錄編號AAC82516.1)和結核分枝桿菌(GenBank登錄編號ΝΡ_217317.1)。參見圖22和23。術語〃直向同源物〃和〃同源物〃可以用來指任何物種的MazF核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這些物種包括，但是不止限于，大腸桿菌，耐鹽芽孢桿菌，表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，結核分枝桿菌，小鼠(Mus musculus),以及智人(Homosapiens)。這里涉及了在本發明的方法中使用這些直向同源物/同源物編碼的核酸酶。[0130]正如這里所使用的，術語〃直向同源物〃或者〃同源物〃還指由一些核酸序列編碼的核酸酶，這些序列的多肽產物與PemK編碼序列有大于60%的序列一致性，和/或這些序列的基因產物與PemK有相似的三維結構和/或生化活性。術語〃直向同源物〃和〃同源物"可以用來指任何物種的PemK核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。
[0131]這里涉及了在本發明的方法中使用這些PemK的直向同源物/同源物編碼的核酸酶。示例性的同源物和直向同源物包括，但不限于，PemK蛋白質家族中的73個已知成員，包括MazF (ChpAK)，ChpBK以及其他類PemK蛋白。以下是在網站中(http: / /pfam.wustl.edu/cg1-bin/getdesc?acc=PF02452)找到的這些蛋白質的命名清單:Q9RX98;Q8F5A3;Q9K6K8;CHPA_EC0LI;Q7NPF9;Q88TP7;Q7WWW1;Q8YS80;Q8DW95;Q82YR2;Q7X3Y1;Q93S64;Q8PRN1;Q8GFY1;052205;PEMK_EC0LI Q7N4H2;Q88PS7;Q8XCF2CHPB_EC0LI;Q82VUO;Q8UGU5;Q9RWK4;Q9PHH8;Q7TXU4;P71650;Q7U1Y5;P96295;Q9JWF2;Q9JXII;Q8E882;Q82VB5;Q8KJS3;Q7NMY4;Q9KFF7;P96622;Q81IT4;Q81VF4;Q8ESK5;Q92DC7;Q8Y8L0;Q97LR0;Q8XNN7;Q8R861;Q88Z43;007123;Q837I9;Q9F7V5;Q8CRQ1;005341;P95840;Q9FCV0;Q837L1;Q93M89;Q99IU9;Q82UB5;Q93MT8;YJ91_MYCTU;Q97MV8;Q7NHW0;Q7NI95;Q8YML2;Q7NHR3;YE95_MYCTU; Q9PCB9; Q8YZW8; Q7TZ90; P95272; Q8VJR1; Q7U0N2; 053450; 006780;和 Q7U118。參見圖33 和 34。
[0132]Swiss-Protein 編號之后是 NCBI 編號。
[0133]Q9RX98NP_294140Q8F5A3NP_711962Q9K6K8NP_244588CHPA_EOTLI NP_417262Q7NPF9NP_923042Q88TP7NP_786238Q7fffffflNP_943016Q8YS80NP_487251Q8DW95NP_720642Q82YR2NP_816992Q7X3Y1NP_857606Q93564NP_862570Q8PRN1NP_644713Q8GFY1AAN87626.052205AAC82516PEMK_EOTLINP_957647Q7N4H2NP_929611Q88PS7NP_742932Q8XCF2NP_29085
7CHPB_BC0LI D49339Q82VU0NP_841047Q8UGU5NP_531638Q9RWK4AAF10240Q9PHH8NP_061683
Q7TXU4NP_856470P71650NP_217317Q7U1Y5NP_85412BP96295CAB03645Q9JWF2NP_283229Q9J
XI1AAF42359Q8E882NP_720377Q82VB5NP_841237Q8KJS3CAA70141Q7NMY4NP_923577Q9KFF7N
P_241388P96622NP_388347Q81IT4NP_830134Q81VF4NP_B42807Q8ESK5NP_691544Q92DC7NP_
470228Q8Y8L0NP_464414Q97LR0NP_347I34Q8XNN7NP_56I2I1Q8R861NP_62372IQ8BZ43NP_78
4302007123CAA70141Q837I9NP_814592Q9F7V5NP_765227Q8CRQ1AA005271005341NP_646809
P95840BAB95857Q9FCV0CAC03499Q837L1NP_814568Q93M89NP_150051Q82UB5NP_841618Q93M
T8NP_713024YJ91_MYCTUBP_216507Q99IU9P_856470Q97MV8NP_346728Q7NHW0NP_925371Q7N
I95NP_925234Q8TML2NP_488961Q7NHR3NP_925418YB95_MYCTTJCAA17218Q9PCB9NP_299148Q
8YZW8NP_484381Q7TZg0NP_855627P95272NP_216458Q8VJRlNP_336589Q7U0N2NP_854788053
450NP_216458006780NP_2I5173Q7UnMNP_854336.[0134]這里使用的術語〃直向同源物〃或“同源物”還指的是由核酸序列編碼的核酸酶(抗毒素或者核酸酶的調節劑)的結合伴侶，其多肽產物與MazE的編碼序列有大于60%的一致性，和/或其基因產物具有與MazE相似的三維結構和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但是不限于，MazE,耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank 登錄號 NP_294139) ;MazE,耐鹽芽孢桿菌(GenBank 登錄號 NP_244587) ;PemI,質粒 RlOO (GenBank 登錄號 NP_052993) ; PemI,質粒 R466b (GenBank 登錄號 AAC82515) ; ChpS,大腸桿菌(GenBank登錄號NP_290856) ; MazE,惡臭假單胞菌KT2440 (GenBank登錄號NP_742931) ;MazE, Photobacterium profundum(AAG34554)。參見圖 24 和 25。術語〃直向同源物"或“同源物”還可以指任何物種的MazE的核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這些物種包括，但是不止限于，大腸桿菌，耐放射異常球菌，耐鹽芽孢桿菌，惡臭假單胞菌,Photobacterium profundum,表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，結核分枝桿菌，小鼠(Mus musculus),以及智人。這里還涉及由這些直向同源物/同源物編碼的核酸酶調節性分子(抗毒素)在本發明方法中的使用。
[0135]正如這里所使用的，術語〃直向同源物〃或“同源物”還指的是由核酸序列編碼的核酸酶結合伴侶(抗毒素或核酸酶的調節劑)，其多肽產物與PemI編碼序列有大于60%的序列一致性，和/或其基因產物與PemI有相似的三維結構和/或生化活性。示例性的PemI的直向同源物/同源物包括，但不止限于，MazE (抗毒素)蛋白質家族中的已知成員，包括MazE (ChpAI) ,ChpBI以及其他MazE的同源物。術語〃直向同源物〃和“同源物”可以用來指任何物種的PemI核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這里涉及了在本發明的方法中使用這些同源物編碼的核酸酶調節性分子。這里涉及了在本發明的方法中使用這些同源物/直向同源物編碼的核酸酶調節性分子(抗毒素)。
[0136]正如在這里所使用的，術語“功能性的”意味著核酸或者氨基酸序列對于所述的試驗或者目的是有功能的。
[0137] 正如在這里所使用的，術語“功能性片段”意味著核酸或者氨基酸序列是全長多肽的一部分或者亞結構域，并且對于所述的試驗或者目的是有功能的。[0138]在指一個特定的核苷酸或者氨基酸時，短語“基本由……組成”的意思是具有給定SEQ ID NO:序列性質的序列。例如在用來指一個氨基酸序列時，該短語包括了該序列本身以及不會影響該序列基本性質和新性質的分子修飾。
[0139]“復制子”是能夠主要在自身的控制下復制的任何遺傳元件，例如質粒、粘粒、桿粒、噬菌體或者病毒。復制子可以是RNA或者DNA,可以是單鏈或者雙鏈。
[0140]“載體”是一個復制子，例如質粒、粘粒、桿粒、噬菌體或者病毒，另外的遺傳序列或者元件(DNA或者RNA)可以與其相連,使得連接的序列或者元件也能復制。
[0141]“表達載體”或者“表達操縱子”指的是可能具有轉錄和翻譯控制序列(例如啟動子、增強子、翻譯起始信號(例如ATG或者AUG密碼子)、多聚腺苷酸化信號、終止子等等)的核酸片段，其有助于多肽編碼序列在宿主細胞或者生物體中的表達。
[0142]正如這里所使用的，術語“有效連接”指的是能夠介導編碼序列表達的調控序列，它被放在DNA分子(例如表達載體)中相對于編碼序列的適當的位置上，使得編碼序列被表達。同樣的定義有時應用在表達載體中的編碼序列和轉錄控制元件(例如啟動子、增強子和終止元件)的排列上。當產生了雜合核酸分子時，該定義有時還應用在雜合分子中第一個第二個核酸序列的核酸序列的排列上。
[0143]正如這里使用的，術語“寡核苷酸”指的是本發明的引物和探針，其定義為由兩個或者更多核糖或者脫氧核糖核苷酸、優選是三個以上核苷酸組成的核酸分子。寡核苷酸的準確大小取決于各種不同的因素、特定的應用以及寡核苷酸的使用。
[0144]正如這里所使用的，術語“探針”指的是寡核苷酸，多核苷酸或者核酸，可以是RNA或者是DNA，可以是天然 存在的(如從限制性酶消化產物純化得到的)或者合成產生的，能夠與序列同探針互補的核酸退火或者特異雜交。探針可以是單鏈或者雙鏈的。探針的準確長度取決于許多因素，包括溫度、探針的來源以及使用方法。例如對于診斷應用，根據靶向序列的復雜程度，寡核苷酸探針通常含有15-25或者更多的核苷酸，盡管它可能含有更少的核苷酸。在這里，選擇探針，使其與特定的靶核酸序列的不同鏈“基本”互補。這意味著探針必須充分互補，才能夠在一系列預先設置的條件下與它們各自的靶鏈“特異雜交”或者退火。因此，探針的序列不需要是靶標的精確互補序列。例如，一個非互補的核苷酸片段可以連接在探針的5’或者3’端，探針序列的剩余部分與靶鏈互補。另外，在探針序列同與探針特異退火的靶核酸序列有充分互補性的條件下，可以將非互補堿基或者更長的序列分散到探針中。
[0145]術語“特異雜交”指的是充分互補序列的兩個單鏈核酸分子之間的結合使得在本領域內一般使用的預先設定的條件下這種雜交可以進行(有時稱為“基本互補”)。特別地，該術語指的是寡核苷酸與本發明的單鏈DNA或者RNA內部含有的基本互補序列之間的雜交，基本排除了寡核苷酸與非互補序列單鏈核酸之間的雜交。
[0146]正如這里所使用的，術語“引物”指的是寡核苷酸，可以是RNA或者DNA，單鏈或者雙鏈，可以來源于生物系統，由限制性酶切產生或者合成產生，當所述的寡核苷酸置于適當的環境中時，就能夠作為依賴于模板進行核酸合成的起始物而起作用。在提供了正確的核酸模板、核酸的適宜的核苷三磷酸前體、聚合酶、適宜的輔助因子和條件(如適宜的溫度和pH)時，引物就可以在其3’端通過聚合酶的作用或者類似的活性，通過加入核苷酸而得到延伸，產生引物延伸的產物。引物的長度根據特定的條件和應用的需要可以有所不同。例如，在診斷應用中，寡核苷酸引物的長度通常是15-25或者更多的核苷酸。引物必須與所要求的模板充分互補，才能引發所需延伸產物的合成，即引物應能夠與所要求的模板鏈退火，退火的方式足以將引物的3’羥基部分置于正確的鄰近位置，用于在聚合酶或者類似的酶作用下引發合成。并不需要引物的序列是所要求模板的完全互補序列。例如，非互補的核苷酸序列可以連接在互補引物的5’端。另外，在引物序列與所要求的模板鏈有充分互補性，能夠有功能地提供一個模板-引物復合物用于延伸產物合成的前提下，可以將非互補堿基分散到寡核苷酸引物序列中。
[0147]引物可以用6-羧基熒光素出-FAM)進行熒光標記。或者引物可以用4，7，2’，7’-四氯-6-羧基熒光素(TET)進行標記。其他的DNA標記方法在本領域內是已知的并且被認為是在本發明范疇 內的。
[0148]這里有時使用術語“分離的蛋白質”或者“分離和純化的蛋白質”。該術語主要是指通過表達本發明的分離核酸分子產生的蛋白質。或者該術語所指的蛋白質已經同在天然狀態下與該蛋白質聯系在一起的蛋白質充分地分離開來，以“基本純”的形式存在了。“分離的”并不意味著排除與其他化合物或者材料形成人工或者合成混合物，以及不干擾基本活性的不純物質的存在，這些物質可能由于例如不完全的純化、穩定劑的加入或者配置成為如免疫原性制劑或藥物上可以接受的制劑而存在。
[0149]術語“基本純”指的是一種制劑包含至少50-60%重量的給定材料(例如核酸、寡核苷酸、蛋白質等等)。更為優選地，制劑包含至少75%重量，最優選90-95%重量的給定化合物。純度是由適合于給定化合物的方法來量度的(例如色譜法、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC分析等等)。“成熟的蛋白質”或者“成熟的多肽”所指的多肽是具有任何加工事件之后的多肽序列，這些加工事件在多肽產生的過程中通常就出現，例如多肽前體的蛋白酶水解加工過程。在確定成熟蛋白質的序列或者界限時，成熟蛋白質序列的第一個氨基酸被稱為氣基酸殘基I。
[0150]術語“標簽”、“標簽序列”或者“蛋白質標簽”指的是化學部分，可以是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或者氨基酸、肽或者蛋白質或者其他化學物質，當這些物質加入到另一個序列中，則提供了額外的用處或者使序列具有了有用的性質，特別是關于檢測或者分離該序列的方法的有用性質。因此，例如可以將與捕獲寡核苷酸互補的同聚核酸序列或者核酸序列加到引物或者探針序列上，促進接下來對延伸產物或者雜交產物的分離。如果是蛋白質標簽，可以將組氨酸殘基(例如4-8個連續的組氨酸殘基)加在蛋白質的氨基或者羧基端，通過金屬螯合層析促進蛋白質的分離。或者將代表與特異抗體分子或其他分子有反應性的表位或結合決定簇的氨基酸序列、肽、蛋白質或融合伴侶(例如flag表位、c-myc表位、流感A病毒血凝素蛋白跨膜表位、蛋白A、纖維素結合結構域、鈣調蛋白結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、幾丁質結合結構域、谷胱甘肽S-轉移酶等等)加到蛋白質之上，促進蛋白質通過親和或者免疫親和層析的步驟被分離。化學標簽分子包括如生物素的分子，它們可以加在核酸或者蛋白質上，有助于通過與抗生物素蛋白試劑等等的相互作用對核酸和蛋白質進行分離和檢測。受過訓練的技術人員知道并且可以設想出許多其他的標簽分子，它們也被認為是這一定義范疇內的。
[0151]術語“轉化”、“轉染”、“轉導”所指的是核酸引入到細胞或者宿主生物體中的方法或者手段，可以交換使用表達相同的含義。這些方法包括，但是不止限于，轉染、電穿孔、微注射、PEG融合等等。
[0152]被引入的核酸可以整合(共價連接)或者不整合到受體細胞或者生物體的核酸中。例如在細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞中，引入的核酸可以作為附加體元件或者獨立復制子如質粒的形式維持。或者被引入的核酸可以整合到受體細胞或者生物體的核酸中，穩定地維持在那個細胞或者生物體中，進一步傳遞或者遺傳到受體細胞或生物體的子代細胞或生物體中。在其他應用中，引入的核酸在受體細胞或者宿主生物體中可能僅僅短暫存在。
[0153]“克隆”或者“克隆細胞群”是一群從單一細胞或者共同祖先通過有絲分裂形成的細胞。
[0154]“細胞系”是能夠在體外穩定生長多代的原代細胞或細胞群的克隆。
[0155]含有本發明的分子或者化合物的組合物可以進行給藥，用于預防和/或治療性治療。在一個治療性應用中，例如，將組合物施用給已經患有過度增生性疾病(例如癌癥)的患者，施用的量足以治愈或者至少部分停止疾病及其并發癥的癥狀。足以完成這一目的的量被確定為“治療上有效的量或者劑量”。對于這一用途有效的量取決于疾病的嚴重性以及患者的體重和一般狀況。
[0156]正如這里所使用的，術語“癌癥”指的是由于細胞不可控制的持續增殖導致的組織的異常生長。可以根據本發明的方法進行治療的癌癥的示例包括，但不止限于，肉瘤，母細胞瘤和癌例如:纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結腸癌，結腸直腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌，腦膜癌病(最常見與擴散的乳腺或者肺癌相伴)，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊 腺癌，髓樣癌，肺癌，腎細胞癌，肝癌，肝癌轉移，膽管癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚胎性癌，甲狀腺癌例如未分化甲狀腺癌，腎母細胞瘤，宮頸癌，睪丸癌，肺癌例如小細胞肺癌和非小細胞肺癌，膀胱癌，上皮細胞癌，神經膠質瘤，星型細胞瘤，成神經管細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細胞瘤，聽神經瘤，少突膠質細胞瘤，腦脊膜瘤，黑色素瘤，母細胞胞瘤和視網膜母細胞瘤。
[0157]可以根據本發明的方法進行治療的血液惡性腫瘤的示例包括:急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多發性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(NHL)，何杰金疾病和淋巴瘤(HD)，幼淋巴細胞白血病(PLL)，和骨髓增生異常綜合征(MDS)。
[0158]“免疫應答”表示的是任何抗原例如蛋白質抗原在具有正常功能免疫系統的宿主中產生的反應。免疫應答可以是體液的，涉及免疫球蛋白或者抗體的產生，或者是細胞的，涉及多種不同類型的B和T淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞等等，或者既有體液免疫又有細胞免疫。免疫應答還可能涉及多種不同的效應分子的產生和修飾，例如細胞因子、淋巴因子等。免疫應答可以在體外以及在各種不同的細胞或者動物系統中進行測量。
[0159]“抗體”或者“抗體分子”是任何與特異抗原結合的免疫球蛋白，包括抗體和抗體片段。該術語包括了多克隆、單克隆、嵌合以及雙特異性抗體。正如這里所使用的，抗體或抗體分子涉及完整無缺的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫學活性部分例如那些在本領域內已知的部分，如Fab, Fab’，F (ab，) 2和F (V)。[0160]術語“細胞底物”指的是細胞內的分子，它是酶或者相關酶家族的酶促靶標。就mRNA干擾酶而言，“細胞底物”包括了細胞內由內源或者外源核酸序列表達的多聚核糖核苷酸。
[0161]正如這里所使用的，短語“在促進核糖核酸內切酶活性的條件下”包括了細胞內(在細胞培養中或者在體內)或者體外(在試管中或者其他類似的容器中)的任何條件，其中本發明的mRNA干擾酶表現出核糖核酸內切酶活性。這些條件在這里提出的實施例中有所描述。類似地，“與mRNA干擾酶相容的緩沖劑”是一種緩沖劑，本發明的mRNA干擾酶在其中表現出核糖核酸內切酶活性。
[0162]正如這里所使用的，術語“mRNA干擾酶調節劑”指的是一種能夠調節mRNA干擾酶的核糖核酸內切酶活性(例如提高或者降低)的因子。篩選或者鑒別這種因子的方法在以下提出。示例性的內源mRNA干擾酶調節劑包括MazE (抑制MazF的活性)以及PemI (抑制PemK的活性)。這里也描述了 MazE和PemI的功能性片段，它們能夠分別抑制MazF和PemK的活性。
[0163]除非另有定義，這里使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬的領域內一個具有普通技術的人員通常理解的含義相同。雖然在本發明的實踐或者試驗中可以使用任何與這里描述的相似 或者相同的方法和材料，但是現在描述優選的方法和材料。這里提到的所有出版物在這里被引用，以公開和描述被引用的出版物與其有關的方法和材料。
[0164]1.編碼mRNA干擾酶的核酸分子以及mRNA干擾酶的制備
[0165]核酸分子
[0166]可以通過兩種一般的方法制備編碼本發明核糖核酸內切酶(例如MazF或PemK)的核酸分子:(I)從適當的核苷酸三磷酸合成；或者(2)從生物來源中分離，兩種方法使用的試驗方案是本領域內眾所周知的。
[0167]核苷酸序列信息，例如SEQ ID NO:1或者3的全長cDNA (見圖20A和31A)，使得通過寡核苷酸合成制備本發明的分離核酸分子成為可能。合成的寡核苷酸可以通過亞磷酰胺方法制備，使用AppliedBiosystems380A DNA合成儀或者類似的裝置。產生的構建體可以根據本領域內已知的方法例如高效液相色譜(HPLC)進行純化。由于目前的寡核苷酸合成方法中固有的大小限制，長的雙鏈多核苷酸，例如本發明的DNA分子，必須分步合成。然后，通過這種方法構建的合成DNA分子可以被克隆并擴增到適當的載體中。使用本領域內已知的方法，可以從適當的生物來源中分離編碼mRNA干擾酶的核酸序列。在一個優選的實施方案中，從一個細菌來源的cDNA表達文庫中分離出cDNA克隆。在另一個實施方案中，使用該cDNA序列提供的序列信息，可以分離出編碼mRNA干擾酶的基因組克隆。或者，可以使用mRNA干擾酶基因內部預先確定的序列對應的寡核苷酸探針，從其他物種中分離出與mRNA干擾酶具有同源性的cDNA或者基因組克隆。
[0168]根據本發明，可以使用適當嚴謹性的雜交以及漂洗條件，鑒定出與SEQ ID NO:1或3的蛋白編碼區域具有適當同源性水平的核酸。例如，可以使用包含下列的雜交溶液進行雜交:5X SSC, 5X Denhardt's試劑，0.5-1.0%SDS, 100微克/毫升變性的片段化的鮭精DNA, 0.05%焦磷酸鈉以及至多50%的甲酰胺。一般在37-42攝氏度進行雜交，至少6小時。雜交之后，按照下面的步驟漂洗濾膜:(1)2X SSC,0.5-P/oSDS中室溫下漂洗5分鐘；(2)在2X SSC,0.1%SDS中室溫下漂洗15分鐘;(3)在IX SSC, 1%SDS中37攝氏度下漂洗30分鐘到I小時；(4)在IX SSC, 1%SDS中42-65攝氏度下漂洗2小時，每30分鐘更換一次溶液。
[0169]一個計算在兩個具有特定序列同源性的核酸分子之間雜交所需的嚴謹性條件的通用公式(Sambrook et al.，1989)是:Tm=81.5°C 16.6Log[Na+] +0.41 (%G+C) -0.63 (% 甲酰胺)-600/雙鏈中的堿基對數目。
[0170]為了說明以上公式，使用[Na+] = [0.368]和50%的甲酰胺，GC含量是42%，平均的探針大小是200bp，則1'111是57攝氏度。同源性每降低1%，DNA雙鏈的Tm降低1_1.5攝氏度。這樣，使用42攝氏度的雜交溫度可以觀察到具有大于約75%序列一致性的靶標。這樣的一個序列被認為與本發明的核酸序列具有顯著的同源性。
[0171]從上可以看出，雜交和漂洗的嚴謹性主要取決于溶液的鹽濃度和溫度。一般地，為了使兩個核酸分子的退火比率最大化，通常在計算出來的雜合分子的Tm值以下20-25攝氏度下進行雜交。對于探針同靶標一致性的程度而言，漂洗條件應該盡可能的嚴謹。一般地，漂洗條件應該選擇低于雜合分子Tm大約12-20攝氏度。就本發明的核酸而言，中度的嚴謹性雜交條件確定為:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升變性的鮭精DNA，42攝氏度下雜交。漂洗條件是2X SSC，0.5%SDS，55攝氏度15分鐘。高度的嚴謹性雜交條件確定為:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升變性的鮭精DNA, 42攝氏度。漂洗條件是IX SSC，0.5%SDS，65攝氏度15分鐘。非常高嚴謹性雜交條件確定為:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升變性的鮭精DNA, 42攝氏度。漂洗條件是0.1X SSC, 0.5%SDS，65攝氏度15分鐘。
[0172]本發明的核酸可以作為DNA，在任何方便的克隆載體中保存。在一個優選的實施方案中，克隆在質粒克隆/表達載體中保存，例如在pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.)中，其可以在適宜的大腸桿菌宿主細胞中增殖。本發明中編碼mRNA干擾酶基因的基因組克隆可以在lambda噬菌體FIX II(Stratagene)中保存。
[0173]本發明中編碼mRNA干擾酶的核酸分子包括cDNA、基因組DNA、RNA及其片段，它們可以是單鏈或者雙鏈的。這樣，本發明提供了寡核苷酸(DNA的有義或者無義鏈或者RNA)，它們具有的序列能夠與至少一個本發明的核酸分子序列(例如SEQ ID NO:1或者3的cDNA中選出的片段)進行雜交。這種寡核苷酸在檢測或分離mRNA干擾酶基因的探針時是有用的。
[0174]本領域內的技術人員應當理解在細菌的群體和/或物種中存在這些序列的變異體(例如等位變異體)，而且在設計和/或使用本發明的寡核苷酸時必須考慮到變異體。因此，本發明的范疇也包括了這樣的變異體，涉及這里公開的mRNA干擾酶序列或者靶向于各自基因或RNA轉錄本上特定位置的寡核苷酸。就這種變異體的包括而言，這里使用術語“天然的等位變異體”，指在一個給定的DNA群體中可能出現的多種不同的特異核苷酸序列及其變異體。在被編碼的蛋白中引起保守或者中性氨基酸替代的遺傳多態性是這種變異體的實例。
[0175] 此外，術語“基本互補的”指的是與靶序列不完全匹配的寡核苷酸，但是這些錯配沒有在實質上影響該寡核苷酸在描述的條件下與其靶序列雜交的能力。
[0176]這樣，編碼序列可能是在例如SEQ ID NO:1或3中顯示的或者可能是這兩個序列中一個的突變體、變異體、衍生物或者等位基因。該序列可能與所示的序列有所不同，區別在于所示序列的一個或者更多的核苷酸出現一個或者更多的添加、插入、刪除以及替代。核苷酸序列的改變可能導致蛋白質水平上由遺傳密碼確定的氨基酸的改變或者不變。
[0177]因此，根據本發明的核酸可能包括與SEQ ID NO:1或3所示的序列不同的序列，但是它編碼的多肽與SEQ ID NO:1或3編碼的多肽具有相同的氨基酸序列。
[0178]另一方面，編碼的多肽包含的氨基酸序列可能與SEQ ID NO:2或者4所示的氨基酸序列有一個或者更多氨基酸殘基的差異。參見圖20B和31B。本發明還提供了編碼多肽的核酸序列，所述多肽是SEQ ID NO:2或者4所示氨基酸序列的突變體、變異體、衍生物或者等位基因。編碼這種多肽的核酸與SEQ ID NO:1或3所示的編碼序列可能有大于60%的一致性，大于約70%的一致性，大于約80%的一致性，大于約90%的一致性或者大于約95%的一致性。
[0179]本發明提供了獲得目標核酸的方法，該方法包括將具有部分或者全部SEQ ID NO:I或3所示序列或者其互補序列的探針與靶核酸雜交。成功的雜交可以使與探針雜交上的核酸被分離出來，這可能涉及一個或者更多的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增步驟。
[0180]這種寡核苷酸探針或者引物，以及全長的序列(以及突變體、等位基因、變異體和衍生物)在篩選含有核酸的檢測樣品中是否存在mRNA干擾酶的等位基因、突變體或者變異體時是有用的，探針與從待測的細胞、組織或者生物體獲得的樣品中的靶序列雜交。可以控制雜交的條件，使非特異結合最小化。優選地使用嚴謹到中度嚴謹的雜交條件。在教科書例如Sambrook et al (1989)和Ausubel et al (1992)的幫助下,技術人員能夠容易地設計這種探針、標記它們并且設計適宜的雜交反應條件。
[0181]在一些優選的實施方案中，根據本發明的寡核苷酸(是SEQ ID NO:1或3所示序列的片段或者任何與核糖核 酸內切酶活性相關的等位基因)，其長度至少大約10個核苷酸，更為優選至少15個核苷酸長，更為優選至少大約20個核苷酸長。這些片段各自代表了本發明的方面。片段和其他寡核苷酸可以用作所討論的引物或者探針，但是也可以通過與確定檢測樣品中是否存在編碼mRNA干擾酶的同源物或者直向同源物序列有關的方法產生(例如通過PCR)。
[0182]B.蛋白質
[0183]MazF是第一個被發現以高度特異性在特異的核酸序列(即ACA)處切割RNA的核酸酶。PemK是第一個被發現以高度特異性在特異的核酸序列(即UAX，其中X是C、A或U)處切割RNA的核酸酶。本發明的全長mRNA干擾酶蛋白(例如MazF或者PemK)可以根據已知的方法，以多種不同方式制備。蛋白質可以從適當的來源中純化。但這不是一個優選的方法，原因是在任何時刻一個給定的細胞中存在的蛋白量可能很少。編碼MazF和PemK的核酸分子的可獲得性使得用本領域內已知的體外表達方法生產這兩個蛋白成為可能。例如可以將cDNA或者基因克隆到適當的體外轉錄載體例如pSP64或者pSP65中，用于體外轉錄，之后在適宜的無細胞翻譯系統(例如小麥胚芽或者兔網織紅細胞裂解物)中進行無細胞翻譯。體外轉錄和翻譯系統是商品化的，可以從例如Promega Biotech, Madison, Wis.或者BRL, Rockville, Md 獲得。
[0184]或者，根據一個優選的實施方案，可以通過在適宜的原核或者真核系統中表達生產大量的mRNA干擾酶。例如，DNA分子的部分或者全部，例如SEQ ID NO:1或3的cDNA，可以插入到適合于在細菌細胞如大腸桿菌細胞中表達的質粒載體中。這種載體包含DNA在宿主細胞(如大腸桿菌)中表達所需的調控元件，調控元件的位置允許DNA在宿主細胞中表達。這種表達所需的調控元件包括啟動子序列、轉錄起始序列以及可選擇地，增強子序列。
[0185]在重組原核或者真核系統中基因表達產生的mRNA干擾酶可以根據本領域內已知的方法進行純化。在一個優選的實施方案中，可以使用商品化的表達/分泌系統，通過它重組蛋白表達之后從宿主細胞中分泌出來，容易地從周圍的培養基中純化出來。如果不使用表達/分泌載體，另外一種方式涉及用親和分離純化重組蛋白，例如與特異結合重組蛋白的抗體發生免疫相互作用或者用鎳層析柱，用于分離在N端或者C端添加6-8個組氨酸的標簽的重組蛋白。其他的標簽可能包括FLAG表位或者血凝素表位。這些方法是技術人員通常使用的。
[0186]通過以上提到的方法制備的本發明的mRNA干擾酶，可以根據標準的步驟進行分析。例如，可以根據已知的方法，對這些蛋白進行氨基酸序列分析。
[0187]本發明還提供了是氨基酸序列變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽。屬于變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能具有與SEQ ID NO:2給出的序列不同的序列，有一個或者更多氨基酸的一個或多個添加、替換、刪除以及插入。優選的這些多肽具有MazF的功能，即具有一個或者更多以下性質:在RNA中切割ACA序列的能力；與抗體的交叉反應性，該抗體與具有SEQ ID NO:2序列的多肽具有反應性；與SEQ ID NO:2給出的序列所示的多肽具有共同表位(根據例如兩個多肽之間的免疫交叉反應確定)。
[0188]或者屬于變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能具有與SEQ ID NO:4給出的序列不同的氨基酸序列，有一個或者更多氨基酸的一個或多個添加、替換、刪除以及插入。優選的這些多肽具有PemK的功能，即具有一個或者更多以下性質:在RNA中切割UAX序列(其中X是C、A或者U)的能力；與抗體的交叉反應性，該抗體與具有SEQ ID NO:4序列的多肽具有反應性；與SEQ ID NO:4給出的序列所示的多肽具有共同表位(根據例如兩個多肽之間的免疫交叉 反應確定)。
[0189]屬于SEQ ID NO:2或者4所示氨基酸序列的氨基酸序列變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能包含的氨基酸序列與所示的序列有大約35%以上的序列一致性、大約40%以上的一致性、大約50%以上的一致性、大約60%以上的一致性、大約70%以上的一致性、大約80%以上的一致性、大約90%以上的一致性或者大約95%以上的一致性。特定的氨基酸序列變異體與SEQ ID NO:2或者4所示的序列之間,通過插入、添加、替換或者刪除I個氨基酸、2，3，4，5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，或者 150 個以上的氨基酸而可能有差異。氨基酸的“同源性”可以被理解為一致性或者相似性(根據確定的氨基酸相似性原則，例如，使用算法GAP (Genetics Computer Group, Madison, Wis.)確定的相似性原則)。GAP使用Needleman和Wunsch算法比對兩個完整序列，使匹配的數目最大化,使缺口數目最小化。一般地，使用缺省參數:缺口產生罰分=12以及缺口延伸罰分=4。使用GAP可能是優選的但是也可以使用其他算法，包括，但不止限于，BLAST(Altschul et al.(1990J.Mol.Biol.215:405-410) ; FASTA (Pearson and Lipman (1998) PNAS USA85:2444-2448)或者Smith Waterman算法(Smith and Waterman (1981) J.Mol.Biol.147:195-197), 一般使用缺省參數。在這里使用術語“同源性”或者“同源的”并不意味著所比較的兩個序列之間有任何必然的進化關系。這兩個術語的使用與短語“同源重組”的使用類似，即術語僅僅要求兩個核苷酸序列充分相似，以在適當的條件下重組。
[0190]根據本發明的多肽可以用于篩選影響或者調節其活性或功能的分子。這些分子可以用于研究目的。
[0191]本發明還提供了能夠免疫特異性結合本發明蛋白質的抗體。針對mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)的多克隆抗體可以根據標準方法制備。在一個優選的實施方案中，制備了單克隆抗體，它們與mRNA干擾酶的各種不同的表位發生免疫特異反應。可以根據Kohler和Milstein的一般方法，使用標準試驗方案制備單克隆抗體。與mRNA干擾酶發生免疫特異反應的多克隆或者單克隆抗體可以用于鑒定和純化這些蛋白質。例如，抗體可以用于親和分離與其發生免疫特異相互作用的蛋白質。還可以使用抗體從含有蛋白質和其他生物分子混合物的樣品中將蛋白質免疫沉淀出來。以下描述了抗mRNA干擾酶的抗體的其他用途。
[0192]根據本發明的抗體可以通過多種方式進行修飾。的確術語“抗體”應當被理解為任何具有所需特異性的結合結構域的結合性物質。因此，本發明包括了抗體片段、抗體的衍生物、功能性等價物以及同源物，包括合成的分子和形狀模擬了抗體使其能夠結合抗原或者表位的分子。
[0193]示例性的能夠結合抗原或者其他結合伴侶的抗體片段有:由VL，VH, Cl和CHl結構域組成的Fab片段；由VH和CHl結構域組成的Fd片段；由抗體一個單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的dAb片段；分離的⑶R區域以及F (ab’) 2片段，它是包括了兩個Fab片段的雙價片段，這兩個Fab片段在鉸鏈區由一個二硫橋連接。還包括了單鏈的Fv片段。[0194]II編碼mRNA干擾酶的核酸、mRNA干擾酶及其抗體的使用
[0195]例如MazF和PemK是RNA核酸內切酶，可以用于降低或者抑制細胞、組織或者生物體內的蛋白質合成。而且，本發明的mRNA干擾酶可以特異地靶向于受試對象的特定組織，以特異降低或者抑制在靶向組織中的蛋白質合成。對于一些應用，有利的是靶向特異的RNA轉錄產物，用于MazF的核酸內切酶切割。這種序列可能包含升高頻率的ACA序列，因此是MazF活性的天然優選靶標。或者可以通過改變MazF多肽使其特異地或者優先結合和/或切割用于切割的轉錄產物，從而靶向RNA轉錄產物用于MazF的切割。或者，可能有利的是靶向特異的RNA轉錄產物用于PemK的核酸內切酶切割。這種序列可能包含升高頻率的UAX序列(其中X是C、A或者U),因此是PemK活性的天然優選祀標。或者可以通過改變PemK多肽使其特異地或者優先結合和/或切割用于切割的轉錄產物，從而靶向RNA轉錄產物用于PemK的切割。
[0196]特別地，mRNA干擾酶分子(例如MazF和PemK)以及本發明的組合物可以有利地用于治療具有過度增生性疾病的患者。這些疾病包括，但不止限于，不同組織的發育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過敏/哮喘、動脈粥樣硬化、血管成形手術后的再狹窄以及癌癥。mRNA干擾酶分子(例如MazF和PemK)以及本發明的組合物可以有利地用于治療具有細菌感染的患者。
[0197]此外，根據本發明的mRNA干擾酶核酸、蛋白質及其抗體，可以用作研究工具，鑒定其他密切參與RNA識別和切割反應的蛋白質。
[0198]A.編碼mRNA干擾酶的核酸
[0199]編碼MazF和PemK的核酸可以用于根據本發明的各種不同的目的。編碼MazF和PemK的DNA、RNA或者其片段可以用作探針，以檢測編碼類MazF以及類PemK蛋白質的基因的存在和/或表達。編碼MazF和PemK的核酸可以用于這種檢測的探針的方法包括，但是不止限于，(I)原位雜交；(2) Southern雜交；(3) northern雜交；以及(4)各種擴增反應例如 PCR。
[0200]本發明的編碼mRNA干擾酶的核酸還可以用作探針，鑒定來自其他細菌、植物或者動物物種的相關基因。本領域內眾所周知的是，可以調整雜交嚴謹性，使核酸探針與具有不同程度同源性的互補序列之間發生雜交。因此，編碼MazF和PemK的核酸可以用于鑒定和表征其他與MazF和/或PemK有不同程度相關性的基因，這樣使得進一步表征RNA降解系統的性質成為可能。此外，它們可以用于鑒定編碼與MazF和/或PemK相互作用的蛋白質的基因(例如通過“相互作用陷阱”技術)，這應該會進一步加快對參與RNA切割的組分的鑒定。
[0201]編碼MazF或者PemK的核酸分子或者其片段還可以用于控制MazF或者PemK的生產，這樣調控參與RNA切割反應的蛋白質的量。生理量的MazF或者PemK蛋白的改變可能顯著影響參與RNA切割的其他蛋白質因子的活性。
[0202]B.mRNA干擾酶及其抗體
[0203]通過編碼本發明MazF或者PemK的核酸的表達制備的純化mRNA干擾酶，例如分離的MazF或者PemK蛋白，或者其片段，可以用于制備多克隆或者單克隆抗體，所述抗體可以在檢查細菌細胞中MazF (或者含有MazF的復合物)或者PemK (或者含有PemK的復合物)的存在和累積時作為敏感的檢測試劑。重組技術使得表達含有部分或者全部MazF或者PemK蛋白質的融合蛋白成為可能。全長的蛋白質或者蛋白質片段可以用于產生一系列對于蛋白質表位特異的單克隆抗體，這樣就在檢測細胞中的蛋白質時提供了更高的敏感性。 [0204]對于mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)免疫特異的多克隆或者單克隆抗體可以用于多種不同的檢測中，對蛋白質進行檢測和定量。這些檢測包括，但是不止限于:(I)流式細胞儀分析；⑵在例如細菌細胞中mRNA干擾酶的免疫化學定位；以及(3)各種細胞的提取物的免疫印跡分析(例如，點印跡、Western印跡)。此外,如上面所描述,例如抗MazF和抗PemK抗體可以用于純化MazF及其直向同源物或者PemK及其直向同源物(例如親和柱純化、免疫沉淀)。
[0205]mRNA干擾酶，例如MazF或者PemK蛋白，還可以用于降低或者抑制細胞、組織或者生物體中蛋白質的合成，如上面所討論的。
[0206]從前面的討論中，可以看出本發明中編碼mRNA干擾酶的核酸、表達mRNA干擾酶的表達載體以及抗mRNA干擾酶的抗體，可以用于制備大量的mRNA干擾酶、檢測mRNA干擾酶的基因表達以及改變mRNA干擾酶的積累，目的是確定參與RNA切割的遺傳和蛋白質相互作用。
[0207]本發明的
【發明者】令人驚奇的發現來自細菌的穩定毒素MazF是一種核糖核酸內切酶。正如這里所描述的，MazF被作為稱作“RNA干擾酶”的新型酶家族的第一個成員。而且，MazF是這個新型“RNA干擾酶”家族的示例。重要的是，在本發明的發現之前，沒有發現MazF的細胞靶標。如這里所顯示的，MazF的作用是高度序列特異的核糖核酸內切酶，它們在ACA位點處切割細胞的mRNA。這種活性可能對細胞內的蛋白質合成產生部分或者全部的抑制。依據四種核苷酸中的任何一種摻入到三個核苷酸位置的每一個位置的可能性是相同的原理，根據標準的計算，ACA序列出現在RNA轉錄產物中的預測頻率是1/64。應當理解，與預測頻率比較，一些RNA轉錄產物中包含較低或者較高頻率的ACA序列。因此，特異RNA轉錄產物或者相關RNA轉錄產物家族被MazF核糖核酸內切酶切割的敏感性取決于ACA序列或者MazF靶序列在轉錄產物中的頻率。而且，本領域內具有普通技術的人員能夠根據RNA轉錄產物的序列預測轉錄產物對于MazF介導的切割的敏感性。
[0208]本發明的
【發明者】還發現PemK是這里被稱為“RNA干擾酶”的新型酶家族的一個成員。如這里所顯示的，PemK的作用是高度序列特異的核糖核酸內切酶，它們在UAX位點處切割細胞的mRNA，其中X是C、A或U。這種活性可能對細胞內的蛋白質合成產生部分或者全部的抑制。依據四種核苷酸中的任何一種摻入到三個核苷酸位置的每一個位置的可能性是相同的原理，根據標準的計算，UAX序列(其中X是C、A或U)出現在RNA轉錄產物中的預測頻率是3/64。應當理解，與預測頻率比較，一些RNA轉錄產物中包含較低或者較高頻率的UAX序列。因此，特異RNA轉錄產物或者相關RNA轉錄產物家族被PemK核糖核酸內切酶切割的敏感性取決于UAX序列(其中X是C、A或者U)或者PemK靶序列在轉錄產物中的頻率。而且，本領域內具有普通技術的人員能夠根據RNA轉錄產物的序列預測轉錄產物對于PemK介導的切割的敏感性。
[0209]因此本發明
【發明者】的新發現提出了 mRNA干擾酶(例如MazF和PemK)的核酸和氨基酸序列及其組合物新的應用。這些應用包括，但是不止限于，如這里描述的各種不同的研究和治療性應用。還提供了包含MazF和PemK核酸和/或氨基酸序列、MazF和/或PemK活性相容緩沖劑以及用法說明材料的試劑盒。
[0210]II1.編碼mRNA干擾酶抑制劑的核酸分子以及mRNA干擾酶抑制劑蛋白質的制備
[0211]編碼MazE和PemI的核酸分子以及MazE和PemI多肽、及其功能性片段基本上按照上面描述的制備編碼MazF和PemK的核酸分子以及MazF和PemK多肽的方法產生。根據本發明，提供了編碼MazE蛋白質、包含SEQ ID NO:5的核酸序列。參見圖21A。還提供了包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及其功能性片段。參見圖21B。相應地提供了編碼PemI蛋白、包含SEQ ID NO:7的核酸序列。參見圖32A。還提供了包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及其功能性片段。參見圖32B。
[0212]IV.編碼mRNA干擾酶抑制劑的核酸以及mRNA干擾酶抑制劑蛋白質的使用
[0213]本發明包括了 SEQ ID NO:5編碼的MazE多肽、編碼包含SEQ ID NO:6的MazE多肽的核酸序列及其功能性片段，以及包含SEQ ID NO:6的MazE多肽及其功能性片段。正如這里描述的，MazE多肽及其功能性片段表現出調節MazF活性的能力。參見實施例1II和下面的總結。
[0214] 簡而言之，正如這里所表明的，純化的(His)6MazE與mazEF啟動子DNA的結合被MazF增強。在MazE N端區域的保守氨基酸殘基定點突變(K7A，R8A，S12A和R16A)破壞了(His) 6MazE和MazE-MazF (His) 6復合物的DNA結合能力，提示MazE通過N端結構域與mazEF啟動子DNA結合。在溶液中，MazE-MazF(His)6復合物中，MazE和MazF (His) 6的比例是大約1:2。由于MazE和MazF(His)6均以同二聚體形式存在,所以預測MazE-MazF(His)6復合物(76.9kDa)是由一個MazE 二聚體和兩個MazF(His)6 二聚體組成的。還使用酵母雙雜交系統研究了 MazE和MazF之間的相互作用。發現MazE的殘基38到75區域對于與MazF的結合是必需的。該區域的定點誘變顯示Leu55和Leu58在MazE-MazF復合物的形成中，而不是在MazE與mazEF啟動子DNA的結合中起重要作用。現在的結果證明MazE由兩個結構域即一個N端DNA結合結構域和一個C端MazF相互作用結構域組成。[0215]因此在一個實施方案中，本發明的MazE多肽和MazE功能性片段抑制了 MazF的活性。在一個特殊方面中，本發明的MazE多肽或MazE功能性片段抑制了 MazF核糖核酸內切酶的活性或者使核糖核酸內切酶的活性降低。的確，MazE及其功能性片段是本發明首先研究的分子，這里證明其能夠實現核糖核酸內切酶活性的降低，因而實現核糖核酸內切酶底物切割的下降。示例性的能夠實現核糖核酸內切酶底物切割下降的MazE功能性片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用結構域。在一個特定的實施方案中，C端MazF相互作用結構域包含MazE的38-75號殘基區域。正如這里描述的，在這一區域發現的關鍵殘基包括Leu55和Leu58。在另一個實施方案中，C端MazF相互作用結構域包含MazE分子的Hp-Box以及其中發現的關鍵殘基。
[0216]在本發明的一個特定方面，MazE的兩個C端肽可以通過化學合成，一個肽是 T54-K77 (24 個氨基酸殘基；TLAELVNDITPENLHENIDWGEPK; SEQ ID NO:9)，另一個是N60-K77(18 個氨基酸殘基；NDITPENLHENIDWGEPK;SEQ ID NO:10)。根據 MazE-MazF 復合物的X射線結構，這些多肽預計與MazF 二聚體形成穩定的抑制復合物。前一個肽含有螺旋2以及C端的酸性尾巴，后一個肽沒有螺旋2。使用合成的30堿基RNA(5’ -UAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAUCAAAUC-3’ ; SEQID NO:11)作為底物，檢查這些肽抑制MazF mRNA干擾酶活性的能力。使用完好的MazE作為對照，比較它們的抑制活性。
[0217]在另一個實施方案中，本發明的MazE多肽和MazE功能性片段增加或者提高MazF的活性。在一個特殊的方面，本發明的MazE多肽或MazE功能性片段提高MazF核糖核酸內切酶的活性或者實現核糖核酸內切酶活性的升高。的確，MazE多肽突變體及其功能性片段是第一個本發明表征 出能夠實現核糖核酸內切酶活性增加并且實現核糖核酸內切酶底物切割增加的分子。示例性的能夠實現核糖核酸內切酶底物切割增加的MazE多肽包括，但是不止限于，在C端MazF相互作用結構域、MazE38到75號殘基、Hp-Box或者Leu55或Leu68(或者其同源位置)包含突變的MazE多肽，其中這樣的突變降低或者抑制了 MazE結合MazF的能力。示例性的能夠實現核糖核酸內切酶底物切割提高的MazE片段包括，但是不止限于，包含突變的MazE片段，所述突變降低或者抑制了 MazE片段結合MazF的能力。這些包含這種突變的MazE片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用結構域或MazE的38_75號殘基區域。已知降低或者抑制MazE片段結合MazF能力的示例性的殘基突變包括在Leu55和Leu58的突變。這種MazE突變體多肽和片段在這里可以被稱為具有顯性失活活性。一般地，顯性失活多肽用于降低或者抑制相應的野生型多肽的活性，因為它們仍然能夠結合并因此競爭底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到了部分削弱。
[0218]本發明還包含了 SEQ ID NO:7編碼的PemI多肽、編碼包含SEQ ID NO:8的PemI多肽的核酸序列以及它們的功能性片段，以及包含SEQ ID NO:8的PemI多肽及其功能性片段。正如這里所描述的，PemI多肽及其功能性片段顯示了調節PemK活性的能力。能夠調節PemI活性以及PemK活性的示例性的PemI功能性片段包括N端DNA結合結構域以及C端PemK相互作用結構域。參見這里下面的實施例1V。
[0219]因此，在一個實施方案中，本發明的PemI多肽和PemI功能性片段抑制了 PemK的活性。在一個特別的方面，本發明的PemI多肽或者PemI功能性片段抑制了 PemK核糖核酸內切酶活性或者實現了核糖核酸內切酶活性的降低。的確，PemI及其功能性片段是本發明首先研究的分子，這里表明其能夠實現核糖核酸內切酶活性的降低，因而實現了核糖核酸內切酶底物切割的降低。
[0220]在另一個實施方案中，涉及了能夠抑制PemI活性的突變形式的PemI多肽或者其衍生物或者其片段。這種PemI突變體多肽以及片段可以在這里被稱為具有顯性失活活性。一般地，顯性失活多肽用于降低或者抑制相應的野生型多肽的活性，因為它們仍然能夠結合并因此競爭底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到部分削弱。由于PemI通常與PemK結合，因此抑制了其毒性作用，阻止PemI介導的對PemK的抑制可以將PemK從這個負調控中釋放出來。因此，抑制PemI活性導致PemK活性的增加。
[0221]C.鑒定能夠調節MazF活性的化合物的一般方法
[0222]大腸桿菌染色體MazE/MazF上癮組件的結構被確定到1.7埃的分辨率(Kamadaet al.,Mol Cellll, 875-884(2003))。正如這里所描述的，上癮組件由控制細菌細胞死亡的穩定的毒素和不穩定的解毒劑蛋白組成。MazE(解毒劑)和MazF(毒素)形成一個線形的異六聚體，由毒素和解毒劑同二聚體交替組成(MazF2_MazE2_MazF2)。Kamada et al.表明MazE同二聚體含有一個β桶，從β桶延伸出兩個C端，與兩側的MazF同二聚體相互作用。這種相互作用與質粒編碼的毒素CcdB和Kid之間的相互作用相似。MazE/MazF異六聚體結構證明了染色體和質粒攜帶的上癮組件具有共同的解毒劑-毒素識別機制，對毒素作用、在沒有毒素時解毒劑的降解以及解毒劑/毒素復合物與啟動子DNA的結合提供了一般的分子認識。
[0223]根據這里提出的信息，MazE中適宜的肽靶標包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區域。MazE中適宜的肽靶標包括N-box，MazE中高度保守的N端區域(它從殘基7到殘基18，介導與DNA結合)，以及其中的關鍵殘基。MazE的N_box中的關鍵殘基包括K7A, R8A, S12A和R16A，這些殘基的突變破壞了 MazE和MazE-MazF復合物的DNA結合能力。MazE中從殘基53到64的保 守C端區域Hp-Box，富含疏水殘基，也是適宜的用于基于肽的治療法的祀標。Hp-box區域參與了 MazE和MazF之間看起來最穩定的界面。Ηρ-box中疏水氨基酸殘基的側鏈(Leu55，Leu58, Val59和Ile62)與MazF同二聚體中的一簇疏水殘基相互作用。
[0224]根據這里提出的信息，MazF中適宜的肽靶標包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區域。MazF中適宜的肽靶標包括R29S, N40D, T52K, Q77H, R86G, I110N, E24A和K79A殘基以及包含這些關鍵殘基的小肽(例如包含這些殘基以及其側翼殘基的5-10個殘基的肽)。
[0225]在本發明的一個實施方案中，2:4MazE/MazF復合物及其結構組分的晶體結構(Kamada et al.,同上)，以及在MazE和MazF之間發現的界面,被作為祀標,在一個虛擬的配基篩選步驟中，通過計算機對駁方法，從一個龐大的化合物文庫中鑒定出能夠以高度親和性結合靶位點的候選化合物。
[0226]在另一個實施方案中,MazE/MazF復合物(Kamada et al.,同上)及其組分的結構信息以及在MazE和MazF之間發現的界面,被用于設計化合物,這些化合物預計與MazF和/或MazE/MazF的界面結合，并檢測這些化合物是否具有高的親和結合性。
[0227]在特定的實施方案中，選擇對MazF與RNA的結合有調節作用的候選化合物和“設計的化合物”。這些化合物可以提高或者抑制MazF與RNA的結合。這種化合物可以實現底物(即RNA)切割的增加或者減少。然后對來源于任意一種方法并在對駁步驟中評分最高的化合物進行基于細胞的和無細胞的試驗(在下面描述)，以確定其調節MazF活性的效力。
[0228]然后將任何在生物試驗中顯示效力的化合物與MazF共結晶，以發現結合位點。在本發明的另一個實施方案中，能夠結合MazF的候選化合物被本領域內已知的方法修飾，進一步提高特異性質，例如提高效力和/或特異性和/或可溶性。選出的顯示最合需要性質的化合物被指定為先導化合物，在例如具有過度增生性疾病的動物模型中進一步檢測其效力。
[0229]D.鑒定能夠調節PemK活性的化合物的一般方法
[0230]根據這里提出的信息，PemI中適宜的肽靶標包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區域。PemI中適宜的肽靶標包括在PemI多肽家族的成員中保守的區域。
[0231 ] 根據這里提出的信息，PemK中適宜的肽靶標包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區域。在β鏈SI和S2之間的保守環(命名為S1-S2環)以及其中的殘基是適宜的肽靶標。參見圖33和34獲得保守區域的氨基酸序列比對以及其中的氨基酸序列。
[0232]在本發明的一個實施方案中，2:4MazE/MazF復合物及其結構組分的晶體結構(Kamada et al.,同上)，以及在MazE和MazF之間發現的界面,可以用于檢查Peml/PemK復合物。因此，這些推斷可以在一個虛擬的配基篩選步驟中，通過計算機對駁方法，從一個龐大的化合物文庫中鑒定出能夠以高度親和性結合靶位點的候選化合物。
[0233]在另一個實施方案中，MazE/MazF復合物(Kamada et al.,同上)及其組分的結構信息以及在MazE和MazF之間發現的界面,可以用于檢查Peml/PemK復合物。因此,這些推斷可以用于設計化合物，這些化合物預計與PemK和/或Peml/PemK界面結合,并檢測這些化合物是否具有高的 親和結合性。
[0234]在特定的實施方案中，選擇對PemK與RNA的結合有調節作用的候選化合物和“設計的化合物”。這些化合物可以提高或者抑制PemK與RNA的結合。這種化合物可以實現底物(即RNA)切割的增加或者減少。然后對來源于任意一種方法并且在對駁步驟中評分最高的化合物進行基于細胞的和無細胞的試驗(在下面描述)，以確定其調節PemK活性的效力。
[0235]然后可將任何在生物試驗中顯示效力的化合物與PemK共結晶，以鑒定結合位點。在本發明的另一個實施方案中，能夠結合PemK的候選化合物被本領域內已知的方法修飾，進一步提高特異性質，例如提高效力和/或特異性和/或可溶性。選出的顯示最合需要性質的化合物被指定為先導化合物，在例如具有過度增生性疾病的動物模型中進一步檢測其效力。
[0236]通過彈性對駁技術(Flexible Docking Technology)進行的虛擬配基篩選
[0237]目前的對駁和篩選方法可以使用一個特異的蛋白質結構從大的化合物文庫中選擇少量可能的先導候選配基。這種方法在例如Abagyan和Totrov (2001) Current OpinionChemical Biology5:375-382中有所描述，這里將其全部引用作為參考。
[0238]基于高通量彈性對駁的虛擬配基篩選(VLS)在設計和鑒定能夠與某個特定蛋白結構結合的化合物時是有用的。VLS可以用于虛擬地從大量化學分子中取樣而不需要合成和在實驗中檢測每一個化學分子。一般地，該方法從多肽建模開始，它使用通過常規方式例如X射線晶體衍射、NMR、同源建模選擇的蛋白質結構。然后使用任何一種現有的對駁程序，例如 MCDOCK (Liu et al.(1999) J.Comput.Aided Mol.Des.13:435-451), SEED(Majeux et al.(1999) Proteins37:88-105;DARWIN (Tayloret al.(2000)Proteins41:173-191;MM(David et al.(2001)J.Comput.Aided Mo 1.Des.15:157-171，將一組化合物和/或分子片段對駁到選擇的結合位點中。將化合物按照配基評分，產生一系列預計具有最高結合親和性的候選化合物，用于在體外和體內進一步檢測和/或化學修飾。
[0239]在VLS的一種方法中，在化學制備之前，將分子“建造”到選擇的結合口袋中。設計了大量的程序用于一個原子接著一個原子“生長”配基[參見例如GENSTAR (Pearlman et al.L(1993)J.Comput.Chem.14:1184)，LEGEND (Nishibataet al.(1993)J.Med.Chem.36:2921-2928),MCDNLG(Rotstein et al.(1993)J.Comput-Aided Mol.Des.7:23-43),CONCEPTS(Gehlhaar et al.(1995)J.Med.Chem38:466-472]或者一個片段接著一個片段“生長”配基[參見例如GROUPBUILD(Rotsein et al.(1993)J.Med.Chem.36:1700-1710)，SPROUT(GiIlet etal.(1993) J.Comput.Aided Mol.Des.7:127-153)，LUDI (Bohm (1992) J.Comput.AidedMol.Des.6:61-78)，BUILDER (Roe (1995) J.Comput.Aided Mol.Des.9:269-282)，和SMOG(Deffitte et al.(1996)J.Am.Chem.Soc.118:11733-11744]?
[0240]對于一個特定蛋白的配基的評分方法是已知的，其可以將少量的能夠結合蛋白質結構的分子與大量的非結合物區別開來。參見，例如，Agagyan et al.(2001)同上，關于通過虛擬配基對駁和篩選方法鑒定出的大量成功配基的報告。
[0241]例如，Nishibataet al.(1993) J.Med.Chem36:2921-2928 描述了一個結構構建程序根據一個分子(二氫葉酸還原酶)活性位點的三維結構產生抑制性分子的能力。該程序能夠預測具有與四個已知的酶抑制 劑相似結構的分子，提供有力的支持，即為使用靶三維結構的知識獲得新型先導化合物提供了有力支持。類似地，Gillet et al.(1993) J.ComputerAided Mol.Design7:127-153描述了通過基于空間限制的人工智能技術(SPROUT)產生的結構。
[0242]通過本發明的篩選方法鑒定的因子
[0243]本發明提供了鑒定以高度親和性與mRNA干擾酶(例如MazF或PemK)或mRNA干擾酶抑制劑(例如MazE或PemI)結合的因子(例如候選化合物或者測試化合物)的方法。通過本發明的方法鑒定出的因子可以作為抗過度增生性疾病和抗細菌治療方法的候選因子。
[0244]因子、候選化合物或者測試化合物的示例包括,但是不止限于，核酸(例如DNA和RNA)、糖、脂、蛋白質、肽、肽模擬物、小分子以及其他藥物。可以使用本領域內已知的組合庫中多種方法中的任何一種方法得到因子，包括:生物文庫，空間可定位平行固相或者液相文庫；需要進行反卷積的合成文庫方法；“一珠一化合物(one-head one-compound)”文庫方法；以及使用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫方法限于肽文庫，而其他四種方法可以用于肽、非肽寡聚物或者小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145;美國專利編號5，738，996;和美國專利編號5，807，683，在這里分別以其整體引用作為參考)
[0245]合成分子文庫的方法的示例可以在本領域內找到，例如在DeWitt etal.(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6909 ; Erb et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:11422;Zuckermann et al.(1994) J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science261:1303;CarrelI et al.(1994)Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2059;Carellet al.(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2061;以及 Gallop et al.(1994) J.Med.Chem.37:1233中，每一個文獻在這里以其整體引用作為參考。
[0246]化合物文庫可以存在于例如溶液中(例如Houghten (1992) Bio/Techniquesl3:412-421 )，或存在于珠上(Lam(1991) Nature354:82-84)、存在于芯片上(Fodor (1993) Nature364:555-556)、存在于細菌中(美國專利編號 5，223，409)、存在于孢子中(美國專利編號5，571，698;5，403，484;和5，223，409)、存在于質粒中(Cullet al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1865-1869)或者存在于噬菌體中(Scottand Smith(19900Science 249:386-390;Devlin (1990)Science249:404-406;Cwirlaet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87: 6378-6382 ; and Felici (1991) J.Mol.Biol.222:301-310)，每一個文獻在這里以其整體引用作為參考。
[0247]篩選試驗
[0248]通過上面描述的虛擬配基對駁和篩選方法鑒定的小分子，進一步進行體外和體內試驗。在一個實施方案中，通過基于細胞的檢測系統鑒定出與mRNA干擾酶(例如MazF或PemK)或者mRNA干擾酶抑制劑如MazE或PemI相互作用(即結合)的因子。為了清楚和簡潔的目的，使用MazF和MazF片段描述這些檢測的剩余部分，但是應當理解這些檢測/方法還可以應用于其他的mRNA干擾酶及其片段，例如MazE和MazE片段，PemK和PemK片段，以及PemI和PemI片段。
[0249]根據該實施方案，表達MazF或者其功能性片段的細胞與候選化合物或者對照化合物接觸，測定候選化合物與MazF相互作用的能力。如果需要，可以用這種檢測來篩選多個(例如一個文庫)的候選化合物。細胞可以是原核來源的(例如大腸桿菌)或者真核來源的(例如酵母或者哺乳動物)。而且，細胞可以內源表達MazF或者其片段，或者經過基因工程改造表達MazF或者其片段。在某些情況中，MazF或者MazF片段被標記，例如使用放射性標記(例如32P，35S或者1251)，或者使用熒光標記(例如異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅素、藻藍素、別藻藍素、鄰苯二醛或者熒光胺)，使得MazF和候選化合物之間的相互作用能夠被檢測到。候選化合物與MazF的相互作用使用本領域內技術人員已知的方法進行測定。例如候選化合物與MazF的相互作用可以使用細胞流式儀、閃爍檢測法、免疫沉淀或者Western印跡分析。
[0250]在另一個實施方案中，使用無細胞的檢測系統，鑒定與MazF或者其相關片段相互作用(即結合)的因子。根據該實施方案，天然或者重組的MazF或者其片段與候選化合物或者對照化合物接觸，測定候選化合物與MazF相互作用的能力。如果需要，可以用這種檢測來篩選多個(例如一個文庫)候選化合物。在一個實施方案中，首先將MazF或者其片段固定化(通過例如與特異識別并且結合MazF或者其片段的固定化抗體接觸，或者通過使純化的MazF或者其片段的制備物與一個設計用于結合蛋白的表面接觸)。MazF或者其片段可以部分或者完全純化(即部分或者完全沒有其他多肽)或者是細胞裂解物。此外，MazF或者其片段可以是融合蛋白，該融合蛋白包含MazF或者其生物活性部分以及結構域例如谷胱甘肽-S-轉移酶。或者MazF或其生物活性部分可以使用本領域內技術人員眾所周知的方法進行生物素化(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals;Rockford, IL)。候選化合物結合MazF的能力使用本領域內技術人員已知的方法進行測定。
[0251] 在另一個實施方案中，在動物模型中鑒定調節MazF活性的因子。適宜動物的示例包括，但是不止限于，小鼠、大鼠、兔、猴子、豚鼠、狗以及貓。優選地，使用的動物代表過度增生性疾病的模型。根據該實施方案，向適宜的動物給服待測化合物或者對照化合物(例如口月艮、直腸給藥、非腸道給藥例如腹膜內或者靜脈內)，測定對活性水平的效果。
[0252]E.能夠結合mRNA干擾酶的因子或者mRNA干擾酶抑制劑的治療性用途
[0253]本發明提供了通過給予使用以上描述的方法鑒定的治療性化合物，治療過度增生性疾病。這種化合物包括，但是不止限于，蛋白質、肽、蛋白質或肽的衍生物或者類似物、抗體、核酸和小分子。
[0254]本發明提供了治療受到過渡增殖疾病困擾的患者的方法，該方法包括向受試對象施用有效量的通過本發明的方法鑒定的化合物。在一個優選的方面，化合物是基本純化的(例如基本沒有限制該化合物的作用或者產生不希望的副作用的物質)。受試對象優選是動物，包括但是不止限于，奶牛、豬、馬、雞、貓、狗等等，優選是哺乳動物，最優選是人。在一個特定的實施方案中，非人的哺乳動物是受試對象。
[0255]當化合物包含核酸時可以使用的制劑和給藥方法如上面所描述；其他適當的制劑和給藥途徑在下面描述。
[0256]已知各種不同的遞送系統可以用于施用本發明的化合物，例如包裹在脂質體、微粒、微膠囊中，能夠表達化合物的重組細胞，受體介導的細胞內吞作用(參見例如Wu andWu (1987) J.Biol.Chem.262:4429-4432)，以及將核酸構建為逆轉錄病毒或者其他載體的一部分。導入方法可以是腸內或者腸胃外的途徑，包括但是不止限于，皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。化合物可以通過任何方便的途徑進行施用，例如灌注或者彈丸式注射，通過經上皮或者粘膜層(例如口腔粘膜、直腸粘膜和小腸粘膜等)的吸收，也可以與其他的生物 活性因子一同施用的。給藥可以是全身或者局部的。此外，可能需要將本發明的藥物組合物通過任何適宜的途徑引入中樞神經系統中，包括心室內和鞘內注射；可以通過例如與一個貯器Gn0_aya貯器)相連的心室內導管幫助心室內注射。也可以使用肺部給藥，例如通過使用吸入器或者霧化器，和具有氣溶膠化試劑的制劑。
[0257]在一個特定的實施方案中，可能需要將本發明的藥物組合物局部給藥，例如通過在手術中的局部灌注，局部應用，例如通過注射，借助于導管，借助于移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或者明膠狀的材料，包括膜如sialastic膜，或者纖維)。在一個實施方案中，給藥可以通過直接注射到CSF中或者在腫瘤部位(例如，在CNS組織中)。
[0258]在另一個實施方案中，可以用載體，特別是脂質體遞送化合物(參見Langer(1990)Science249:1527-1533;Treat 等人,Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (eds.)，Liss, New York, pp.353-365(1989) ; Lopez-Berestein,同上，pp.317-327;參見一般的，同上)
[0259]在另一個實施方案中，化合物可以在受控釋放系統中遞送。在一個實施方案中，可以使用泵(參見 Langer,見前;Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201; Buchwald等人(1980)Surgery88:507;Saudek 等人，1989，N.Engl.J.Med.321:574)。在另一個實施方案中，可以使用聚合物材料(參見Medical Applications of ControlledRelease, Langer 和 Wise(eds.)，CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974);ControlledDrug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen 和Ball (eds.), Wiley, New York (1984) ; Ranger 和 Peppas, J.，1983，Macromol.Sc1.Rev.Macromol.Chem.23:61;還參見 Levy 等人(1985) Science228:190; During 等人(1989)Ann.Neurol.25:351; Howard 等人(1989) J.Neurosurg.71:105)。在另一個實施方案中，可以將受控釋放系統置于治療靶(即靶組織或者腫瘤)附近，這樣需要的劑量只是全身劑量的一部分(參見例如 Goodson, Medical Applications of ControlledRelease,見前，vol.2，pp.115-138 (1984))。其他的受控釋放系統在Langer的綜述(1990，Science249:1527-1533)中有討論。
[0260]F.藥物組合物
[0261]本發明還提供了藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的因子以及藥物上可以接受的載體。在一個特殊的實施方案中，術語“藥物上可以接受的”意思是由聯邦或者州政府的管理機構批準或者在美國藥典或者其他一般承認的藥典中列出用于動物，更為特別地用于人類。術語“載體”指的是與治療藥物一同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者載體(Vehide)0這些藥物載體可以是無菌的液體,例如水或者油,包括石油、動物油、植物油或者合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當藥物組合物通過靜脈內施用時，水是優選的載體。鹽溶液和含水的葡萄糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對于注射用的溶液。[0262]適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉，干的脫脂奶、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。如果需要的話，組合物還可以含有少量的潤濕劑或者乳化劑或者PH緩沖劑。這些組合物的形式可以是溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等等。組合物還可以配制為栓劑，帶有傳統的粘合劑和載體如三甘油酯。口服制劑可以包括標準的載體，例如藥物級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。適宜的藥物載體的示例在 E.ff.Martin 的"Remington’s PharmaceuticalSciences^ 中有所描述，在這里以其整體引用作為參考。這些組合物含有藥物有效量的組合物，優選以純化的形式，以及適宜量的載體，以提供用于向受試對象正確給藥的形式。制劑應當適合于給藥的方式。
[0263]在一個優選的實施方案中，組合物根據常規的步驟配制為適于向人進行靜脈注射的藥物組合物。通常用于靜脈給藥的組合物是在無菌等滲含水緩沖劑中的溶液。在必要的時候，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因以緩解注射部位的疼痛。一般的，這些成分分開供應或者混合在一起以單位劑量形式供應，例如以密封在標明活性因子量的氣密型容器(如安瓿或者小藥囊(sachette))的干燥凍干粉末或者無水濃縮物的形式。如果組合物通過灌注給藥時，可以使用含有無菌的藥物級別的水或者鹽水的輸液瓶進行配藥。如果組合物通過注射給藥時，可以提供一安瓿的注射用無菌水或者鹽水，以使成分可在給藥前混合。
[0264]本發明的化合物可以配制成中性或者鹽的形式。藥物上可以接受的鹽包括那些由游離氨基基團形成的鹽，例如鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽等等，以及那些由游離羧基基團形成的鹽，其例如為源自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺，2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的鹽。
[0265]可以通過基于本描述的標準臨床技術確定對于治療過度增生性疾病(例如癌癥)有效的本發明化合物的量。此外，還可以可選地進行體外測定，幫助確定最佳的劑量范圍。在制劑中使用的精確劑量還取決于給藥途徑以及疾病或者病癥的嚴重程度，應該根據醫師的判斷以及每一個受試對象的情況確定。但是，用于靜脈內給藥的適宜劑量范圍一般是每千克體重大約20 - 500微克的活性化合物。用于鼻內給藥的適宜劑量范圍一般是每千克體重大約0.01皮克一 I毫克。栓劑含有的活性成分的范圍一般是0.5重量％-10重量％ ；口服制劑優選地含有10%-95%的活性成分。可以根據來自體外或者動物模型測試系統的劑量一響應曲線外推出有效的劑量。
[0266]核酸
[0267]本發明提供了鑒定能夠結合mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)的因子以實現mRNA干擾酶的核糖核酸內切酶活性增加的方法。因此,本發明包括施用核酸,該核酸編碼mRNA干擾酶或者其直向同源物的肽或蛋白質激活劑，以及能夠干擾mRNA干擾酶(例如MazE或PemI)或者其直向同源物的內源抑制劑表達的反義序列或者催化性RNA。
[0268]在一個實施方案中，所施用的核酸包含的序列編碼能夠競爭結合mRNA干擾酶的肽或者蛋白質。本領域內可利用的任何用于施用核酸序列的適宜方法都可以根據本發明進行使用。
[0269]施用和表達核酸序列的方法在基因治療領域中一般是已知的。對于基因治療方法的一般性綜述，參見 Goldspiel et al.(1993)Clinical Pharmacy 12:488-505;Wuand Wu(1991)Biotherapy3:87-95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan(1993)Science260:926-932;以及 Morgan and Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62:191-217; May (1993) TIBTECH11 (5):155-215.重組 DNA 【技術領域】中通 常已知的、可以用于本發明的方法在Ausubel et al.(eds.), 1993, Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, NY ；和 Kriegler(1990)Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY,中予以描述。
[0270]在一個特殊方面，化合物包含的核酸編碼能夠結合mRNA干擾酶以實現mRNA干擾酶核糖核酸內切酶活性增加的肽或者蛋白質，這種核酸是在適宜的宿主中表達肽或者蛋白質的表達載體的一部分。特別地，這種核酸具有與編碼區域有效連接的啟動子，所述的啟動子是可誘導的或者是組成型的(以及選擇性地，組織特異的)。在另一個特別的實施方案中，使用了核酸分子，其中的編碼序列和任何其他所需的序列被促進在染色體中的所需位點處發生同源重組的區域包圍，這樣提供了核酸的染色體內表達(Koller和Smithies (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935;Zijlstra et al.(1989)Nature342:435-438)。
[0271]可以直接將核酸遞送到受試對象的體內，這時受試對象與核酸或者攜帶核酸的載體直接接觸，這種方式被稱為體內基因治療。可選擇地，核酸遞送到受試對象的體內是間接的，這時首先在體外用核酸轉化細胞，然后將細胞移植到受試對象體內，這被稱為“離體基因治療”。
[0272]在另一個實施方案中，核酸在體內直接施用，在體內其表達產生編碼的產物。這可以通過本領域內已知的多種方法中的任何一種來實現，例如通過將核酸構建為適當的核酸表達載體的一部分并施用之，這樣核酸就成為細胞內的，例如通過使用缺陷的或者減毒的逆轉錄病毒或者其他病毒載體感染(參見美國專利號4，980，286);通過使用裸露的DNA直接感染；通過使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic, Dupont);通過使用脂類、細胞表面受體或者轉染劑包被；通過使用脂質體、微粒或者微膠囊包裹；通過將核酸連接在已知進入到細胞核內的肽上；或者將核酸與配基連接，該配基會經歷受體介導的內吞作用(參見例如Wu和Wu, 1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)，這可以用于靶向特異表達該受體的細胞類型。
[0273]在另一個實施方案中，可以形成核酸一配基復合物，其中的配基包含融合病毒肽，以破壞內體，使核酸避免被溶酶體降解。在另一個實施方案中，可以通過靶向一個特異的受體，在體內使得核酸能夠達到細胞特異的攝取和表達(參見例如PCT出版物W092/06180，1992-4-16 (ffu et al.) ;W092/22635,1992-12-23(Wilson et al.) ;W092/20316,
1992-11-26(Findeiset al.) ;W093/14188,1993-7-22(Clarke et al.), W093/20221,
1993-10-14(Young))。可選擇地，將核酸引入細胞內，通過同源重組整合在宿主細胞DNA中以用于表達(Koller 和 Smithies, 1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935; Zi jlstraet al.(1989)Nature342:435-438)。
[0274]在另一個實施方案中，可以使用逆轉錄病毒載體(參見Miller etal.(1993)Meth.Enzymol.217:581-599)。已經對這些逆轉錄病毒載體進行了修飾，刪除了病毒基因組包裝和整合進入宿主細胞DNA中不必需的逆轉錄病毒序列。編碼將要在基因治療中使用的mRNA干擾酶的核酸被克隆到載體中，這有利于將基因遞送到受試對象中。關于逆轉錄病毒載體的更多細節可以在Boesen et al.(1994)Biotherapy6:291_302中找到，它描述了使用逆轉錄病毒載體將mdrl基因遞送到造血干細胞中，目的是使干細胞對化療更有抵抗力。闡釋逆轉錄病毒載體在基因治療中的用途的其他參考文獻有Clowes et al.(1994) J.Clin.1nvest.93:644-651;Kiem et al.(1994)Blood83:1467-1473;Salmons 和 Gunzberg(1993)Human Gene Therapy4: 129-141;以及 Grossman 和 Wilson (1993) Curr.0pin.1n Geneticsand Devel.3:110-114。
[0275]還可以在基因治療中有效地使用腺病毒。腺病毒在將基因遞送到呼吸道上皮方面是有特別有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮并導致輕度疾病。基于腺病毒的遞送系統的其他靶標有肝臟、中樞神經系統，上皮細胞和肌肉。腺病毒的優點是能夠感染非分裂細胞。Kozarsky 和 Wilson(1993)Current Opinion in Genetics andDevelopment3:499_503 綜述了基于腺病毒的基因治療。Bout et al.(1994)Human GeneTherapy5:3-10證明了腺病毒載體對于將基因轉移到恒河猴的呼吸道上皮中的用途。在基因治療中使用腺病毒的其他實例可以在以下文獻中找到:Rosenfeld et al.(1991)Science252:431-434;Rosenfeld et al.(1992)Ce1168:143-155;MastrangeIi etal.(1993) J.Clin.1nvest.91:225-234;PCT 出版物 W094/12649;和 Wang, et al.(1995)Gene Therapy2:775-783。已經有人建議將腺伴隨病毒(AAV)用于基因治療(Walsh etal.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300;美國專利號 5，436，146)。
[0276]另一個基因治療的適宜方式包含通過諸如電穿孔、脂轉染、磷酸鈣介導的轉染或者病毒感染的方法將轉移到組織培養的細胞中。通常，轉移的方法包括將選擇標記轉移到細胞中。然后將細胞置于選擇壓力下，以分離那些攝取并表達了轉移的基因的細胞。然后將那些細胞遞送到受試對象中。
[0277]在該實施方案中，將核酸引入到細胞中，然后將得到的重組細胞進行體內施用。這種核酸的引入可以通過本領域內任何已知的方法進行，包括但是不止限于，轉染、電穿孔、微注射、使用含有核酸序列的病毒或者噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、原生質球融合等等。對于將外源基因引入細胞中，在本領域內已知有許多技術(參見例如 Loeffler 和 Behr (1993) Meth.Enzymol.217:599-618; Cohen etal.(1993)Meth.Enzymol.217:618-644;Cline(1985)Pharmac.Ther.29:69-92)，它們可以根據本發明使用，條件是受體細胞必需的發育和生理功能不受到破壞。該技術應該將核酸穩定轉移至細胞中，這樣核酸可以被細胞表達，優選地，可被該細胞的后代繼承和表達。
[0278]可以通過本領域內已知的各種不同方法將產生的重組細胞遞送到受試對象中。在一個優選的實施方案中，例如通過皮下注射上皮細胞。在另一個實施方案中，將重組皮膚細胞作為皮膚移植物施加到受試對象上；重組血細胞(例如造血干細胞或者始祖細胞)優選地通過靜脈內施用。預計使用的細胞量取決于所需的作用、受試對象的狀況等等，并且可以由本領域的技術人員確定。
[0279]可以將核酸引入以用于基因治療的細胞包括任何所需的，可獲得的細胞類型，包括但是不止限于神經元細胞、神經膠質細胞(例如少突膠質細胞、星形膠質細胞)、上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜曙紅粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種不同的干細胞或者始祖細胞，特 別是造血干細胞或者始祖細胞，例如從骨髓、臍帶血、外周血或者胎兒肝臟中獲得的那些。在一個優選的實施方案中，用于基因治療的細胞是接受治療的受試對象的自體細胞。
[0280]在另一個實施方案中，將要引入以用于基因治療的核酸可以包含與編碼區域有效連接的可誘導啟動子，使得核酸的表達可以通過調整適當的轉錄誘導物的濃度來控制。
[0281 ] 直接注射編碼能夠結合mRNA干擾酶的肽或蛋白質的DNA或者能夠干擾mRNA干擾酶(例如，MazE或PemI，或其直向同源物)的內源抑制劑表達的因子，可以根據例如美國專利號5，589, 466中描述的技術進行。這些技術包括注射“裸露的DNA”,即除了適宜的載體以外沒有脂質體、細胞或者任何其他材料的分離的DNA分子。注射編碼蛋白質并與適宜的啟動子有效連接的DNA，使該蛋白質在鄰近注射部位的細胞中產生。
[0282]G.試劑盒
[0283]本發明還提供了藥物包或者試劑盒,該藥物包或者試劑盒包含一個或者多個容器，容器中裝有本發明藥物組合物的一種或者多種成分。這種容器可選地附帶的可以是管理藥物或者生物制品的生產、使用或者銷售的政府機構規定的通告，通告上表明(a)經過生產、使用和銷售的機構批準，用于人體施用，(b)使用說明，或兩者。
[0284]提出以下的實施例，為本領域內具有普通技術的人員提供關于如何制備和使用本發明的檢測、篩選以及治療方法的完整的公開和描述，并不是要限制
【發明者】所認為的他們的發明的范圍。已經投入力量確保所用數目(例如量，溫度等等)的準確性，但是應當解釋一些實驗錯誤和偏差出現的原因。除非有其他說明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，壓力為大氣壓或者接近大氣壓。
[0285]提供以下的實驗方案，以有助于本發明的實施。
[0286]實施例1
[0287]正如這里描述的，使用甲苯處理使大腸桿菌細胞通透化，并將這些細胞用于證明MazF抑制翻譯，但是對RNA合成或者DNA復制沒有抑制。而且顯示出，MazF在ACA序列的A和C殘基之間以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA。因此，本發明證明了 MazF通過在特異位點切割mRNA而干擾mRNA的功能。因此，本發明的
【發明者】發現MazF是新型的核糖核酸內切酶，在這里將其命名為“mRNA干擾酶”。
[0288]材料和方法
[0289]菌株和質粒。使用了大腸桿菌BL21(DE3)、BW25113 (Datsenko 和 Wanner, ProcNatl Acad Sci U S A97, 6640-5(2000))和 MRE600(Swaney et al., Antimicrob AgentsChemother42, 3251-5 (1998))。從質粒 pET_21cc (Novagen)構建質粒 pET-21cc_MazEF,其被修飾成在T7啟動子的控制下表達MazE和MazF(His)6。但是Shine-Dalgarno (SD)序列來自 mazEF 操縱子。使用 pET_28a (Novagen)構建質粒 pET-28a_MazE,以表達(His)6MazE。使用 pBAD (Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))構建 pBAD-MazF，以在加入 0.2%阿拉伯糖后嚴謹地調控mazF的表達。
[0290]甲苯處理的細胞中的蛋白質、DNA和RNA合成的檢測。50毫升含有質粒pBAD_MazF的大腸桿菌BW25113培養物在甘油-M9培養基中于37攝氏度生長。當培養物的0D_達到0.6時，加入阿拉伯糖使終濃度為0.2%。于37攝氏度孵育10分鐘后，用1%甲苯處理細胞(Halegoua et al., Eur J Biochem69, 163-7 (1976))。根據以前的描述使用 35S-甲硫氨酸進行蛋白質合成(Halegoua et al., J Bacterioll26, 183-91 (1976))。甲苯處理的細胞在室溫下用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.4)洗一次，然后重懸于同一緩沖液中，以根據以前的描述用[a-32P] dTTP 檢查 DNA 的合成(Moses 和 Richardson, Proc Natl Acad SciUSA67, 674-81 (1970))。對于RNA合成的檢測，甲苯處理的細胞在室溫下用0.05M Tris-HCl緩沖液(PH7.5)洗一次，然后重懸于同一緩沖液中，以根據以前的描述測量[a-32P]UTP向RNA 中的慘入(Peterson et al., J Bacterioll07, 585-8 (1971))。
[0291 ] 體內蛋白質合成的檢測。含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細胞生長在甘油_M9培養基中。當培養物的 0D_達到0.6時，將其分成兩等份。其中一份中加入阿拉伯糖至終濃度為0.2%，第二份中加入水。以在圖2D中所示的不同時間間隔，取出I毫升的培養物至含有2 μ Ci35S-甲硫氨酸的試管中，混合物在37攝氏度孵育I分鐘。然后將50微升反應混合物施加于一個濾紙盤(Whatman3mm, 2.3厘米直徑)上。根據以前的描述(Hirashima和Inouye, Nature242, 405-7(1973))用5%TCA溶液處理濾紙，并用液閃計數器定量測定放射性。剩余的500微升反應混合物加入到含有25微升100%TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的冷卻的試管中。混合物在冰浴上孵育60分鐘。離心后收集沉淀，通過將混合物在沸水浴中孵育30分鐘而溶解在50微升的SDS-PAGE上樣緩沖液中。除去不溶的物質以后，將上清液(10微升)通過SDS-PAGE進行分析。
[0292]MazF (His)6 和(His) 6MazE 蛋白的純化。從攜帶 pET-21cc_MazEF 的菌株BL21 (DE3)中純化C末端標記的MazF(His)6。首先用N1-NTA樹脂純化MazF(His)6和MazE復合物。用6M鹽酸胍將MazE從MazF (His) 6上解離下來以后，在N1-NTA樹脂上重新純化，并通過逐步透析而使蛋白質重折疊。從攜帶pET-28a-MazE的菌株BL21 (DE3)中純化N端標記的(His) 6MazE。
[0293]MazF對于原核和真核無細胞系統中蛋白質合成的影響。
[0294]使用大腸桿菌T7S30提取物系統(Promega)進行原核無細胞蛋白質合成。反應混合物由10微升S30預混合物、7.5微升S30提取物和2.5微升的氨基酸混合物(除甲硫氨酸以外，每種氨基酸ImM)。I微升35S-甲硫氨酸、以及不同量的MazF(His)f^P (His)6MazE組成，終體積為24微升。反應混合物在37攝氏度孵育10分鐘，通過加入I微升pET-1 Ia-MazG質粒-DNA (0.16 微克 /微升)開始檢測(Zhang和 Inouye, J Bacteriol 184，5323-9 (2002))。反應在37攝氏度進行I小時，用丙酮沉淀蛋白，并通過SDS-PAGE進行分析。使用用于PCRDNA兔網織紅細胞裂解物系統TNT?T7Quick(Promega)進行真核無細胞蛋白質合成。使用編碼人蛋白并在T7啟動子控制下的DNA片段作為mRNA轉錄的模板。反應在37攝氏度進行I小時，用丙酮沉淀蛋白，并通過SDS-PAGE進行分析。
[0295]多核糖體分布圖。含有pBAD-MazF質粒的大腸桿菌BW25113的過夜培養物用新鮮的甘油-M9培養基稀釋50倍。37攝氏度孵育5小時后，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2%。誘導MazFlO分鐘后加入氯霉素至終濃度為100微克/毫升。離心收集細胞沉淀，重懸于含有 10mMMgCl2、60mM NH4ClUmM DTT 和 I 毫克 / 毫升溶菌酶的 I 毫升 IOmMTris-HCl (pH7.8)中。液氮凍融兩次后，在Beckman TLA100.3轉子中以24000rpm將裂解物離心20分鐘。上清液(300微升)加入到5-40%蔗糖梯度中以獲得多核糖體分布圖。不加阿拉伯糖進行相似的實驗。通過OD28tl檢查核糖體圖譜(pattern),梯度從左(40%)到右(5%)。所指示處加入春日霉素至終濃度為500微克/毫 升。
[0296]大腸桿菌70S核糖體的制備。根據以前的描述(Aoki et al., Antimicrob AgentsChemother46, 1080-5(2002);Du 和 Babitzke, J Biol Chem273, 20494-503(1998);Hesterkamp et al., J Biol Chem272, 21865-71 (1997))從大腸桿菌 MRE600 中制備 70S 核糖體，有少量改動。細菌細胞(2克)懸浮于緩沖液A[10mM Tris-HCl (pH7.4)，含有IOmM MgCl2, 60mMNH4Cl和6mM2-巰基乙醇]中。用弗氏壓碎器裂解細胞。與無RNA酶的DNA酶孵育(O攝氏度30分鐘)之后，在Beckman50Ti轉子中以30000rpm于4攝氏度離心30分鐘兩次以去除細胞碎片。上清液(上面的3/4)加入到等體積的緩沖液B (含有0.5M NH4Cl的緩沖液A)中的1.1M鹿糖中，在Beckman50Ti轉子中以45000rpm于4攝氏度離心15小時。核糖體沉淀用緩沖液A漂洗之后，重懸于緩沖液A中，并施加至緩沖液A制備的10-30% (重量/體積)線性蔗糖梯度中，在Beckman SW40Ti轉子中以20000rpm于4攝氏度離心15小時。將梯度按級分離，混合70S核糖體級分，并在Beckman50Ti轉子中以45000rpm于4攝氏度離心20小時以使其沉淀。70S核糖體沉淀重懸于緩沖液A中，一 80攝氏度儲存。
[0297]引物延伸抑制(趾紋法)檢測。根據以前的描述(Moll和Blasi, Biochem BiophysRes Commun297, 1021-1026(2002))進行趾紋法，有小的調整。用于引物模板退火的混合物含有mazG mRNA和32P-末端標記的DNA引物，它與mazG mRNA的65-85堿基互補。將該混合物在65攝氏度孵育5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫。核糖體結合混合物含有2微升IOX緩沖液[IOOmM Tris-HCl (ρΗ7.8)，含有 IOOmM MgCl2, 600mM NH4Cl 和 IOmM DTT]，不同量的MazF (His) 6，0.375mM dNTP, 0.5 μ M70S 核糖體亞基，2.5μ M t RNAaet 和 2 微升的退火混合物，終體積為20微升。最終的mRNA濃度為0.05 μ M。核糖體結合混合物在37攝氏度孵育10分鐘，然后加入2U逆轉錄酶。cDNA的合成于37攝氏度進行15分鐘。加入12微升測序上樣緩沖液來終止反應。樣品在90攝氏度孵育5分鐘，然后在6%聚丙烯酰胺測序凝膠上進行電泳。使用T7RNA聚合酶從含有Τ7啟動子的173-bp DNA片段中體外合成mazGmRNA。由T7啟動子和從+1至+153的mazG mRNA構成的DNA片段通過使用pET_lla_MazG質粒作為DNA模板的PCR擴增而得到。
[0298]酚抽提后的mazG mRNA的趾紋法。實驗按照以上描述的方法進行，唯一區別是省掉了 70S核糖體和tRNAfMet。在引物延伸之前用酚抽提反應混合物以除去蛋白質。[0299]突變體質粒的構建。使用pET-1 Ia-MazG質粒作為DNA模板進行定點誘變。通過DNA序列分析對突變進行確證。
[0300]RNA分離和Northern印跡分析。含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113在甘油-M9培養基中于37攝氏度生長。OD6tltl值達到0.8時，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2%。以如圖4D所示的不同間隔取樣。根據以前的描述(Sarmientos et al.，Cell32，1337-46 (1983))，使用熱酚法分離總RNA。根據以前的描述(Baker和Mackie, Mol Microbiol47, 75-88 (2003))進行Northern印跡分析。
[0301]有關附圖的具體的方法學細節
[0302]如圖1A所示，MazF的表達對細胞有毒性作用。使用質粒pBAD_MazF，pBAD-MazFR29S或pBAD-MazF R86G分別轉化大腸桿菌BW25113 ( Λ araBAD)細胞。細胞涂布在含有和沒有阿拉伯糖(0.2%)的甘油-M9平板上，接種了的平板在37攝氏度孵育24小時。圖1B顯示了大腸桿菌(Escherichi coli) (NP_289336.1)的MazF和耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans) (NP_244588.1),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(AAG23809.1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (NP_372592.1)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) (1NE8_A)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(NP_266040.1),摩氏摩根氏菌(Morganella morgani ) (AAC82516.1)以及結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) (NP_217317.1)的 MazF 的序列比對。
[0303]圖2A顯示MazF的表達對35S-Met向甲苯處理的細胞中摻入的影響。具體地,含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113于37攝氏度在甘油-M9培養基中生長。當培養物的OD600達到0.6時，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2%。37攝氏度孵育10分鐘后，細胞用甲苯處理(Halegoua et al., J Bacteriol 126，183-91 (1976))。根據以前的描述(Halegouaet al., Eur J Biochem6 9，163-7 (1976))，使用甲苯處理的細胞，用35S-甲硫氨酸進行蛋白質合成。圖2B顯示了 MazF對[a-32P]dTTP向甲苯處理的細胞中摻入的影響(Moses和Richardson, Proc Natl Acad Sci USA67, 674-81 (1970))。圖 2C 顯示了 MazF 對[a-32P]UTP 向甲苯處理的細胞中摻入的影響(Peterson et al., J Bacterioll07, 585-8 (1971))。圖2D顯示了 MazF對35S-Met體內摻入的影響。根據所標明的、在MazF誘導后的不同時刻，測量35S-Met向含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細胞中的摻入。圖2E顯示MazF誘導后體內蛋白質合成的SDS-PAGE分析。在圖2E中使用的培養物與圖2D中使用的相同。
[0304]圖3A顯示了 MazF對多核糖體分布圖的影響。通過OD26tl檢測核糖體圖譜，梯度從左(40%)到右(5%)。70、50和30S核糖體的位置予以標明。圖3B闡明了 MazF(His)6對原核無細胞蛋白質合成的影響，使用的是大腸桿菌T7S30提取物系統(Promega)。泳道C，沒有MazF(His)6 ；泳道 1-5:分別加入 77、154、231、308 和 384nM 的MazF(His)6 ；泳道6-10:384nMMazF(His)6, (His)6MazE 和 MazF(His)6 的比例分別是 0.1,0.2,0.4,0.8 和 1.2。圖 3C 顯示MazF(His)6對真核無細胞蛋白質合成的影響，使用的是用于PCR DNA的兔網織紅細胞裂解物系統TNTCk:.HQuick (Promega)。泳道 1，沒有(His) 6MazE 和 MazF (His) 6 ;泳道2，0.66 μ MMazF (Hi s) 6 ；泳道 3，0.9 μ M (Hi s) 6MazE 和 0.66 μ M MazF (Hi s) 6，(Hi s) 6MazE 和 MazF (Hi s) 6的比例是1.2:1。
[0305]圖4A顯示MazF存在時的mazG mRNA的趾紋分析。mRNA從含有T7啟動子的173-bpDNA片段，使用T7RNA聚合酶體外合成。使用pET-lla_MazG質粒DNA經PCR擴增獲得所述DNA片段(T7啟動子和從+1至+153的mazG mRNA)。泳道I，沒有MazF (His) 6和70S核糖體；泳道2，有2.6 μ M MazF(His)6,沒有70S核糖體；泳道3，有0.5 μ M70S核糖體，沒有MazF(His)6 ;泳道 4-8，0.5 μ M70S 核糖體以及分別含有 0.35 μ Μ、0.7 μ Μ、1.4 μ Μ、2.ΙμΜ和2.6μ M的MazF(His)6。圖4Β顯示了酚抽提后的mazG mRNA的趾紋分析。實驗方法與圖4A的泳道I和泳道2中描述的方法相同，區別在于反應產物使用酚抽提，以便在引物延伸之前去除蛋白質。泳道1，沒有MazF(His)6;泳道2，有2.6μ M MazF(His)6。圖4C顯示了 MazE 對對 mazG mRNA 的 MazF 切割的影響。泳道 I,沒有 MazF(His)f^P (His)6MazE ;泳道 2，有 8.8 μ M(His)6MazE ;泳道3，有2.2μΜ MazF(His)6 ;泳道 4-7，有 2.2 μ MMazF (His) 6，(His)6MazE與MazF(His)6的比例分別為0.25,0.4,0.8和1.0。圖4D顯示MazF在體內對細胞mRNA的影響。在加入阿拉伯糖后的不同時刻(如所標明的)從含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細胞中提取總細胞RNA，并進行Northern印跡分析，使用放射性標記的ompA和Ipp ORF DNA作為探針。
[0306]圖5表明了春日霉素對多核糖體分布圖的影響。根據以上的描述進行實驗。通過OD26tl檢測核糖體圖譜，梯度從左(40%)到右(5%)。70、50和30S核糖體的位置予以標明。
[0307]圖6顯示核糖體對mazG mRNA的MazF切割的抑制。反應根據以上的描述進行。泳道1，沒有MazF(His)6和70S核糖體；泳道2，有2.6 μ M MazF (His) 6，但是沒有70S核糖體；泳道3，有0.5 μ M70S核糖體，但是沒有MazF (His) 6 ;泳道4，mazG mRNA和70S核糖體在37攝氏度孵育10分鐘，然后向該混合物中加入2.2μ M MazF(His)6，并在37攝氏度再孵育10分鐘，之后進行引物延伸；泳道5，首先混合70S核糖體和MazF(His)6,并在37攝氏度孵育10分鐘，之后加入mazG mRNA，繼續在37攝氏度孵育10分鐘，之后進行引物延伸；泳道6，mazG mRNA和MazF (His ) 6混合并在37攝氏度孵育10分鐘后，向混合物中加入70S核糖體，繼續在37攝氏度孵育10分鐘，之后進行引物延伸。FL，全長的mazG mRNA;TP(s),由于二級結構暫停的位置；TP (F)，由于MazF切割的趾紋位置；TP (r)，由于核糖體與mazGmRNA的結合造成的趾紋位置。
[0308]圖7闡明了 mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列發生GGAG到UUUG的突變對MazF功能的影響。反應根據上面的描述進行。泳道1-4,野生型mazG mRNA ;泳道5-8,突變體mazGmRNA,在Shine-Dalgarno序列發生GGAG到UUUG的突變。泳道I和5，沒有MazF (His) 6和70S核糖體；泳道2和6，2.6 μ M MazF (His)6,但是沒有70S核糖體；泳道3和7，0.5 μ M70S核糖體，沒有MazF (His)6 ;泳道4和8，0.5 μ M70S核糖體和2.2 μ M MazF (His) 6。標記的注釋在左側，同圖6。
[0309]圖8顯示mazG mRNA起始密碼子的突變對MazF功能的影響。反應根據以上的描述進行。泳道1-4，野生型mazG mRNA ;泳道5-8，突變體mazG mRNA，其起始密碼子變為GUG ;泳道9-12，突變體mazG mRNA,其起始密碼子變為AGG。泳道1、5和9，沒有MazF (His) 6和70S核糖體；泳道2、6和10,2.6μΜ MazF (His)6，但是沒有70S核糖體；泳道3、7和11,0.5yM70S核糖體，但是沒有MazF (His)6 ;泳道4、8和12:0.5 μ M70S核糖體和2.2 μ M MazF (His) 6。標記的注釋在左側，同圖6。
[0310]圖9顯示UACAU (U1A2C3A4U5)切割序列的突變對MazF功能的影響。反應混合物根據以上的描述進行。泳道I和2使用野生型mazG mRNA作為對照。所有的突變由箭頭標明。泳道 I, 3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29 和 31，沒有 MazF(His)6;泳道 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30 和 32，有 2.6μ M 的MazF(His)6。標記的注釋在左側，同圖6。
[0311]圖10顯示MazF和MazE對16S和23S rRNA的切割的影響。反應在以下的體系中進行:10mM Tris-HCl (pH 7.8)，含有 IOmM MgCl2, 60 mM NH4Cl, ImM DTT, 0.5 微升人胎盤 RNA 酶抑制劑(Roche), 5.6 μ M MazF(His)6 和 / 或 17.6 μ M(His)6MazE,總體積是 10 微升。37攝氏度孵育10分鐘后，加入2微升上樣緩沖液以終止反應。樣品在3.5%的丙烯酰胺凝膠上進行分析。泳道1，沒有MazF(His)6;泳道2，有5.2 μ M MazF(His)6;泳道3，有17.6 μ M(His)6MazE;泳道 4，有 5.2 μ M MazF(His)6和 17.6 μ M(His)6MazE.23S 和 16S rRNA和tRNA的位直用箭頭表不。
[0312]結果
[0313]mazF基因被克隆到可以用阿拉伯糖誘導的pBAD質粒(Guzman et al., JBacteriol 177，4121-30(1995))中。攜帶 pBAD-MazF 的大腸桿菌 BW25113 在阿拉伯糖(0.2%)存在的條件下在甘油-M9平板上不生長(參見圖1A)。當MazF同源物中高度保守的殘基Arg29或Arg86被分別替換為Ser或Gly后(圖1B)，對阿拉伯糖的敏感性被消除了(圖W。結果表明觀察到的細胞生長的抑制是由于野生型MazF的生存力成的。在液體培養基中，加入阿拉伯糖5分鐘后，細胞的生存力降低了 104。
[0314]為了確定被MazF抑制的細胞功能，使用了由攜帶pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113制備的無細胞系統，細菌經甲苯處理而被通透化(Halegoua et al., J Bacterioll26, I83-91(1976) ; Halegoua et al., Eur J Biochem69, 163-7 (1976)。當在甲苯處理以前，細胞在阿拉伯糖存在的條件下預孵育10分鐘時，ATP依賴的35S_甲硫氨酸摻入被完全抑制(圖 2A)。但是在類似的條件下，[a-32P] dTTP (Moses 和 Richardson, Proc NatlAcad Sci USA 67，674-81 (1970))(圖 2B)和[a-32P]UTP (Peterson et al., J Bacteriol107,585-8(1971))(圖2C)的摻入卻沒有受到影響。這些結果表明MazF抑制了蛋白質合成，但是不抑制DNA復制或者RNA合成。使用沒有經過甲苯處理的細胞，加入阿拉伯糖后，35S-甲硫氨酸的體內慘入(Hirashima和Inouye, Nature242, 405-7 (1973)被顯著地抑制(圖2D)。加入阿拉伯糖后不同時刻對總細胞蛋白合成所進行的SDS-PAGE分析(圖2E)顯示，MazF是蛋白質合成的一個一般性的抑制劑，它基本上影響所有的細胞蛋白質。有趣的是，較大的蛋白比較小的蛋白更易受到MazF的毒害。
[0315]阿拉伯糖誘導10分鐘后，使用蔗糖密度梯度對攜帶PBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細胞進行多核糖體圖譜的分析。如圖3A所示，在這種細胞中，多核糖體完全消失了，同時70S核糖體級分升高，30S或50S核糖體級分沒有顯著改變。當使用春日霉素處理細胞時，多核糖體圖譜出現了類似的改變(圖5)，春日霉素是抑制翻譯起始的抗生素。這些發現提示MazF通過抑制翻譯起始或者通過降解mRNA而導致核糖體從mRNA上釋放。
[0316]還在大腸桿菌無細胞RNA/蛋白質合成系統中檢查了純化的MazF(His)6對候選蛋白質MazG合成的影響。從共同表達MazE和MazF (His) 6的細胞中純化出MazF (His)60使用大腸桿菌T7S30 提取物系統(Promega)從質粒pET-1 Ia-MazG合成MazG (30kD) (Hirashima andInouye, Nature242, 405-7 (1973))，合成在37攝氏度下進行I小時，并在沒有MazF (His)6存在或者有濃度逐步升高的MazF(His)6存在的情況下(圖3B)。MazF (His) 6濃度在231nM以上時，MazG的合成被完全抑制。同時研究了 MazE抗毒素對這個觀察到的由MazF介導的對MazG合成的抑制的作用。有趣的是，同時加入抗毒素(His)6MazE,以劑量依賴的方式挽救了MazG的合成(圖3B)。MazF(His)6還能夠抑制真核無細胞蛋白質合成系統(圖3C，泳道2)，蛋白質的合成在同時加入(His)6MazE時也得到恢復(泳道3)。
[0317] 由于MazF抑制了 MazG的合成(圖3B)，對抑制發生的時間進行了分析。為了確定抑制是否影響了翻譯起始步驟，采用了趾紋(TP)技術，其使用70S核糖體和MazG mRNA (Mo 11和 Blasi, Biochem Biophys Res Commun297, 1021-1026 (2002))。只對 mazG mRNA 進行趾紋分析產生了全長的條帶(FL)和可能是由于mazG mRNA的5’末端的二級結構而形成的條帶TP(S)(圖4A，泳道I)。在70S核糖體存在下，檢測到了起始密碼子下游的趾紋條帶[TP(r)](泳道3)。當MazF(His)6與70S核糖體一同加入時，出現了一個新的條帶TP(F)，它對應的是Shine-Dalgarno (SD)序列和起始密碼子之間的區域(泳道4_8)。隨著MazF (His)6濃度的升高，TP (r)條帶的強度逐漸降低，在MazF(His)6濃度為3.75 μ M時，TP (r)條帶幾乎完全消失了(泳道7)。
[0318]令人驚奇的是，甚至在沒有70S核糖體時也檢測到了 TP(F)條帶(泳道2)，這表明MazF能夠不依賴于70S核糖體與mRNA結合，或者MazF是在A和C殘基之間切割的核糖核酸內切酶(圖4A)。
[0319]為了區別這些可能性，mazG mRNA與經過酹抽提除去蛋白質的MazF(His)6共同孵育，用于圖4B所示的引物延伸。即使在酚抽提以后還能夠觀察到TP(F)條帶(泳道2)，表明MazF(His)6的確切割mazGmRNA。當MazE共同加入時,mazG mRNA的切割被再次阻斷(圖4C,泳道4-7)。注意(His)6MazE單獨地對于mRNA沒有可檢測到的作用(泳道2)。該結果表明MazE的抗毒性作用是由于對MazF核糖核酸內切酶活性的抑制。在MazF (His) 6之前加入70S核糖體，抑制了 MazF (His) 6對mRNA的切割，很可能是由于mazG mRNA中SD序列和ACA序列位置接近(圖6)。相反，RelE的毒性作用需要核糖體(Pedersen et al.，見前，(2003))。
[0320]表1顯示了在檢查的不同mRNA轉錄物中的MazF切割序列。保守的切割序列加上了下劃線。
【權利要求】
1.在細胞中制備多肽的方法，所述方法包括:(a)用編碼所述多肽的核酸序列轉染所述的細胞，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以使用另外的三聯體密碼子替換mRNA干擾酶識別序列，其中由所述的突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒有因為所述的突變而改變；(b)用編碼mRNA干擾酶多肽的核酸序列轉染所述的細胞，其中所述的mRNA干擾酶多肽識別所述的mRNA干擾酶多肽識別序列并且以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA ;以及(c)在所述的細胞中表達步驟(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的細胞中表達步驟(a)和(b)的核酸序列提供了在所述細胞中制備所述多肽的手段。
2.權利要求1的方法，其中所述mRNA識別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)序列，所述mRNA干擾酶多肽是SEQ ID NO:2所示的MazF ;或者其中的mRNA識別序列是尿嘧啶-腺嘌呤-X (UAX)序列，其中X是胞嘧啶(C)、A或者U，所述mRNA干擾酶多肽是SEQ IDNO:4所示的PemK。
3.權利要求1的方法，其中步驟(a)和(b)同時進行。
4.權利要求1的方法，還包括將所述的細胞在(c)步驟之前或者在(c)步驟中，在包含至少一種放射性標記同位素的培養基中孵育。
5.制備多肽的方法，所述的方法包括:(a)提供編碼所述多肽的核酸序列，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以用另外的三聯體密碼子替代mRNA干擾酶識別序列，其中由所述突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒有由于所述的突變而被改變；(b)提供編碼mRNA干擾酶多肽的核酸序列，其中所述的mRNA干擾酶多肽識別所述的mRNA干擾酶識別序列并且以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA;以及(c)表達步驟(a)和(b)的核酸序列，其中步驟(a)和(b)的核酸序列的表達提供了生產所述多肽的手段。
6.權利要求5的方法，其中所述mRNA識別序列是ACA序列，所述mRNA干擾酶多肽是SEQ ID NO:2所示的MazF;或者其中所述mRNA識別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U, mRNA干擾酶多肽是SEQID NO:4所示的PemK。
7.包含至少一個編碼mRNA干擾酶多肽的核酸序列的組合物用于制造用于治療具有疾病的患者以減輕所述疾病之癥狀的藥物的用途，其中所述多肽具有以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA的序列特異性核糖核酸內切酶活性。
8.權利要求7的用途，其中所述mRNA干擾酶多肽是SEQID NO:2所示的MazF或者SEQID NO:4 所示的 PemK0
9.權利要求7的用途，其中所述的疾病是細菌感染，向所述的患者施用治療有效量的所述組合物通過降低在所述患者體內細菌的數目而緩解細菌感染的癥狀。
10.權利要求9的用途，其中所述的細菌感染包含至少一種抗生素抗性細菌菌株。
11.權利要求7的用途，其中所述的疾病是過度增生性疾病，向所述的患者施用治療有效量的所述組合物通過降低所述患者體內過度增生性疾病細胞的數目而緩解所述過度增生性疾病的癥狀。
12.包含mRNA干擾酶多肽的組合物用于制造用于治療具有疾病的患者以緩解所述疾病之癥狀的藥物的用途，其中所述多肽具有以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA的序列特異性核糖核酸內切酶活性。
13.權利要求12的用途，其中所述mRNA干擾酶多肽是SEQID NO:2所示的MazF或者SEQ ID NO:4 所示的 PemK0
14.權利要求12的用途，其中所述的疾病是細菌感染，向所述的患者施用所述的組合物通過降低所述患者體內細菌的數目而緩解細菌感染的癥狀。
15.權利要求14的用途，其中所述的細菌感染包含至少一種抗生素抗性細菌菌株。
16.權利要求12的用途，其中所述的疾病是過度增生性疾病，向所述的患者施用所述的組合物通過降低所述患者體內過度增生性疾病細胞的數目而緩解所述過度增生性疾病的癥狀。
17.權利要求11或者16的用途，其中所述的增生性疾病選自以下疾病組成的組:不同組織的發育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過敏/哮喘、動脈粥樣硬化以及血管成形手術后的再狹窄。
18.制備多個多核糖核苷酸序列的方法，所述的方法包括:(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一個區域與所述的第二核酸序列的一個區域互補，且所述的第一和第二核酸序列的兩個互補區域都不包含與mRNA干擾酶識別位點互補的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它們的5’末端都被磷酸化；(b)通過所述的第一和第二核酸序列的互補區域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成雙鏈的核酸序列，其包含側翼為單鏈突出端的互補區域，其中每一個所述單鏈突出端包含至少一個與mRNA干擾酶識別位點互補的序列，且所述的單鏈突出端互相互補；(c)通過互補的單鏈突出端連接已經退火的第一和第二核酸序列，形成包含多個退火的第一和第二核酸序列串聯重復序列的多聯體；(d)使用包含T7啟動子以及與所述的第一核酸序列互補的區域的第一引物和與所述的第二核酸序列互補的第二引物擴增所述的多聯體，其中所述的擴增產生多個包含T7啟動子的多聯體；(e)使用T7RNA聚合酶從所述的多個多聯體轉錄出RNA分子，其中每一個所述的RNA分子包含多個側翼為mRNA干擾酶識別位點的多核糖核苷酸序列的串聯重復序列；以及(f)使用能夠在所述的干擾酶識別位點處以不依賴于核糖體的方式特異切割RNA的mRNA干擾酶多肽消化所述的RNA分子，其中所述的消化產生多個所述多核糖核苷酸序列。
19.權利要求18的方法，其中所述mRNA識別序列是ACA序列，所述mRNA干擾酶是SEQID NO:2所示的MazF ;或者其中的mRNA識別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U, mRNA干擾酶多肽是SEQ IDNO:4所示的PemK。
【文檔編號】A61P41/00GK103937827SQ201410045230
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2004年6月14日 優先權日:2003年6月13日
【發明者】M·伊諾耶, J·張, Y·L·張 申請人:新澤西內科與牙科大學