針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的抗體及其使用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新穎抗體，尤其涉及針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的抗體，而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本發(fā)明也涉及針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本發(fā)明也提供這些抗體的診斷和治療調(diào)配物，及其免疫偶聯(lián)物。
【專利說明】針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的抗體及其使用
[〇〇〇1] 本申請(qǐng)是如下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：申請(qǐng)日為2004年6月25日、申請(qǐng)?zhí)枮?201110233784. 9、發(fā)明名稱為針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的抗體及其使用。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本實(shí)施例涉及新穎抗體，尤其涉及針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失突變體的抗體， 而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本實(shí)施例也涉及針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的缺失 突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本實(shí)施例也涉及這些抗體的變體。本發(fā) 明也提供這些抗體的診斷和治療配方，及其免疫偶聯(lián)物。 【背景技術(shù)】
[0003] 自上世紀(jì)以來，已尋求有助于更好診斷和治療人類和動(dòng)物癌癥的腫瘤特異分子。 除了那些基于病毒誘導(dǎo)癌癥并包含由病毒基因規(guī)定的分子結(jié)構(gòu)的癌癥之外，在大多數(shù)類型 的人類癌癥中，很難提供對(duì)基于分子結(jié)構(gòu)資料的腫瘤特異物質(zhì)的確切證據(jù)。極少有關(guān)于基 于新穎分子結(jié)構(gòu)的腫瘤特異分子的實(shí)例。在惡性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其它與表皮生長(zhǎng)因子受 體分子的放大或變化潛在相關(guān)的腫瘤（諸如乳腺癌和其它人類癌癥）的情況下，尚無關(guān)于 具有獨(dú)特序列的結(jié)構(gòu)變化分子的明確論證。
[0004] 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)是原致癌基因 c-erb B的170千道爾頓（kilodalton) 膜糖蛋白產(chǎn)物。已知EGFR基因的序列（Ullrich等人，1984)。"Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431Epidermoid Carcinoma Cells. "Nature309 :418-425)。EGFR 基因是最初在鳥類紅細(xì) 胞增多癥病毒中識(shí)別的erbB致癌基因的細(xì)胞同系物（Downward等人（1984))。"Close Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v~erb B Oncogene Protein Sequence. " Nature307 :521-527，Ullrich等人（1984)。已在各種人類腫瘤中觀察到 這種致癌基因通過基因放大的活化（Haley等人（1987A))。"The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in :0ncogenes，Genes，and Growth Factors"，Guroff，G 編，第 12 版，第2章，第40-76頁，Wiley，N. Y.，且尤其為神經(jīng)膠質(zhì)源性的那些表皮生長(zhǎng)因子受體 基因 （Libermann 等人，（1985)。"Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin"， Nature313 :144-147 ;Wong 等人，（1987)。"Increased Expression ofthe Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903 ;Yamazaki 等人，（1988) 〇 "Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene (c-erbB)in Human Brain Tumors. ''Molecular and Cellular Biology8 : 1816-1820，Maiden 等人，（1988)。"Selective Amplification ofthe Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme· ''Cancer Research4 :2711-2714)。
[0005] 已證實(shí)EGF-r在多種類型的人類固體腫瘤中過量表達(dá)。Mendelsohn Cancer Cells7 :359(1989), Mendelsohn Cancer Biologyl :339-344(1990)，Modjtahedi and Dean Int' lj.〇nc〇l〇gy4:277-296(1994)。例如，已在某些肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腦 癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌中觀察到EGFR過量表達(dá)。Modjtahedi and Dean Int' lj.0ncology4 :277-296(1994)。已證實(shí)表皮生長(zhǎng)因子（EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-α (TGF-α)都結(jié)合至EGF-n而且導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。
[0006] v-erb B致癌基因和正常EGFR基因之間的一個(gè)主要區(qū)別在于病毒致癌基因是 正常受體截?cái)喟被淖冃?；它們?nèi)鄙俅蟛糠旨?xì)胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域，但保留了跨膜和酪氨酸激 酶結(jié)構(gòu)域（Fung 等人，（1984))。Activation ofthe Cellular Oncogene c_erb B by LTR Insertion ：Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell33 :357-368 ;Yamamoto 等人，（1983)。"A New Avain Erythroblastosis Virus， AEV-H Carries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma. " Cell34 :225_232，Nilsen 等人，（1985)。"c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis ：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truneated EGF Receptor. ，'Cell41:719-726 ;Gammett 等 人，（1986) 〇 "Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 :6053-6057)。這導(dǎo)致了不 可以結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（EGF)，但仍可以磷酸化其它物質(zhì)的蛋白質(zhì)（Gilmore的，（1985))。 ^Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell40 :609-618 ;Kris 等人，（1985)。Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity ot the Avian EGF Receptor and v~erB Protein. "Cell40 :619-625),且導(dǎo)致以下推測(cè)：v-erb B蛋白質(zhì)為致癌基因性的是因?yàn)榧っ?結(jié)構(gòu)域未經(jīng)調(diào)節(jié)且結(jié)構(gòu)上為活性的（Downward等人，1984)。
[0007] 各種基因變化都可以發(fā)生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末 端中發(fā)生氨基酸的取代和缺失。然而，可獲得的證據(jù)表明氨基截?cái)鄬?duì)于致癌作用尤 為關(guān)鍵。氨基截?cái)嗍撬衯-erb B致癌基因的一個(gè)特征，包括由啟動(dòng)子的插入或逆 轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的那些氨基截?cái)啵∟ilsen等人，（1985))。"c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis ：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.，'Cell41 :719-726 ;Gammett 等 人，（1986)〇 "Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 :6053-6057) 〇
[0008] 相反，羧基-末端缺失似乎只與由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的腫瘤有關(guān)，而且似 乎決定了宿主范圍和腫瘤類型的特異性（Gammett等人，1986 ;Raines等人，（1985)。 ^c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis ：Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles. ,?Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :2287-2291)。以氨基-截?cái)帏B類c-erb B基因或感染性病毒致癌基因-人 類EGF受體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明該缺失單獨(dú)即足以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)（Pelley等人，（1988))。 "Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic :Characterization of a Replication Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB. ''Journal of Virology62 :1840-1844 ;Wells 等人，（1988)。"Genetic Determinants of Neoplastic Transformation by the Retroviral Oncogene v-erbB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 ： 7597-7601)。
[0009] EGFR基因的放大發(fā)生于40%的惡性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中（Libermann等人，（1985)。 "Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin，'，Nature313 :144-147 :Wong 等 人，(1987) 〇 ''Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903),受體基因的重排在許多具有基因放大的腫瘤中較為明顯。 結(jié)構(gòu)變化似乎優(yōu)先影響基因的氨基末端一半（Yamazaki等人，（1985)。"Amplification， Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene m Primary Human BrainTumours ofGlial Origin"，N ature313 :144-147 :Maiden 等人，（1988)。"Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme· " Cancer Research4 :2711-2714)，但重排的性質(zhì)當(dāng)時(shí)并未在 任何腫瘤中準(zhǔn)確表征。
[0010] 已報(bào)導(dǎo)在若干人類癌癥中的大小變體EGFR基因和放大（Humphrey等人， (1988))〇 "Amplification and Expression ofthe, Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts，'· Cancer Research48 :2231_2238 ;Bigner 等人，（I988) J. Neuropathol. Exp. Neural. ,47 :191-205 ;Wong 等人，（1987)。"Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification" · Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903 ;和 Humphrey等人。表皮生長(zhǎng)因子受體基因在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植中的放大和表達(dá)， Cancer Res. 48(8) :2231-8(1988))。然而，尚無關(guān)于細(xì)胞中經(jīng)改變EGFR分子的分子基的 測(cè)定。1989年，Drs. Bigner和Vogelstein的著作說明已知為III型突變體的EGF受體突 變體的序列（也稱為δ-EGFr或EGFR VIII)。此著作描述于美國(guó)專利第 6,455,498 號(hào)、第 6,127, 126 號(hào)、第 5,981,725 號(hào)、第 5,814,317 號(hào)、第 5,710,010 號(hào)、第 5, 401，828 號(hào)和第 5, 212, 290 號(hào)中。
[0011] EGFR變體是由基因重排伴隨EGFR基因放大而引起的。存在八種主要的EGFr變 體，已知為：⑴EGFRvI缺少EGFR的大部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，（ii)EGFRvII由EGFR的細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域中的83aa框內(nèi)缺失組成，（iii)EGFRvIII由EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的267aa框內(nèi) 缺失組成，（iv)EGFRvIV含有EGFR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失，（v)EGFRvV含有EGFR的細(xì)胞 質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失，（vi) EGFR. TDM/2-7含有EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的外顯子2-7的重復(fù)， (vii)EGFR. TDM/18-25含有EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的外顯子18-26的重復(fù)，和（viii) EGFR. TDM/18-26含有EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的外顯子18-26的重復(fù)（Kuan等人，EGF 突變體受體vIII在治療癌癥中作為分子目標(biāo)，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001))。 另外，存在第二種更為罕見的具有第二種在外顯子11和14之間的連接點(diǎn)引入新穎組氨酸 殘基的缺失的EGFRvIII突變體（EGFRvIII/A12-13) (Kuan等人，EGF突變體受體viii在治 療癌癥中作為分子目標(biāo)，Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96(2001))。
[0012] EGFRvIII是在人類癌癥中表皮生長(zhǎng)因子（EGF)受體最常見發(fā)生的變體（Kuan 等人，EGF突變體受體vIII在治療癌癥中作為分子革巴標(biāo)，Endocr Relat Cancer. 8(2): 83-96(2001))。在基因放大的過程中，在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中發(fā)生267個(gè)氨基酸缺失，產(chǎn) 生腫瘤特異單克隆抗體可指向的新穎連接點(diǎn)。EGF受體的這種變體以配位體獨(dú)立的 方式有助于腫瘤通過組成型信號(hào)發(fā)出而發(fā)展。已知EGFrVIII未表達(dá)于任何正常組 織上(Wikstrand, CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research55 (14) :3140-3148(1995) ;01apade_01aopa，E0.等人"Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Bi* J Cancer. 82(1) :186-94(2000))。然而，EGFRvIII顯示在腫瘤細(xì)胞中的顯著表達(dá)， 例如，27?76 %乳腺癌活組織檢查表達(dá)EGFRvIII (Wikstrand，CJ.等人"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. " Cancer Research55 (14) :3140-3148 (1995) ；Ge H.等人，"Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression with EGFR in human invasive breast cancer by laser capture microdissection and immunohistochemical analysis.，' Int J Cancer. 98 (3) :357-61 (2002))，50 ?70%神經(jīng)膠 質(zhì)癌表達(dá) EGFRvIII (Wikstrand，CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research55(14) :3140-3148(1995) ;Moscatello， G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in
[0013] multiple human tumors.，'Cancer Res. 55 (23) :5536-9 (1，995))，16 % NSCL 癌 癥表達(dá) EGFRvIII (Garcia de Palazzo，IE.等人，"Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.，'Cancer Res. 53 (14)： 3217-20 (1993))，75%卵巢癌表達(dá) EGFRvIII (Moscatello，G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. ''Cancer Res. 55(23) :5536-9(1995)) ?
[0014] 和 68 % 前列腺癌表達(dá) EGFRvIII (Olapade-Olaopa，E0.等人，"Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. " Br J Cancer. 82(1) : 186-94(2000))。
[0015] 缺失267個(gè)氨基酸并替換為甘氨酸產(chǎn)生可定靶抗體的獨(dú)特連接。此外，鑒于 EGFRvIII在某些腫瘤中的表達(dá)及其在正常組織中的表達(dá)缺乏，EGFRvIII在腫瘤治療中可 作為用于定靶藥物的理想靶標(biāo)。具體而言，EGFRvIII似乎可作為腫瘤免疫偶聯(lián)物治療的理 想候選物（例如，與抗腫瘤劑或毒素偶聯(lián)的抗體）。另一種治療過量表達(dá)EGFRvIII的癌癥 的方法涉及使用特異性定靶至未分離正常EGFR的變體受體的腫瘤特異性核酶。發(fā)現(xiàn)核酶 在無胸腺裸鼠中顯著抑制乳腺癌生長(zhǎng)（Luo等人，Int. J. Cancer. 104(6) :716-21 (2003))。 已描述用于整個(gè)EGFRvIII蛋白質(zhì)的通用抗體。
[0016] 見國(guó)際專利申請(qǐng)案第 W001/62931 號(hào)和 Kuan 等人，"EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy. ''Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96(2001) ;Kuan 等人，"EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy. '^Brain Tumor Pathol. 17(2) :71-78(2000) ;Kuan 等人，"Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv. ^International Journal of Cancer. 88(6) :962-969(2000) ;Landry 等人，"Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen ：Fv-peptide complex of an antibody fragment specific fbr the mutant EGF receptor, EGFRvIII. Journal of Molecular Biology. 308(5)： 883-893(2001) ;Reist 等人，"Astatine_2111abeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N_succinimidyl5-[21 lAt] astato-3-pyridinecarboxylate.，' Nuclear Medicine and Biology. 26 (4) :405-411 (1999) ;Reist 等人，" In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody ：comparison with its murine parent.，'Nuclear Medicine and Biology. 24 (7) :639-647 (1997)； Wikstrand 等人，"Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigen system. Cancer Immunology, Immunotherapy.50(12)： 639-652(2002) ;Wikstrand 等人，"Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research. 55 (14) :3140-3148(1995) ;Wikstrand 等人，"The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRVIII) ：characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4(2) ： 148-158(1998) ；Wikstrand 等 人，"The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII): characterization and utilization as an immunotherapeutic target.，'J. Neurovirol. 4 (2) :148-158(1998) ;Jungbluth 等人，"A monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor.，'Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2) :639-44(2003) ;Mamot 等人，"Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells. ''Cancer Researches :3154-3161 (2003))。然而，每一種上述抗體在變化和/或恒定區(qū)內(nèi)都具有或含 有鼠科序列。
[0017] 這些鼠科衍生蛋白質(zhì)的存在可導(dǎo)致抗體的快速清除或可導(dǎo)致抵抗患者體內(nèi)抗體 的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。另外，即使在親和力成熟之后，這些抗體仍具有2. 2xl(T8至1. 5xl(T9級(jí) 別的相對(duì)低的親和力。（Kuan 等人，"EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy. "，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001))。
[0018] 為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，研究者已將人類抗體功能引入嚙齒動(dòng)物以 使得卩齒齒動(dòng)物可產(chǎn)生完全人類抗體，見例如Mendez等人，"Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. "Nat Genet. 15(2) :146-56(1997)。這種方法已結(jié)合針對(duì)野生型EGFR的成功抗體 的產(chǎn)生而使用，見例如 Yang X 等人，"Development of ABX-EGF，a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody, for cancer therapy. ,?Crit Rev Oncol Hemato38(l)： 17-23(2001) ;Yang X_D 等人，"Eradication ofEstablished Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy，，，Cancer Research59 (6) :1236-1243(1999)和美國(guó)專利第 6, 235, 883 號(hào)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包含特異性結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離人類單克隆抗體 和包含序列LEEKKGNYVVTDHC的肽（SEQ ID NO :56)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包含 特異性結(jié)合至于包含L EEKKGNYVVTDHC的序列（SEQ ID NO :56)中含有的表位的經(jīng)分離人類 單克隆抗體，其中如由SPOTs排列中的丙氨酸掃描所測(cè)定，結(jié)合所需的殘余物選自由EEK、 KKNYV、LEK、EKNY 和 EEKGN 組成的群組。
[0020] 另外的實(shí)施例包括包含由VH3-33基因編碼的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的經(jīng)分離人 類單克隆抗體。重鏈可變區(qū)氨基酸序列可包括由JH4b基因編碼的氨基酸序列，或由選自由 D6-13和D3-9組成的群組的D基因編碼的氨基酸序列。
[0021] 其它實(shí)施例包括包含由A23(VK2)基因編碼的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的經(jīng)分離人 類單克隆抗體。輕鏈可變區(qū)氨基酸序列可包括由JK1基因編碼的氨基酸序列。
[0022] 其它實(shí)施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體或其片段，而且其包含選自由標(biāo) 識(shí)為（SEQ ID)N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、 250、139、211、124、318、342和333的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列?？贵w 可為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體?？贵w或片段可與醫(yī)藥學(xué)上可接受的 載劑或稀釋劑締合，而且可與治療劑偶聯(lián)。治療劑可為毒素。治療劑可為諸如DM-UAEFP、 AURISTATINE或ZAP的毒素。所述藥劑可經(jīng)連接劑與抗體締合。所述毒素可經(jīng)第二抗體與 抗體締合。另外的實(shí)施例包括產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞株和包含編碼抗體基因的轉(zhuǎn)型細(xì)胞。 例如，所述細(xì)胞可為中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。
[0023] 另外的實(shí)施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖的方法，其包 含以有效量的抗體或片段處理表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體包含選自由 抗體 13. 1. 2(SEQ ID NO :138)、131(SEQ ID NO :2)、170(SEQ ID NO :4)、150(SEQ ID N0 :5)、 095(SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、124(SEQ ID NO :13)、318(SEQ IDN0 :15)、342(SEQ IDN0 :16)和333(SEQ IDN0 :17)的重鏈氨基酸序列組 成的群組的重鏈氨基酸序列。該方法在活體內(nèi)進(jìn)行，而且在哺乳動(dòng)物（諸如人類）體內(nèi)進(jìn) 行，所述哺乳動(dòng)物經(jīng)受涉及上皮細(xì)胞增殖的癌癥，諸如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、 乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或卵巢癌。
[0024] 另外的實(shí)施例包括殺死靶細(xì)胞的方法。這可以通過使靶細(xì)胞和與毒素締合的抗體 接觸來達(dá)到。抗體結(jié)合至肽LEEKKGNY(SEQ ID NO :133)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體對(duì)于肽具有 大于1. 3xlO_9M的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，毒素選自AEFP、DM-1和ZAP。在一個(gè)實(shí)施 例中，抗體毒素化合物對(duì)靶細(xì)胞的毒性是對(duì)無肽細(xì)胞毒性的10倍多。在一個(gè)實(shí)施例中，抗 體包含選自由抗體 13. 1. 2 (SEQ ID N0 :138)、131 (SEQ ID NO :2)、170 (SEQ ID NO :4)、150 (SEQ ID NO :5)、095(SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、 124 (SEQ ID NO :13)、318 (SEQ ID NO :15)、342 (SEQ ID NO :16)和 333 (SEQ ID NO :17)的重鏈 氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體經(jīng)肽連接劑或第二抗 體與毒素締合。
[0025] 本發(fā)明另外的實(shí)施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體，且其包含重鏈氨基酸 序列，其包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R):
[0026] (a)CDRl，由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?1區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成；
[0027] (b)CDR2，由選自由標(biāo)識(shí)為SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?2區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成；和
[0028] (c)CDR3，由選自由標(biāo)識(shí)為SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、人類或人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施 例中，抗體與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑和/或治療劑締合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述治 療劑為毒素。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述毒素為DM-1或AuristatinE。
[0031] 也包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體或其片段，而且其包含選自由標(biāo)識(shí)為（SEQ 10)吣：140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、 139、211、123、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組的輕鏈氨基酸序列?？贵w可為 單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。其可與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或稀釋劑締 合，或與治療劑（諸如毒素，例如DM1或AURISTATIN E)偶聯(lián)。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施例中，涵蓋產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞株或轉(zhuǎn)型細(xì)胞，該抗體包含選自由 標(biāo)識(shí)為（SEQ ID)N0 :140、19、20、21、29、23、25· 26、26、28、33、31 和 32 的抗體 13. 1. 2、131、 170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組的輕鏈氨基 酸序列。另外的實(shí)施例包括產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株和包含編碼抗體基因的轉(zhuǎn)型細(xì)胞， 諸如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。
[0033] 另一個(gè)實(shí)施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖的方法，其包 含以有效量的上述抗體或片段處理表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞。該方法在活體內(nèi)進(jìn)行，而且在哺 乳動(dòng)物（諸如人類）體內(nèi)進(jìn)行，所述哺乳動(dòng)物經(jīng)受涉及上皮細(xì)胞增殖的癌癥，諸如肺癌、結(jié) 腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或卵巢癌。
[0034] 另一個(gè)實(shí)施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體，且其包含輕鏈氨基酸序列，其 包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R) :
[0035] (a)CDRl，由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1區(qū)的氨基酸序 列組成的群組的序列組成；
[0036] (b)CDR2,由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1區(qū)的氨基酸序 列組成的群組的序列組成；和
[0037] (c)CDR3,由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1區(qū)的氨基酸序 列組成的群組的序列組成。
[0038] 上段所識(shí)別的抗體可進(jìn)一步包括重鏈氨基酸序列，其包含以下互補(bǔ)決定區(qū) (CDR):
[0039] (a)CDRl，由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?1區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成；
[0040] (b)CDR2，由選自由標(biāo)識(shí)為SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?2區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成；和
[0041] (c)CDR3,由選自由標(biāo)識(shí)為 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 區(qū)的氨基酸序列組 成的群組的序列組成。
[0042] 另外的實(shí)施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖的方法，其包 含以有效量上述抗體或片段處理表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞。該方法在活體內(nèi)進(jìn)行，而且在哺乳 動(dòng)物（諸如人類）體內(nèi)進(jìn)行，所述哺乳動(dòng)物經(jīng)受涉及上皮細(xì)胞增殖的癌癥，諸如肺癌、乳腺 癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
[〇〇43] 其它實(shí)施例包括經(jīng)分離的多聚核苷酸分子，其包含編碼重鏈氨基酸序列的多聚核 苷酸序列或其片段，其選自由標(biāo)識(shí)為SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 體 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的重鏈氨基酸序列組成的 群組，或包含編碼輕鏈氨基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其選自由標(biāo)識(shí)為SEQ ID N0 : 140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 33 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、139、250、 211、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組。
[0044] 另外的實(shí)施例包括包含容器，含于其中的組合物和表明所述組合物可用于治療以 EGFRvIII的表達(dá)為特征的癌癥的包裝說明書或標(biāo)簽的產(chǎn)品，其中所述組合物包含如上文所 述的抗體。所述癌癥包括肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。也包括用于檢 測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中的EGFRvIII來篩選肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌或卵巢癌 的檢定試劑盒，其中EGFRvIII為由上皮癌癥表達(dá)的抗原，試劑盒包含結(jié)合抗原蛋白質(zhì)的抗 體和用于指示抗體與抗原的反應(yīng)的構(gòu)件（如果存在）。所述抗體可為經(jīng)標(biāo)記的單克隆抗體， 或所述抗體可為未經(jīng)標(biāo)記的第一抗體，且用于指示反應(yīng)的構(gòu)件包含為抗免疫球蛋白的經(jīng)標(biāo) 記第二抗體。結(jié)合抗原的抗體可由選自由螢光染料、酶、放射性核素和不透射線材料組成的 群組的標(biāo)記物來標(biāo)記。結(jié)合抗原的抗體也可結(jié)合至過量表達(dá)的wtEGFR。該試劑盒可供患者 選擇臨床使用。
[0045] 另一個(gè)實(shí)施例包括特異性識(shí)別含有新穎Gly殘基的EGFRvIII表位的抗體。
[0046] 另一個(gè)實(shí)施例包括EGFRvIII的變體。所述變體可具有pFLAG插入物，可由SEQID N0 :56氨基酸組成，且可存在于計(jì)算機(jī)模擬中。
[0047] 另一個(gè)實(shí)施例包括結(jié)合至識(shí)別序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)的抗體或其變體。
[0048] 另一個(gè)實(shí)施例包括特異性結(jié)合至EGFRvIII的抗體變體。所述抗體變體可進(jìn)一步 結(jié)合至包含SEQ ID N0 :57的肽?？贵w變體可具有與肽中的殘基EKNY或EEKGN相互作用的殘 基。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體變體結(jié)合至肽序列比其結(jié)合至野生型的EGFR蛋白質(zhì)緊10倍多。 在一個(gè)實(shí)施例中，抗體變體特異性結(jié)合至EGFRvIII和SEQID N0 :56肽。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng) 分離的抗體或變體具有包含深腔的互補(bǔ)決定區(qū)，其中所述腔由重鏈的CDR2和CDR3、輕鏈的 CDR3和輕鏈CDR1的一小部分形成。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合腔中 具有殘基 31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和 223。在一個(gè)實(shí)施 例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有包含淺槽的互補(bǔ)決定區(qū)，其中所述槽由重鏈CDR2和CDR3與 輕鏈CDRUCDR2和CDR3形成。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合溝槽中具 有殘基 31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172 和 211-221。在 一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合溝槽中具有殘基31-33、35、37、55、96-101、 148、163、165、170、172、178、217和218。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有一成型 互補(bǔ)位，以使得當(dāng)肽EEKKGN(SEQ ID N0127)的抗體決定基結(jié)合至抗體的互補(bǔ)位時(shí)，在選自由 E2和Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55組成的群組的兩個(gè)殘基 之間形成至少一個(gè)鍵。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有一成型互補(bǔ)位，以使得當(dāng) 肽EEKKGNY (SEQ ID N0131)的抗體決定基結(jié)合至抗體的互補(bǔ)位時(shí)，在選自由K4和Q95、K4和 Q95、N6和Q98、G5和H31、Y7和H31及Y7和W165組成的群組的兩個(gè)殘基之間形成至少一 個(gè)鍵。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體具有一結(jié)構(gòu)或與計(jì)算機(jī)模擬中測(cè)定的結(jié)構(gòu)相互作用。
[0049] 另一個(gè)實(shí)施例提供一種用于選擇以特定結(jié)合特征結(jié)合至EGFRvIII的變體的方 法，所述方法包含使用分子結(jié)構(gòu)以形成互補(bǔ)位，使用分子結(jié)構(gòu)以形成表位，計(jì)算二者之間的 相互作用能并將所述能級(jí)與mAb變體的表位和第二互補(bǔ)位的能級(jí)相比較，和基于能級(jí)差異 選擇變體。所述方法可進(jìn)一步包括使用互補(bǔ)位的第二變體與表位之間的相互作用能來測(cè)定 第三相互作用能并比較第三相互作用能和第二相互作用能來決定選擇哪個(gè)變體。在一個(gè)實(shí) 施例中變體形成并進(jìn)行結(jié)合測(cè)試。
[0050] 另一個(gè)實(shí)施例提供一種選擇以特定結(jié)合特征結(jié)合至EGFRvIII的變體的方法，所 述方法檢驗(yàn)與互補(bǔ)位相互作用的表位的殘基，選擇重要?dú)埢孕纬勺R(shí)別序列，使用所述序 列以形成EGFRvIII變體，并使用所述EGFRvIII變體來選擇mAb變體。
[0051] 另一個(gè)實(shí)施例提供一種使抗體變體形成EGFRvIII的方法，所述方法包含分析與 互補(bǔ)位相互作用的表位的殘基，選擇表位的較重要?dú)埢孕纬勺R(shí)別序列，使用所述識(shí)別序 列以形成EGFRvIII變體，并使用所述EGFRvIII變體來選擇抗體變體。在一個(gè)實(shí)施例中，在 計(jì)算機(jī)模擬中達(dá)成抗體的選擇。在一個(gè)實(shí)施例中，通過產(chǎn)生抵抗EGFRvIII變體的抗體來達(dá) 到經(jīng)使用EGFRvIII變體來選擇抗體。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施例中，其中經(jīng)分離的抗體變體結(jié)合至EGFRvIII和SEQ ID N0 :57肽， 抗體可進(jìn)一步包含以下點(diǎn)突變：Tyrl72Arg、Leu99Glu、ArglOlGlu、Leu217Glu、Leu99Asn、 Leu99HiS、L99T、Argl01ASp或其某些組合。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人類抗體。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施例中，抗體或其變體結(jié)合至序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)，且所述抗 體或變體具有次納摩爾結(jié)合能力。
[0054] 在又一個(gè)實(shí)施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且抗體具有結(jié)合至表位的互補(bǔ)位，且表 位具有一組與包括E、K、N和Y的互補(bǔ)位相互作用的殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，所述抗體為抗 體 131。
[0055] 在又一個(gè)實(shí)施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且抗體具有結(jié)合至具有一組與包含E、 E、K、G和N的互補(bǔ)位相互作用的殘基的表位的互補(bǔ)位。在一個(gè)實(shí)施例中，表位的主要結(jié)構(gòu) 為EEKKGNY(SEQ ID NO :131)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體為13. 1. 2。
[0056] 在又一個(gè)實(shí)施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且具有小于1.3χ1(Γ9Μ、小于1.0χ1(Γ 9Μ 或小于500ρΜ的KD。在一個(gè)實(shí)施例中，與野生型的EGFR肽相比，抗體對(duì)于SEQ ID NO :56具 有特異性。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體對(duì)野生型的EGFR肽（SEQ ID NO :134)的非特異性結(jié)合低 于抗體對(duì)EGFRVIII(SEQ ID NO :135)的特異性結(jié)合的10%。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體選自由 131、139和13. 1. 2組成的群組。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體經(jīng)內(nèi)在化。在一個(gè)實(shí)施例中，至少約 70 %或至少約80%的抗體都發(fā)生內(nèi)在化。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施例中，與對(duì)于野生型的EGFR蛋白質(zhì)或其變體（SEQ ID N0 :134)相比，變 體人類單克隆抗體優(yōu)先結(jié)合至對(duì)于EGFRvIII蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上獨(dú)特的表位。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施例中，變體包含對(duì)應(yīng)于典范類1的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1)。在一個(gè)實(shí) 施例中，變體包含對(duì)應(yīng)于典范類3的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR2)。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施例中，變體包含對(duì)應(yīng)于典范類4的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1)。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施例中，變體包含對(duì)應(yīng)于典范類1的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R2)。在一個(gè)實(shí) 施例中，變體包含對(duì)應(yīng)于典范類1的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR3)。在一個(gè)實(shí)施例中，變體包含 對(duì)應(yīng)于典范類1的第一重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1)、對(duì)應(yīng)于典范類3的第二重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDR2)、對(duì)應(yīng)于典范類4的第一輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1)、對(duì)應(yīng)于典范類1的第二輕鏈互補(bǔ)決 定區(qū)（⑶R2)和對(duì)應(yīng)于典范類1的第三輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R3)，其中形成這些互補(bǔ)決定區(qū)以 使得變體可結(jié)合至與對(duì)于EGFR蛋白質(zhì)相比，對(duì)于EGFRvIII蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上獨(dú)特的表位。在 又一個(gè)實(shí)施例中，提供一種抑制與EGFRvIII的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖的方法。
[0061] 所述方法涉及以有效量的抗體或其片段處理表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞，其中所述抗 體或其片段結(jié)合至EGFRvIII，其中所述抗體與毒素結(jié)合，且其中所述抗體包含選自由抗體 13. 1. 2(SEQ ID NO ：138)U31(SEQ ID NO ：2)U70(SEQ ID NO ：4)U50(SEQ ID NO :5),095 (SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、124(SEQ ID NO :13)、 318 (SEQ ID NO : 15)、342 (SEQ ID NO : 16)和 333 (SEQ ID NO : 17)的重鏈氨基酸序列組成的群 組的重鏈氨基酸序列。該方法在活體內(nèi)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，所述哺乳動(dòng)物可為人類，且可 經(jīng)受涉及上皮細(xì)胞增殖的癌癥，且所述癌癥可包含肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳 腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或卵巢癌。所述毒素可為DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATINE或ZAP。
[0062] 在又一個(gè)實(shí)施例中，提供一種抑制表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞的細(xì)胞增殖的方法。該方法 涉及以有效量的抗體或其片段處理表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞，其中所述抗體與毒素結(jié)合，且其 中所述抗體具有選自由標(biāo)識(shí)為（SEQ ID)N0 :19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體 13. L 2、131、170、150、123、095、139、250、211、342、333 和 318 的輕鏈氨基酸序列組成的群 組的輕鏈氨基酸序列，其中所述經(jīng)分離的多聚核苷酸分子將結(jié)合具有以SEQ ID N0 :56識(shí)別 的序列的肽。該方法在活體內(nèi)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，所述哺乳動(dòng)物可為人類，且可經(jīng)受涉及 上皮細(xì)胞增殖的癌癥，且所述癌癥可包含肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤或卵巢癌。所述毒素可為DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATINE或ZAP。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1為野生型的EGFR和EGFRvIII之間的顯示267氨基酸缺失和G替換的序列比 對(duì)。
[0064] 圖2為EGFRvIII PEP314-mer肽的設(shè)計(jì)圖。在圖2A中，具有氨基酸LEEKK的 EGFRvIII的N-末端序列。（SEQ ID NO :58) (1-5)與EGFR的N-末端序列相同，繼而為獨(dú)特甘 氨酸殘基，繼而為與EGFR中的殘基273至280相同的氨基酸。圖2B代表EGFRvIII (6-272) 中缺失的EGFR的氨基酸。
[〇〇65] 圖3A-L提供本發(fā)明抗體的序列。對(duì)于每一種所提供的抗體，對(duì)于重鏈和輕鏈可變 區(qū)均提供多聚核苷酸和氨基酸序列。因此，對(duì)于每一種所列抗體提供四個(gè)序列。
[〇〇66] 圖4為13. 1. 2抗體重鏈區(qū)與特定種系重鏈區(qū)比較的表格，表示雜交瘤重鏈區(qū) 的氨基酸殘基與那個(gè)特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。 [〇〇67] 圖5為13. 1. 2抗體輕鏈區(qū)與特定種系輕鏈區(qū)比較的表格，表示雜交瘤輕鏈區(qū) 的氨基酸殘基與那個(gè)特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。 [0068] 圖6為各種雜交瘤衍生抗體重鏈區(qū)與特定種系重鏈區(qū)比較的表格，表示雜交 瘤重鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個(gè)特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基 來表示。
[〇〇69] 圖7為各種雜交瘤衍生抗體輕鏈區(qū)與特定種系輕鏈區(qū)比較的表格，表示雜交 瘤輕鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個(gè)特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基 來表示。
[0070] 圖8為顯示重組EGFRvIII mAb與表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞（NR6細(xì)胞）的結(jié)合的代表 圖。菱形代表95,三角形代表133,正方形代表139, "X"代表150,星號(hào)代表170,圓形代表 221，直線代表230,和長(zhǎng)方形代表250。
[0071] 圖9A顯示對(duì)于人類抗-EGFR抗體（ABX-EGF)至H80的染色分析。
[0072] 圖9B顯示對(duì)于抗體131至H80的FACS染色分析。
[0073] 圖9C顯示對(duì)于抗體139至H80的FACS染色分析。
[0074] 圖9D顯示對(duì)于抗體13. 1. 2至H80的FACS染色分析。
[0075] 圖9E顯示對(duì)于ABX-EGF至H1477的FACS染色分析。
[0076] 圖9F顯示對(duì)于抗體131至H1477的FACS染色分析。
[0077] 圖9G顯示對(duì)于抗體139至H1477的FACS染色分析。
[0078] 圖9H顯示對(duì)于抗體13. 1. 2至H1477的FACS染色分析。圖91顯示對(duì)于ABX-EGF 至A549的FACS染色分析。
[0079] 圖9J顯示對(duì)于抗體131至A549的FACS染色分析。
[0080] 圖9K顯示對(duì)于抗體139至A549的FACS染色分析。
[0081] 圖9L顯示對(duì)于抗體13. 1. 2至A549的FACS染色分析。
[0082] 圖9M為展示EGFRvIII mAb與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的結(jié)合的曲線圖。實(shí)心三角形代 表結(jié)合至H1477的抗體131。實(shí)心正方形代表結(jié)合至H1477的抗體13. 1.2?？杖切未?結(jié)合至H80的抗體131?？照叫未斫Y(jié)合至H80的抗體13. 1. 2。
[0083] 圖9N為展示EGFRvIII mAb至人類表皮樣癌細(xì)胞株A431的結(jié)合的曲線圖。實(shí)心正 方形代表抗體13. 1. 2。實(shí)心三角形代表抗體131。
[0084] 圖90為展示抗體13. 1. 2至NR6鼠科成纖維細(xì)胞細(xì)胞株的結(jié)合的曲線圖。正方形 代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。
[0085] 圖9P為展示抗體131至鼠科成纖維細(xì)胞細(xì)胞株的結(jié)合的曲線圖。正方形代表NR6。 三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。
[0086] 圖10A顯示對(duì)于人類抗-EGFR抗體（ABX-EGF)結(jié)合至表達(dá)EGFR細(xì)胞（A431)的 FACS染色分析。
[0087] 圖10B顯示對(duì)于抗體131至表達(dá)EGFR細(xì)胞（A431)的FACS染色分析。
[0088] 圖10C顯示對(duì)于抗體139至表達(dá)EGFR細(xì)胞（A431)的FACS染色分析。
[0089] 圖10D顯示對(duì)于抗體13. 1. 2至表達(dá)EGFR細(xì)胞（A431)的FACS染色分析。
[0090] 圖11A顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。
[0091] 圖11B顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。
[0092] 圖11C顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。
[0093] 圖11D顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。
[0094] 圖11E顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。
[0095] 圖11F顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。
[0096] 圖11G顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。
[0097] 圖11H顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。
[0098] 圖111顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。
[0099] 圖12A顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。
[0100] 圖12B顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。
[0101] 圖12C顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。
[0102] 圖12D顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。
[0103] 圖12E顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。
[0104] 圖12F顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。
[0105] 圖12G顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體170的活體外毒性。
[0106] 圖12H顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。
[0107] 圖121顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。
[0108] 圖13A顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體211的活體外毒性。
[0109] 圖13B顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體211的活體外毒性。
[0110] 圖13C顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體211的活體外毒性。
[0111] 圖13D顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體250的活體外毒性。
[0112] 圖13E顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體250的活體外毒性。
[0113] 圖13F顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體250的活體外毒性。
[0114] 圖13G顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的AEFP結(jié)合相對(duì)于與未 表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體IgGl (消極對(duì)比）的活體外毒性。
[0115] 圖13H顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的DM1結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體IgGl (消極對(duì)比）的活體外毒性。
[0116] 圖131顯示間接與表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞（H1477,圓形）中的ZAP結(jié)合相對(duì)于與未表 達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）的細(xì)胞結(jié)合的抗體IgGl (消極對(duì)比）的活體外毒性。
[0117] 圖14A為條形圖，其表明EGFRvIII抗體（13. 1.2、131和139)當(dāng)結(jié)合至AEFP時(shí)抑 制復(fù)制生成檢定中H1477細(xì)胞的菌落形成。
[0118] 圖14B為條形圖，其表明EGFRvIII抗體（13. 1.2、131和139)當(dāng)結(jié)合至DM1時(shí)抑 制復(fù)制生成檢定中H1477細(xì)胞的群落形成。
[0119] 圖15A為顯示抗-EGFRvIII抗體（13. 1. 2)與毒素（MMAE)在表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞 (H1477,圓形）中相對(duì)于在未表達(dá)EGFRvIII (H80,正方形）中的直接偶聯(lián)物的活體外毒性的 曲線圖。圖15B為顯示抗-EGFRvIII抗體（13. 1. 2)與毒素（AEFP)在表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞 (H1477,圓形）相對(duì)于在未表達(dá)GFRvIII(H80,正方形）的細(xì)胞中的直接偶聯(lián)物的活體外毒 性的曲線圖。
[0120] 圖15C為顯示抗-EGFRvIII抗體（13. 1.2)與毒素（DM1)在表達(dá)EGFRvIII細(xì)胞 (H1477)相對(duì)于在未表達(dá)GFRvIII(H80)的細(xì)胞中的直接偶聯(lián)物的活體外毒性的曲線圖。
[0121] 圖16顯示其中具有確定腫瘤異種移植的小鼠經(jīng)抗-EGFRvIII (或dEGFR)抗體 (13. 1. 2)(直接結(jié)合至毒素（DM1、MMAE或AEFP))處理的活體內(nèi)動(dòng)物模型的結(jié)果。實(shí)心正 方形代表250微克dEGFR-DMl。實(shí)心頂角向上的三角形代表75微克相同物質(zhì)。實(shí)心頂角 向下的三角形代表75微克dEGFR-MMAE。菱形代表250微克相同物質(zhì)。較淺的正方形代表 75微克dEGFR-AEFP?？照叫未?50微克相同物質(zhì)。空心頂角向上的三角形代表dEGFR 和自由DM1。空心頂角向上的抗體代表PBS。所有使用的抗體為13. 1.2。箭頭表示前藥處 理。圖17顯示抗體131結(jié)構(gòu)模型的分子表面。六個(gè)CDR被遮蔽為不同的陰影以標(biāo)記它們 的邊界。結(jié)合腔位于接近中心處。圖18顯示抗體13. 1. 2分子表面的結(jié)構(gòu)模型。六個(gè)⑶R 區(qū)域遮蔽為陰影且由數(shù)字識(shí)別。長(zhǎng)槽大概沿垂直中心線分布。圖19A為13. 1.2抗體和肽 EEKKGN(SEQ ID NO :127)錯(cuò)合物的可能擴(kuò)展模型。⑶R區(qū)域遮蔽為陰影以指示邊界。
[0122] 圖19B顯示13. 1. 2抗體和肽EEKKGN(SEQ ID NO :127)錯(cuò)合物的可能擴(kuò)展模型中的 氫鍵。如圖18，CDR圈的陰影與殘基相同。肽殘基自圖頂部的N-末端至C-末端編號(hào)為1至 6。由虛線指示六個(gè)氫鍵。氫鍵形成的六對(duì)氨基酸如下：E2. ..Y172、K3. ..H31、K4. ..H31、 Ν6· · · D33、Ν6···Υ37 和 Ν6· · · Κ55。
[0123] 圖20為表明對(duì)于所選擴(kuò)展模型之一的表位-抗體結(jié)合能與Kd的對(duì)數(shù)之間的關(guān)聯(lián) 的曲線圖。
[0124] 圖21描繪肽-13. 1. 2抗體錯(cuò)合物的精確擴(kuò)展模型。肽以空格實(shí)心形式呈現(xiàn)。
[0125] 圖22描繪精確擴(kuò)展模型中的氫鍵。
[0126] 圖23為描繪抗體-抗原結(jié)合能相對(duì)于相對(duì)親和力的對(duì)數(shù)的線性擬合的曲線圖。 【具體實(shí)施方式】
[0127] 如上文所述，EGFRvIII為EGFR的缺失突變體，其中EGFr的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的267 氨基酸缺失，且于連接處以甘氨酸進(jìn)行單一氨基酸替換。這些特征顯示于圖1中野生型 EGFR與EGFRvIII之間的序列比對(duì)中。鑒于在缺失的連接處的甘氨酸的氨基酸替換，理論上 可能產(chǎn)生針對(duì)存在于EGFRvIII中而不存在于野生型的EGFR中的新穎表位的抗體。因此， 如圖2中所示，設(shè)計(jì)用于免疫和篩選的肽，稱為PEP3 (Kuan等人，EGFmutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy, Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96 (2001)) 〇 這 種14-mer肽具有對(duì)于EGFRvIII和野生型的EGFR常見的5個(gè)n-末端氨基酸，獨(dú)特甘氨酸 連接位點(diǎn)和野生型的EGFR(對(duì)應(yīng)于殘基273-280)與EGFRvIII (對(duì)應(yīng)于殘基7-14)之間的 保守序列中所含的8個(gè)氨基酸殘基。此外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和以基因編碼的EGFRvIII轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞（B300. 19細(xì)胞）也可用于免疫和篩選（在本文有時(shí)稱為B300. 19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染 子）。
[0128] 為產(chǎn)生抵抗EGFRvIII的人類抗體，將轉(zhuǎn)基因 XenoMouse?小鼠以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞/EGFRvIII、B300. 19/EGFRvIII細(xì)胞和針對(duì)在與野生型的EGFR相比的EGFRvIII中表 示的新穎細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的連接區(qū)的肽（PEP3)的組合進(jìn)行免疫。將來自經(jīng)免疫小鼠中的 B細(xì)胞分離并用于產(chǎn)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，繼而篩選以結(jié)合至EGFRvIII或使用XenoMaWSLAM? 技術(shù)直接用于篩選以結(jié)合至 EGFRvIII (Babcook 等人，A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities，Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (15) :7843-8 (1996)和美國(guó)專利第 5, 627, 052號(hào)）。經(jīng)識(shí)別結(jié)合至EGFRvIII的抗體經(jīng)一系列檢定篩選以確定EGFRvIII的特 異性識(shí)別。經(jīng)過這個(gè)過程來產(chǎn)生、分離并表征結(jié)合至EGFRvIII且對(duì)EGFRvIII具有特異性 的人類單克隆抗體群體。隨后獨(dú)特表明表位定位，但重疊了特異性。在活體外進(jìn)一步評(píng)估 所有抗體以評(píng)估其為了將細(xì)胞毒素藥物傳遞到細(xì)胞而通過細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)在化的能力。表明有 效傳遞藥物的抗體與細(xì)胞毒素藥物直接結(jié)合，并檢測(cè)其殺死活體外和活體內(nèi)表達(dá)EGFRvIII 的腫瘤細(xì)胞的能力。這些研究為用于治療患者癌癥的抗體藥物偶聯(lián)物的下一次產(chǎn)生提供了 基礎(chǔ)，這些患者的腫瘤隱藏有特異性基因病變。
[0129] 通過上述過程產(chǎn)生完全人類抗-EGFRvIII抗體的群體。使用雜交瘤方式，產(chǎn)生對(duì) 于野生型的EGFR具有有限交叉反應(yīng)性的幾種抗體，包括對(duì)用于與PEP3結(jié)合的ELISA呈 陽性的抗體13. 1、13. 2、13. 3和13. 4。除了這些，選擇抗體13. 1(和尤其為它的亞克隆 13. 1. 2)以供進(jìn)一步研究和發(fā)展。使用XenoMax方式，產(chǎn)生抗體群體，包括抗體131、139、250 和095,其對(duì)于與p印3寡核苷酸的結(jié)合具有高度特異性，且與野生型的EGFR具有有限的交 叉反應(yīng)性。其中，131抗體具有最令人感興趣的特性。在圖4-7中展示每一種抗體的序列 (SEQ ID NO :1-33和141-144)。對(duì)各種抗體的序列和結(jié)合能力進(jìn)行比較并將結(jié)果展示于圖 4-10中。如圖9A-9L和圖10A-10D中可見，與ABX-EGF相比，抗體131、139和13. 1. 2都表 現(xiàn)出對(duì)于EGFRvIII表達(dá)細(xì)胞（H1477)的較佳選擇性。某些結(jié)果顯示于圖9M-9P中的曲線 圖中，其表明簡(jiǎn)單與EGFRvIII細(xì)胞相比，至少兩種抗體13. 1. 2和131表現(xiàn)出對(duì)于EGFRvIII 表達(dá)細(xì)胞的較佳選擇性。此外，檢測(cè)本實(shí)施例抗體的幾種可能用途；其結(jié)果顯示于圖11-16 中。最后，基于預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)模型，形成抗體的變體以獲得具有變化結(jié)合特征的抗體。
[0130] 另外，本發(fā)明抗體對(duì)于結(jié)合至相同或類似表位的其它抗體的篩選極為有用。本發(fā) 明抗體可用于闡明其它抗體的交叉競(jìng)爭(zhēng)研究中，預(yù)期其它抗體對(duì)于形成的抗原-抗體錯(cuò)合 物的特征具有相同或經(jīng)改良的影響。
[0131] 每一種對(duì)于EGFRvIII具有極高親和力131抗體和13. 1.2都通過細(xì)胞良好內(nèi) 在化，且當(dāng)結(jié)合至毒素時(shí)表現(xiàn)出可高效殺死細(xì)胞。令人感興趣的是，不管是否產(chǎn)生于 XenoMouse小鼠的不同免疫中，且不管是否使用不同的技術(shù)，兩種抗體都衍生于極為類似的 種系基因。然而，基于表位定位操作，每一種抗體似乎結(jié)合至EGFRvIII分子上稍微不同的 表位，且具有對(duì)于結(jié)合必要的EGFRvIII上稍微不同的殘基。這些結(jié)果表明使用種系基因?qū)?于定靶EGFRvIII的抗體療法的產(chǎn)生尤為重要，且小變化可通過基于這些結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步 設(shè)計(jì)抗體和其它療法來改良抗體的結(jié)合和影響。
[0132] 高度需要結(jié)合至相同表位，或競(jìng)爭(zhēng)與13. 1. 2和131抗體結(jié)合的抗體。如下文更詳 細(xì)討論，已通過SPOTs排列的丙氨酸掃描闡明對(duì)于特定抗體結(jié)合重要的殘基。因此，也高度 需要共享重要結(jié)合殘基的抗體。
[0133] 定義
[0134] 除非另外定義，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常 了解的含義。另外，除非本文另外要求，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式且復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)形式。 一般而言，本文所述的結(jié)合細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多聚核苷 酸化學(xué)及雜交的術(shù)語及其技術(shù)是此項(xiàng)技術(shù)中已熟知且通常使用的那些術(shù)語。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于 重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)型（例如，電擊、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染）。根據(jù)生產(chǎn)者的說明 或此項(xiàng)技術(shù)中通常實(shí)現(xiàn)的或如本文所述進(jìn)行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。通常根據(jù)此項(xiàng)技術(shù)中熟知 的常規(guī)方法和如本說明書通篇所引用和討論的各種通用和更詳盡參考文獻(xiàn)中所述來進(jìn)行 前述技術(shù)和程序。見，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν· Υ·，1989)。本文所述的 關(guān)于分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和藥物及醫(yī)藥化學(xué)而使用的術(shù)語及其試驗(yàn)程序和技術(shù)在此項(xiàng) 技術(shù)中已熟知且通常使用。
[0135] 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成，化學(xué)分析，醫(yī)藥制備、調(diào)配和傳遞以及治療患者。
[0136] 如本文所用的術(shù)語"經(jīng)分離多聚核苷酸"意思是染色體組、cDNA或合成源的多聚核 苷酸或其某種組合，由于其來源，"經(jīng)分離多聚核苷酸"（1)與所有或一部分其中"經(jīng)分離多 聚核苷酸"在自然界中發(fā)現(xiàn)的多聚核苷酸無關(guān)，（2)可操作性地連接至多聚核苷酸，在自然 界中并未連接，或（3)在自然界中并未作為較大序列的部分而發(fā)生。本文中提到的術(shù)語"經(jīng) 分離蛋白質(zhì)"是指cDNA、重組RNA或合成源的蛋白質(zhì)或其某種組合，由于其來源或衍生源， "經(jīng)分離蛋白質(zhì)"（1)與自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)無關(guān)，（2)不含來自相同源的其它蛋白質(zhì)，例 如，不含鼠科蛋白質(zhì)，（3)由來自不同物種的細(xì)胞來表達(dá)，或（4)在自然界中并未發(fā)生。
[0137] 術(shù)語"多肽"在本文中用作一般術(shù)語，是指多肽序列的天然蛋白質(zhì)、片段或類似物。 因此，天然蛋白質(zhì)、片段或類似物是多肽類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選多肽包含人類重鏈免疫 球蛋白分子和人類κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包含重鏈免疫球蛋白分子和輕鏈免疫 球蛋白分子（諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子或λ輕鏈免疫球蛋白分子）的組合形成的抗體 分子，且反之亦然，以及其片段和類似物。
[0138] 如本文所用的應(yīng)用于一種物體上的術(shù)語"天然發(fā)生"是指在自然界中可發(fā)現(xiàn)一種 物體的這個(gè)事實(shí)。例如，存在于可自天然源分離的有機(jī)體（包括病毒）中，而且未經(jīng)在實(shí)驗(yàn) 室中人為或以其它方式有意改質(zhì)的多肽或多聚核苷酸序列是天然發(fā)生的。
[0139] 如本文所用的術(shù)語"可操作性連接"是指所述組分的位置處于可允許它們以其所 預(yù)期的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。對(duì)照序列"可操作連接"至編碼序列是以在與對(duì)照序列相 容的條件下可達(dá)到表達(dá)編碼序列的方式加以綁扎。
[0140] 本文所用的術(shù)語"對(duì)照序列"是指對(duì)于實(shí)現(xiàn)多聚核苷酸序列所連接的編碼序列的 表達(dá)和處理有必要的多聚核苷酸序列。這些對(duì)照序列的本質(zhì)視其宿主生物體而不同，在原 核生物中，這些對(duì)照序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物 中，這些對(duì)照序列通常包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"對(duì)照序列"意味著包括至少其存 在對(duì)于例如先導(dǎo)序列和融合伙伴序列的表達(dá)和處理所必需的所有組分，而且也包括其存在 對(duì)于例如先導(dǎo)序列和融合伙伴序列有利的其它組分。
[0141] 本文所提及的術(shù)語"多聚核苷酸"意思是長(zhǎng)度至少為10個(gè)基的核苷酸的聚合形 式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的改質(zhì)形式。術(shù)語包括DNA的單鏈和雙 鏈形式。
[0142] 本文提及的術(shù)語"寡核苷酸"包括天然發(fā)生的和由天然發(fā)生與非天然發(fā)生的寡核 苷酸連接子連接在一起的改質(zhì)核苷酸。寡核苷酸是通常包含200個(gè)堿基或更短長(zhǎng)度的多聚 核苷酸亞組。寡核苷酸優(yōu)選長(zhǎng)度為10到60個(gè)堿基，且最優(yōu)長(zhǎng)度為12、13、14、15、16、17、18、 19或20到40個(gè)堿基。寡核苷酸通常為單鏈，例如用作探針；盡管寡核苷酸可為雙鏈，例如 用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。
[0143] 本文提及的術(shù)語"天然發(fā)生的核苷酸包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文 提及的術(shù)語"改質(zhì)核苷酸"包括含有改質(zhì)或取代糖基的核苷酸及其類似物。本文提及的術(shù) 語"寡核苷酸連接子"包括寡核苷酸連接子，諸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、 二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酰胺酯及其類似物。見，例如LaPlanche 等人，Nucl. Acids Res. 14 :9081 (1986) ;Stec 等人，J. Am. Chem. Soc. 106 :6077 (1984); Stein 等人，Nucl. Acids Res. 16 :3209(1988) ;Zon 等人，Anti-Cancer Drug Design6 : 539 (1"1) ;Zon 等人，Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach，第 87_l〇8 頁（F. Eckstein 編，Oxford University Press，Oxford England (1991)) ;Stec 等人，美國(guó)專 利第 5,151，510 號(hào)；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews90 :543 (1990)。如果需要，寡核 苷酸可包括用于檢測(cè)的標(biāo)簽。如本文所用的術(shù)語"變體"為不同于所列舉的多肽或多聚核苷 酸的多肽、多聚核苷酸或分子，但只是為了不對(duì)蛋白質(zhì)活性造成不利改變。可存在表位的變 體。可存在抗體的變體。在優(yōu)選實(shí)施例中，蛋白質(zhì)變體結(jié)合至表位的能力未不利改變。在 一個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)變體可以與野生型mAb能力的10-500 %結(jié)合。例如，蛋白質(zhì)變體可以 與野生型mAb能力的10 %、50 %、110 %、500 %或大于500 %結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在 10-500%范圍之間的結(jié)合能力。結(jié)合能力可通過多種方式反映，包括（但不限于）變體對(duì) 表位的k a、kd或KD。在一優(yōu)選實(shí)施例中，表位是本說明書中所述的表位。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施例中，變體抗體可通過替換、缺失或添加5個(gè)或更少氨基酸而不同于 野生型的序列。這些變體通?？赏ㄟ^改質(zhì)所揭示多肽序列之一，并使用例如本文所述的代 表性程序評(píng)估經(jīng)改質(zhì)多肽的結(jié)合特性來識(shí)別。在另一個(gè)實(shí)施例中，多肽變體優(yōu)選展示與經(jīng) 識(shí)別多肽至少約70%、更優(yōu)至少約90%且最優(yōu)至少約95%的同一性。優(yōu)選地，變體只在保 守替換和/或改質(zhì)上不同。變體蛋白質(zhì)包括那些與本說明書所述的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上類 似和功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果蛋白質(zhì)與本說明書中所述蛋白質(zhì)功能上 相當(dāng)，那么這種蛋白質(zhì)可以是變體，只要變體的互補(bǔ)位與本說明書中所述的互補(bǔ)位類似。在 一個(gè)實(shí)施例中，任何具有與圖17中所述互補(bǔ)位類似形狀的物質(zhì)都是變體。在一個(gè)實(shí)施例 中，任何具有與圖18中所述互補(bǔ)位類似形狀的物質(zhì)都是變體。在一個(gè)實(shí)施例中，任何具有 與圖19A和19B中所述相互作用表面類似形狀的物質(zhì)都是變體。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施例中，如果核酸序列在嚴(yán)格條件下可選擇性地與野生型的序列雜交， 那么抗體為變體。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的適度嚴(yán)格條件包括在5xSSC溶液中預(yù)洗，0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8 :0);在50C-65°C下雜交，5xSSC，隔夜或如果為種間同源物，則在45°C 下，0. 5xSSC ;繼而在65°C下以每次含有0. 1% SDS的2x、0. 5x和0. 2xSSC洗脫兩次，歷時(shí) 20分鐘。這些雜交DNA序列也屬于本發(fā)明的范疇中，由于編碼的簡(jiǎn)并性，如核苷酸序列編 碼的抗體多肽也由雜交DNA序列所編碼。本文提及的術(shù)語"選擇性雜交"意思是可檢測(cè)地 且特異性地結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的多多聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在一定雜交和洗脫條件 下與核酸選擇性雜交，所述雜交與洗脫條件可以減小與非特異核酸的可檢測(cè)結(jié)合的可測(cè) 量。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可用于達(dá)到如此項(xiàng)技術(shù)中已知且于本文中所討論的選擇性雜交條件。一 般而言，本發(fā)明的多多聚核苷酸、寡核苷酸和片段與令人感興趣的核酸序列之間的核酸序 列同源性至少為80%，且更一般的為優(yōu)選至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同 源性。如果在兩種氨基酸序列之間存在部分或完全同一性，那么這兩種氨基酸序列即為同 系。例如，85%同源性意思是當(dāng)兩種序列進(jìn)行最大匹配比對(duì)時(shí)，85%的氨基酸一致。在最 大化匹配中允許存在間隙（兩種序列的任一種相匹配）；優(yōu)選為5或更少的間隙長(zhǎng)度，2或 更少為更優(yōu)?；蛘呋騼?yōu)選地，如本文所用的這個(gè)術(shù)語，如果使用含有突變數(shù)據(jù)矩陣和6或 更多間隙代價(jià)的ALIGN程序，兩種蛋白質(zhì)序列（或自長(zhǎng)度為至少30個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中 衍生的多肽序列）具有多于5的比對(duì)分值，那么它們同源。見Dayhoff，M. 0.，in Atlas of Protein Sequence and Structure,第 101-110 頁（第 5 卷，National Biomedical Research Foundation(1972))和此卷的第2期增刊，第1-10頁。如果兩種序列或其部分的氨基酸當(dāng) 使用ALIGN程序最佳比對(duì)時(shí)大于或等于50%-致，那么這兩種序列或其部分更優(yōu)同源。本 文所用的術(shù)語"對(duì)應(yīng)于"意思是多多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列同源（即，一致， 但非嚴(yán)格演化相關(guān)），或多多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列一致。對(duì)比而言，本文所 用術(shù)語"互補(bǔ)"意思是互補(bǔ)序列與參考多聚核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸 序列"TATAC"對(duì)應(yīng)于參考序列"TATAC"且與參考序列"GTATA"互補(bǔ)。
[0146] 以下術(shù)語用于描述兩種或兩種以上多聚核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系： "參考序列"、"比較窗口 "、"序列一致性"、"序列一致性百分率"和"實(shí)質(zhì)一致性"。"參考序 列"為已確定的序列，用作序列比較的基準(zhǔn)；參考序列可為更大序列的亞組，例如，如序列列 表中給定的全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，或可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，參考 序列長(zhǎng)度至少為18個(gè)核苷酸或6個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度經(jīng)常為至少24個(gè)核苷酸或8個(gè)氨基酸，且 長(zhǎng)度通常為至少48個(gè)核苷酸或16個(gè)氨基酸。由于兩個(gè)多聚核苷酸或氨基酸序列可能每一 個(gè)（1)包含在兩個(gè)分子之間類似的序列（即，完整多聚核苷酸或氨基酸序列的一部分），和 (2)可能進(jìn)一步包含在兩個(gè)多聚核苷酸或氨基酸序列之間不同的序列，一般通過經(jīng)"比較窗 口"比較兩個(gè)分子的序列以識(shí)別和比較序列類似的局部區(qū)域來進(jìn)行兩個(gè)（或更多）分子之 間的序列比較。如本文所用的"比較窗口"是指至少18個(gè)鄰接核苷酸位置或6個(gè)氨基酸的 概念片段，其中多聚核苷酸序列或氨基酸序列可與至少18個(gè)鄰接核苷酸或6個(gè)氨基酸序列 的參考序列相比較，且其中多聚核苷酸序列在比較窗口中的位置與參考序列（其不包含添 加或缺失）相比，可包含20%或更少的添加、缺失、替換及其類似物（即，間隙），以供兩個(gè) 序列的最優(yōu)序列比對(duì)?？赏ㄟ^Smith和Waterman,Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)的局部同系 物算法，通過Needleman和Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同系物比對(duì)算法，通過用 于 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85 :2444 (1988)的類似方法的研究， 通過這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行過程（GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0 中的 TFASTA, (Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, Wis. )，Geneworks或Mac Vector軟件封裝），或通過觀測(cè)來進(jìn)行用于比對(duì)比較窗口的序列 的最優(yōu)序列比對(duì)，且選擇由各種方法產(chǎn)生的最佳序列比對(duì)（即，導(dǎo)致同系物于比較窗口上 的最高百分比）。
[0147] 術(shù)語"序列一致性"意思是兩個(gè)多聚核苷酸或氨基酸序列于比較窗口上一致（即， 在核苷酸X核苷酸或殘基X殘基的基礎(chǔ)上）。術(shù)語"序列一致性百分比"通過比較兩個(gè) 在比較窗口上最優(yōu)比對(duì)的序列，測(cè)定于兩個(gè)序列中發(fā)生一致核酸基（例如，A、T、C、G、u或 I)或殘基以產(chǎn)生匹配位置編號(hào)的所在位置的編號(hào)，將匹配位置的編號(hào)除以比較窗口中的位 置總數(shù)（即，窗口大?。?，且將所得結(jié)果乘以1〇〇,以產(chǎn)生序列一致性百分比。如本文所用 的術(shù)語"實(shí)質(zhì)一致性"表示多聚核苷酸或氨基酸序列的特征，其中與至少18個(gè)核苷酸（6個(gè) 氨基酸）位置的比較窗口上，經(jīng)常于至少24-48個(gè)核苷酸（8-16個(gè)氨基酸）位置的窗口上 的參考序列相比，多聚核苷酸或氨基酸包含至少85%序列一致，優(yōu)選至少90%至95%序列 一致，更通常至少99%序列一致的序列，其中通過將參考序列與可能包括比較窗口上總計(jì) 20 %或更少參考序列的缺失或添加的序列相比較來計(jì)算序列一致性百分比。參考序列可為 更大序列的亞組。與野生型的蛋白質(zhì)或核酸實(shí)質(zhì)上一致的氨基酸或核酸為野生型的蛋白質(zhì) 或核酸的變體實(shí)例。
[0148] 如本文所用的20種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。見Immunology-A Synthesis (第 2 版，Ε· S. Golub and D. R. Gren 編，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。20種常規(guī)氨基酸（例如，D-氨基酸），人造氨基酸（諸如a-氨基酸、a-雙取代氨 基酸、N-烷基氨基酸、乳酸）及其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體也可以作為用于本發(fā)明多 肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括：4_羥基脯氨酸、γ -羧基谷氨酸、e-N，N，N-三甲 基賴氨酸、c-N-乙?；嚢彼帷?-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲 基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸及其它類似氨基酸和亞氨基酸（例如4-羥基 脯氨酸）。在本文所用的多肽符號(hào)中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用途和常規(guī)，左手方向?yàn)榘被┒朔较颍矣?手方向?yàn)轸然┒朔较颉?br> [0149] 類似地，除非另外指明，單鏈多聚核苷酸序列的左手端為5'端，雙鏈多聚核苷酸 序列的左手端稱為Υ方向。初生RNA轉(zhuǎn)錄的Υ至:V添加的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向，具有與 RNA相同的序列且為RNA轉(zhuǎn)錄的5'至5'端的DNA鏈上的序列區(qū)域稱為"上游序列"，具有 與RNA相同的序列且為RNA轉(zhuǎn)錄的3'至3'端的DNA鏈上的序列區(qū)域稱為"下游序列"。
[0150] 如應(yīng)用于多肽的術(shù)語"實(shí)質(zhì)一致性"意思是當(dāng)兩個(gè)肽序列諸如通過使用默認(rèn)間隙 重量的GAP或BESTFIT程序最優(yōu)比對(duì)時(shí)，兩個(gè)肽序列共享至少80 %的序列一致性，優(yōu)選為 至少90 %的序列一致性，更優(yōu)為至少95 %的序列一致性，且最佳為至少99 %的序列一致 性。優(yōu)選地，非一致的殘基位置通過保守氨基酸替換而不同。保守氨基酸替換是指具有類 似側(cè)鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸群組為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸群組為絲氨酸和蘇氨酸；具有含氨化物 側(cè)鏈的氨基酸群組為天冬酰胺和谷酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸群組為苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸群組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；且具有含硫側(cè)鏈的 氨基酸群組為半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替換基團(tuán)為：纈氨酸-亮氨酸-異 亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰 胺-谷酰胺。實(shí)質(zhì)上一致的多肽可為變體。
[0151] 變體蛋白質(zhì)也包括具有微小變化的蛋白質(zhì)。如本文所討論，考慮到了本發(fā)明所包 含的抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小變化，只要氨基酸序列中的變化保持在 至少75 %，更優(yōu)至少80 %、90 %、95 %，且最優(yōu)為99 %。尤其而言，也考慮到了保守氨基酸的 置換。
[0152] 保守置換為那些發(fā)生于與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中的置換。經(jīng)基因編碼的氨 基酸通常分為以下家族：（1)酸性-天冬氨酸、谷氨酸；（2)堿性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸； (3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和（4) 不帶電極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)的家族 為：絲氨酸和蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷酰胺為含氨化物家族；丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸和異亮氨酸為脂肪族家族，且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸為脂肪族家族。例如， 可合理預(yù)期以異亮氨酸或纈氨酸經(jīng)分離置換亮氨酸，以谷氨酸經(jīng)分離置換天冬氨酸，以絲 氨酸經(jīng)分離置換蘇氨酸或以結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸經(jīng)分離置換氨基酸的類似置換將不會(huì)對(duì)所 得分子的結(jié)合或特性具有重要影響，尤其如果置換不涉及框架位點(diǎn)內(nèi)部的氨基酸時(shí)。氨基 酸變化是否導(dǎo)致功能肽可易于通過檢定多肽衍生物的特異性活性來測(cè)定。檢定于下文中加 以詳述。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可易于制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優(yōu) 選片段或類似物的氨基和羧基-末端發(fā)生于功能結(jié)構(gòu)域的邊緣附近?？赏ㄟ^將核苷酸和/ 或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公開或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)相比較來識(shí)別結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，使 用計(jì)算機(jī)比較方法來識(shí)別發(fā)生于其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能地蛋白質(zhì)中的序列基元或預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)構(gòu)型結(jié)構(gòu)域。已知用于識(shí)別折疊為已知的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法。Bowie等 人，Science253 :164 (1991)。因此，前述實(shí)例表明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可識(shí)別可用于根據(jù) 本發(fā)明的抗體界定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的序列基元和結(jié)構(gòu)構(gòu)型。
[0153] 優(yōu)選氨基酸替換為以下替換：（1)減少對(duì)蛋白水解作用的敏感性，（2)減少對(duì)氧化 作用的敏感性，（3)改變供形成蛋白質(zhì)錯(cuò)合物的結(jié)合親和力，（4)改變結(jié)合親和力且（5)授 予或改質(zhì)這些類似物的其它物理化學(xué)或功能特性。類似物可包括除天然發(fā)生的肽序列之 外的序列的各種突變蛋白質(zhì)。例如，可在天然發(fā)生的序列（優(yōu)選為形成分子間接觸的結(jié)構(gòu) 域外部的多肽部分）中進(jìn)行單一或多重氨基酸替換（優(yōu)選為保守氨基酸替換）。保守重氨 基酸替換不應(yīng)實(shí)質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征（例如，置換氨基酸不應(yīng)破壞發(fā)生于親本序 列中的螺旋體，或干擾表征親本序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的其它類型）。在Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton 編，W. H. Freeman and Company, New York (1984))、 Introduction To Protein Structure (C. Branden 和 J. Tooze 編，Garland Publishing, New York，N.Y. (1991))和Thornton等人，Nature354 :105(1991)中描述此項(xiàng)技術(shù)識(shí)別的多肽 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例。
[0154] 如本文所用的術(shù)語"多肽片段"是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失的多 肽，但其中殘留的氨基酸序列與自（例如）全長(zhǎng)cDNA序列引出的天然發(fā)生的序列中的對(duì)應(yīng) 位置一致。片段一般為至少5、6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選為14個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)為至少20 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，通常為至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且甚至更優(yōu)為至少70個(gè)氨基酸長(zhǎng)。如本文所用的 術(shù)語"類似物"是指包含與引出的氨基酸序列的一部分實(shí)質(zhì)上一致的至少25個(gè)氨基酸片段 的多肽。類似物一般為至少20個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選為至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)且可經(jīng)常長(zhǎng)至全長(zhǎng) 的天然發(fā)生多肽。片段和類似物都是變體形式。
[0155] 肽類似物通常以類似于模板肽的特性而作為非肽藥物用于醫(yī)藥工業(yè)中。這些類型 的非肽化合物稱為"肽的模擬物"和"肽模擬物"，F(xiàn)au Chere，J. Adv. Drug Res. 15 :29(1986); Veber and Freidinger TINS，第 392 頁（1985)和 Evans 等人，J. Med. Chetn. 30 :1229 (1987)。 通常借助于計(jì)算機(jī)分子模型來研發(fā)這些化合物。結(jié)構(gòu)類似于治療用肽的肽模擬物可用于產(chǎn) 生相當(dāng)?shù)闹委熁蝾A(yù)防效果。一般而言，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與樣式多肽類似（即，具有生物化 學(xué)特性或藥理學(xué)活性的多肽），諸如人類抗體，但其中一個(gè)或一個(gè)以上肽連接子通過此項(xiàng)技 術(shù)中熟知的方法視情況由選自由 -CH2NH -、一CH2S-、-CH2_CH2-、一CH = CH-(順式和反 式）、一coch2-、一ch(oh)ch2-和-ch2so-組成的群組的連接子所置換。以相同類型的 D-氨基酸系統(tǒng)替換一個(gè)或一個(gè)以上統(tǒng)一序列的氨基酸（例如，以D-賴氨酸代替L-賴氨酸） 可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，可由此項(xiàng)技術(shù)中已知的方法產(chǎn)生包含統(tǒng)一序列或?qū)嵸|(zhì)上一 致的統(tǒng)一序列變化的限定膚（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992));例如， 通過添加可形成環(huán)化肽的分子內(nèi)雙硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基。肽的模擬物和肽模擬物都是 變體形式。
[0156] "抗體"或"抗體肽"是指完整抗體或其與供特異性結(jié)合的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)合片 段。通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶分解或化學(xué)分解來產(chǎn)生結(jié)合片段。結(jié)合片段包 括？ &134&13'、？(&13')24￥和單鏈抗體。除"雙特異性"或"雙功能"抗體之外的抗體應(yīng)理 解為其每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)一致。當(dāng)過量抗體將結(jié)合至反受體的受體量減少至少約20%、40%、 60%或80%，且更通常大于約85% (如由活體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢定所測(cè)量）時(shí)，抗體實(shí)質(zhì)上 抑制受體粘合至反受體。術(shù)語"表位"包括任何可特異性結(jié)合至免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體 或否則與分子相互作用的蛋白質(zhì)決定簇。表位簇通常由諸如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈 分子的化學(xué)活性表面群組組成，且通常具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性電荷特征。表 位可為"線性"或"構(gòu)型"。在線性表位中，蛋白質(zhì)與相互作用的分子（諸如抗體）之間的所 有相互作用點(diǎn)沿蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列線性發(fā)生。在構(gòu)型表位，相互作用點(diǎn)于彼此分離 的蛋白質(zhì)上的氨基酸上交叉發(fā)生。據(jù)說當(dāng)解離常數(shù)彡1 μ Μ，優(yōu)選彡ΙΟΟηΜ且更優(yōu)彡ΙΟηΜ，且 甚至更優(yōu)< InM時(shí)，抗體特異性結(jié)合抗原。一旦確定抗原上需要的表位，就可能例如使用本 發(fā)明所述技術(shù)產(chǎn)生對(duì)于那個(gè)表位的抗體?；蛘?，在發(fā)現(xiàn)過程中，抗體的產(chǎn)生和特征可闡明所 需表位的信息?；谶@些信息，隨后可能競(jìng)爭(zhēng)性地篩選用于結(jié)合至相同表位的抗體。一種達(dá) 到此目的的方式是進(jìn)行尋找彼此競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的抗體（例如，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至抗原的抗體）的交 叉競(jìng)爭(zhēng)研究。一種基于其交叉競(jìng)爭(zhēng)的用于"結(jié)合"抗體的高產(chǎn)量處理描述于國(guó)際專利申請(qǐng)案 第TO03/48731號(hào)。如由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的，抗體可特異性結(jié)合至的任何特定物 質(zhì)都可以是表位。表位可包含抗體結(jié)合至的那些殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，表位為EGFRvIII 表位。在一更優(yōu)實(shí)施例中，表位為本說明書實(shí)例4中所述的表位。在一個(gè)實(shí)施例中，表位為 實(shí)例14中所述的表位。在一個(gè)實(shí)施例中，表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO :59)。在 一個(gè)實(shí)施例中，表位包含序列EEKKGNYWT(SEQ ID NO :57)。在一個(gè)實(shí)施例中，表位包含序列 EKNY(SEQ ID NO :60)。在一個(gè)實(shí)施例中，表位包含序列EEKGN(SEQ ID NO :61)。所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員將了解到這些實(shí)際上不必在單肽上以此順序組合，而這些是形成與互補(bǔ)位相互作 用的表位的殘基。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所將了解的，由產(chǎn)生分子形狀的殘基或側(cè)鏈占據(jù) 的空間有助于測(cè)定表位為何。同樣，與表位相關(guān)的任何官能基、范德華相互作用、側(cè)鏈的移 動(dòng)度等都可測(cè)定表位實(shí)際上為何。因此，表位也可以包括能量互動(dòng)。
[0157] 術(shù)語"互補(bǔ)位"意味著描述測(cè)定對(duì)于表位的結(jié)合的結(jié)合區(qū)的通用結(jié)構(gòu)。這個(gè)結(jié)構(gòu)影 響結(jié)合區(qū)是否結(jié)合至表位及其結(jié)合的方式?；パa(bǔ)位可指負(fù)責(zé)抗體或其片段結(jié)合至表位簇的 抗體的抗原位點(diǎn)?；パa(bǔ)位也指抗體的獨(dú)特位，和結(jié)合至表位的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。在一個(gè)實(shí) 施例中，互補(bǔ)位是圖17中的1^110、1^230、1^350、!1120、!1240和!1360的抗體區(qū)。在一個(gè)實(shí)施 例中，互補(bǔ)位是包含實(shí)例16中用于LI、L2、L3、HI、H2和H3的⑶R序列的抗體區(qū)。在一個(gè) 實(shí)施例中，互補(bǔ)位是圖18中的L1，110、L2,130、L3,150、H1120、H2140和H3160的抗體區(qū)。 在一個(gè)實(shí)施例中，互補(bǔ)位是包含實(shí)例18中用于LI、L2、L3、HI、H2和H3的⑶R序列的抗體 區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，互補(bǔ)位包含實(shí)例18中所列的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，互補(bǔ)位包含與 表位相互作用的殘基，如圖19A和圖19B中所示。實(shí)體黑色結(jié)構(gòu)為肽結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例 中，互補(bǔ)位包含13. 1. 2mAb的殘基Tyrl72Arg。在一個(gè)實(shí)施例中，13. 1. 2mAb的互補(bǔ)位包含選 自由以下各殘基組成的群組的至少一個(gè)殘基：Tyrl72Arg、Argl01Glu、Leu99Asn、Leu99His、 Argl01Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Argl01Gln 和 Asn35Gly。如所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員所將了解的，任何抗體的互補(bǔ)位或其變體都可由本申請(qǐng)案所陳述的方式來測(cè)定。如果 殘基預(yù)測(cè)可貢獻(xiàn)10 %的結(jié)合能，就認(rèn)為殘基"重要"。在一個(gè)實(shí)施例中，如果殘基預(yù)測(cè)可貢獻(xiàn) 2%的結(jié)合能，就認(rèn)為殘基"重要"。在一個(gè)實(shí)施例中，如果殘基預(yù)測(cè)可貢獻(xiàn)50%的結(jié)合能， 就認(rèn)為殘基"重要"。在一個(gè)實(shí)施例中，如果殘基預(yù)測(cè)與表位表面或互補(bǔ)位表面相互作用，就 認(rèn)為殘基"重要"。在一個(gè)實(shí)施例中，如果改變殘基導(dǎo)致結(jié)合損失，就認(rèn)為殘基"重要"。
[0158] 術(shù)語"特異性"或"優(yōu)先"結(jié)合至，或類似措辭并不意味著表示抗體只可結(jié)合至那 個(gè)表位。相反，意思是抗體或其變體可結(jié)合至那個(gè)表位，其程度比抗體結(jié)合至抗體所暴露的 至少一種其它物質(zhì)的程度更高。在一個(gè)實(shí)施例中，特異性結(jié)合抗體將以比其至EGFR蛋白質(zhì) 更大的親和力結(jié)合至EGFRvIII蛋白質(zhì)（更緊，或較低的K D)。例如，特異性結(jié)合抗體的結(jié)合 將更緊至少增加 1 %、1-2 %、2-5 %、5-10 %、10-20 %、20-30 %、30-50 %、50-70 %、70-90 %、 90-120 %、120-150 %、150-200 %、200-300 %、300-500 %、500-1000 % 或更多。
[0159] 氨基酸，編號(hào)，氨基酸的縮寫形式，例如Leu217Gln表示編號(hào)氨基酸從第一種氨基 酸到第二種氨基酸的突變。因此，Tyrl72Arg意思是當(dāng)野生型的蛋白質(zhì)具有172位置的酪 氨酸時(shí)，突變具有172位置的精氨酸。
[0160] 本文所用的術(shù)語"藥劑"表示化合物、化合物的混合物、生物高分子或從生物物質(zhì) 形成的萃取物。
[0161] 本文所用的"哺乳動(dòng)物"指認(rèn)為是哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物。哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類。
[0162] 含有酶（木瓜蛋白酶）的抗體的消化導(dǎo)致兩種一致的抗原結(jié)合片段，也稱為 "Fab"'片段和"Fc"片段，其不具有抗原結(jié)合活性，但具有結(jié)晶能力。含有酶（胃蛋白酶） 的抗體的消化導(dǎo)致F(ab' )2片段，其中抗體分子的兩臂保持連接，且包含兩個(gè)抗原結(jié)合位 點(diǎn)。F(ab' )2片段具有交聯(lián)抗原的能力。
[0163] 本文所用的"Fv"指保持抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體的最小片段。這些片段 也可認(rèn)為是抗體的變體。
[0164] 本文所用的"Fab"指包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域的抗體片段。
[0165] 術(shù)語"mAb"指單克隆抗體。
[0166] 對(duì)于XenoMax方法產(chǎn)生的抗體序列的描述編碼如下："AB" -指抗體， "EGFRvIII " -指抗體的結(jié)合特異性，"X"指衍生自小鼠的XenoMouse，"G1" -指IgGl 同位型或"G2"_指IgG2同位型，最后三個(gè)數(shù)字指抗體自其衍生的單細(xì)胞編號(hào)，例如： AB-EGFRvIII-XGl-095為具有IgGl同位型XenoMouse小鼠對(duì)EGFRvIII的結(jié)合特異性的抗 體，且細(xì)胞編號(hào)為95。
[0167] 術(shù)語"SC"指單細(xì)胞，且特定XenoMax方法衍生的抗體可稱為SC，其后緊跟三個(gè)數(shù) 字，或只有三個(gè)數(shù)字，在本文中指抗體衍生的單細(xì)胞編號(hào)。
[0168] 對(duì)于雜交瘤衍生的抗體序列的描述編碼如下："AB"_指抗體，"EGFRvIII"-指 抗體的結(jié)合特異性，"X"指衍生自小鼠的XenoMouse, "G1" -指IgGl同位型或 "G2"-指IgG2同位型，"K"指k，"L"指λ。最后三個(gè)數(shù)字指抗體衍生的純系，例如： AB-EGFRvIII-XGlK-13. 1. 2。
[0169] 本文所用的"標(biāo)記"或"經(jīng)標(biāo)記"指對(duì)多肽添加的可檢測(cè)部分，例如，放射性同位素 標(biāo)記、螢光標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括3H、 14C、 15N、35S、9°Y、"Tc、mIn、125I、 131I，螢光標(biāo)記可包括羅丹明（rhodamine)、鑭系磷或 FITC，且 酶標(biāo)記可包括辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶。
[0170] 如本文所用的術(shù)語"醫(yī)藥劑或藥物"指當(dāng)適當(dāng)施與患者時(shí)可產(chǎn)生理想治療效果的 化合物或組合物。如由 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker，S.編， McGraw-Hill, San Francisco(1985))所例示，根據(jù)此項(xiàng)技術(shù)中的常規(guī)用法在本文中使用其 它化學(xué)術(shù)語。
[0171] 如本文所用的"實(shí)質(zhì)上純"意思是靶物質(zhì)為主要存在的物質(zhì)（即，以摩爾量計(jì)，組 合物中比任何其它個(gè)別物質(zhì)都大量存在），且優(yōu)選地，實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的部分為其中靶物質(zhì)占 存在的所有高分子物質(zhì)至少約50% (以摩爾量計(jì)）的組合物。一般而言，實(shí)質(zhì)上純的組合 物將占組合物中存在的所有高分子物質(zhì)的多于約80%，更優(yōu)多于約85%、90%、95%、99% 和99.9%。最優(yōu)地，將靶物質(zhì)純化至基本上為均質(zhì)（通過常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)不到組合物中 的污染物質(zhì)），其中組合物基本上由單高分子物質(zhì)組成。
[0172] 術(shù)語"患者"包括人類和獸醫(yī)受檢者。
[0173] 術(shù)語 " ;SLAM? Techno 1 ogy " 指 " Se 1 ected Lymphocyte Ant ibody Method"（Babcook 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，i93 :7843-7848 (1996)和 Schrader，美 國(guó)專利第5,627,052號(hào)）。
[0174] 術(shù)語"XenoMax?"指SLAM Technology 與 XenoMouse?小鼠的使用（如下文所述）。
[0175] 抗體結(jié)構(gòu)
[0176] 已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚物。每一四聚物由兩對(duì)一致的多肽鏈組成，每一 對(duì)具有一個(gè)"輕鏈"（約25kDa)和一個(gè)"重鏈"（約50-70kDa)。每一個(gè)鏈的氨基-末端部分 包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每一個(gè)鏈的羧基-末端 部分界定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人類輕鏈分類為κ和λ輕鏈。重鏈分類為μ、 δ、γ、α或ε，且將抗體的同位型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈 種可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12個(gè)或更多個(gè)氨基酸的"J"區(qū)來連接，其中重鏈也包括約10個(gè) 或更多個(gè)氨基酸的"D"區(qū)。一般見，F(xiàn)undamental Immunology第7章（Paul,W.編，第2版， Raven Press, N. Y. (1989))。每一輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。
[0177] 因此，完整抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性抗體之外，兩個(gè)結(jié)合位 點(diǎn)相同。
[0178] 這些鏈都展示由三個(gè)高變區(qū)連接的相對(duì)保守的框架區(qū)（FR)相同的通用結(jié)構(gòu)，也 稱為互補(bǔ)決定區(qū)或⑶R。每一對(duì)兩個(gè)鏈的⑶R通過框架區(qū)比對(duì)，使得可結(jié)合至特異性表 位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含F(xiàn)RI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結(jié) 構(gòu)域。每一結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配是根據(jù)Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1987 和 1991))或 Chothia & Lesk J. Mol. Bioll96 :901-917 (1987) ;Chothia 等人，Nature342 :878-883 (1989)中的定 義。
[0179] 雙特異性或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同重鏈/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人 造雜交抗體。雙特異性抗體可通過多種包括雜交瘤的融合和Fab'片段的連接的方法來產(chǎn) 生。見例如 Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990)，Kostelny 等 人，J. Immunol. 148 :1547-1553(1992)。雙特異性抗體的產(chǎn)生與常規(guī)抗體的產(chǎn)生相比可為 相對(duì)勞動(dòng)密集型的工藝，而且雙特異性抗體的產(chǎn)量和純度通常較低。雙特異性抗體不以具 有單結(jié)合位點(diǎn)片段的形式存在（例如，F(xiàn)ab、Fab'和Fv)。除了抗體的通用結(jié)構(gòu)方面之外， 互補(bǔ)位和表位之間的更特異相互作用可通過結(jié)構(gòu)方式來檢驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，CDR結(jié)構(gòu) 形成互補(bǔ)位，抗體經(jīng)其可結(jié)合至表位。這種互補(bǔ)位的結(jié)構(gòu)可通過多種方式來測(cè)定?？墒褂?傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)方法，諸如NMR或X-射線晶體學(xué)。這些方法可檢驗(yàn)單獨(dú)互補(bǔ)位，或當(dāng)其結(jié) 合至表位時(shí)的結(jié)構(gòu)。或者，分子模型可在計(jì)算機(jī)模擬中產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)可借助于市售的封裝，諸 如Accelrys(San Diego, CA)的Insightll模型封裝，通過同系模型產(chǎn)生。簡(jiǎn)而言之，可利 用檢驗(yàn)抗體序列來尋求已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)，諸如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank)。在識(shí)別具有已知結(jié)構(gòu)的同系蛋白質(zhì)之后，這些同系蛋白質(zhì)可用作模型模板。每一種 可能模板可經(jīng)比對(duì)，由此產(chǎn)生這些模板中基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)。隨后可將具有未知結(jié)構(gòu)的 抗體序列與這些模板比對(duì)以產(chǎn)生具有未知結(jié)構(gòu)抗體的分子模型。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 將了解的，存在多種在計(jì)算機(jī)模擬中產(chǎn)生所述結(jié)構(gòu)的替代方法，可使用其中任何一種。例 如，可使用類似于Hardman等人，頒布的采用QUANTA (Polygen Corp.，Waltham, Mass.)和 CHARM(Brooks, B. R. , Bruccoleri, R. Ε· , Olafson, B. D. , States, D. J. , Swaminathan, S.和 Karplus，M.，1983, J. Comp. Chem, · 4 :187)的美國(guó)專利第 U. S. Pat. No. 5, 958, 708 號(hào)中所述 工藝的工藝。
[0180] 不但互補(bǔ)位的形狀對(duì)于測(cè)定可能互補(bǔ)位是否結(jié)合至表位及其良好程度很重要，而 且表位和互補(bǔ)位之間的相互作用本身是設(shè)計(jì)變體抗體的大量信息來源。如所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員將了解的，存在多種研究這種相互作用的方式。一種方式是使用可能如上文所述產(chǎn)生 的結(jié)構(gòu)模型，且隨后使用諸如InsightII(Accelrys，SanDiego, CA)的程序，其具有一個(gè)可 對(duì)互補(bǔ)位和其表位之間的構(gòu)型和定位空間進(jìn)行Monte Carlo研究的擴(kuò)展模塊。結(jié)果是可評(píng) 估表位和互補(bǔ)位相互作用的地點(diǎn)和方式。在一個(gè)實(shí)施例中，只有表位的片段或變體用于協(xié) 助測(cè)定相關(guān)的相互作用。在一個(gè)實(shí)施例中，整個(gè)表位用于互補(bǔ)位和表位之間相互作用的建 模。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，這兩種不同方法具有不同的優(yōu)點(diǎn)和不足。例如，僅使 用表位片段使得可對(duì)每一側(cè)鏈的可能變體進(jìn)行更為詳盡的檢驗(yàn)，而無需耗費(fèi)大量時(shí)間。另 一方面，通過僅使用表位片段，或僅使用表位代替整個(gè)蛋白質(zhì)，表位片段的特征與整個(gè)表位 的特征可能不同，因此可能增加在計(jì)算建模過程中誤導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，以有限程 度使用兩種方法以交叉檢查結(jié)果。在一優(yōu)選實(shí)施例中，如果使用表位變體，可最優(yōu)化以便表 位變體包含表位的最重要?dú)埢Ｗ钪匾獨(dú)埢囊恢滦钥赏ㄟ^多種方式測(cè)定，例如如本發(fā)明 實(shí)例4和14中所述。
[0181] 通過使用這些產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，可測(cè)定哪些殘基在表位和互補(bǔ)位之間的相互作用中最 重要。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，可易于選擇改變哪些殘基來改變抗體的結(jié)合特征。例如，從 擴(kuò)展模型顯而易見，表位中某些殘基的側(cè)鏈可在空間上阻止表位的結(jié)合，由此將這些殘基 改變?yōu)榫哂休^小側(cè)鏈一致的殘基。
[0182] 這可以多種方式來測(cè)定。例如，只需觀察兩個(gè)模型來評(píng)估基于官能基和鄰近基團(tuán) 的相互作用。或者，如上文所述，可進(jìn)行表位和互補(bǔ)位的重復(fù)組對(duì)，以獲得更為有利的能量 相互作用。也可測(cè)定多種抗體變體的這些相互作用來測(cè)定其中抗體可結(jié)合至表位的替代方 式。也可將各種模型組合來測(cè)定如何改變抗體結(jié)構(gòu)來獲得具有所需特定特征的抗體。
[0183] 上述測(cè)定的模型可通過各種技術(shù)來測(cè)試。例如，相互作用能可由上文討論的程序 來測(cè)定以決定需進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)姆N變體。又，使用庫(kù)侖和范德華相互作用來測(cè)定表位和變體 互補(bǔ)位的相互作用能。也使用針對(duì)突變的位點(diǎn)來觀察抗體結(jié)構(gòu)中的預(yù)定變化實(shí)際上是否可 導(dǎo)致結(jié)合特征的所需變化?；蛘撸筛淖儽砦粊碜C實(shí)模型正確或用于測(cè)定可能在互補(bǔ)位和 表位之間發(fā)生的一般結(jié)合主題。
[0184] 上述用于建模結(jié)構(gòu)的方法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的何種變化將導(dǎo)致抗體的特 定所需特征。這些方法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的何種變化不會(huì)導(dǎo)致抗體的所需特征。
[0185] 如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，盡管這些模型將為形成本發(fā)明的抗體及其變體 提供必要的向?qū)?，但仍需要進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬模型中的常規(guī)測(cè)試，可能通過活體外研究。此 夕卜，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，任何改質(zhì)也會(huì)對(duì)抗體活性具有另外的副效應(yīng)。例如， 盡管預(yù)期導(dǎo)致更大結(jié)合的改變可引起更大的結(jié)合，也可引起其它會(huì)減少或改變抗體活性的 結(jié)構(gòu)變化。對(duì)于是否為這種情況的測(cè)定在所屬領(lǐng)域中很常見，而且可通過多種方式來進(jìn)行 測(cè)定。例如，如實(shí)例21中，活性可通過ELISA測(cè)試來測(cè)試?；蛘?，可以通過使用表面等離子 體共振裝置來測(cè)試樣品。
[0186] 抗體結(jié)合和供優(yōu)自結(jié)合的奪體抗體
[0187] 在一個(gè)實(shí)施例中，上述模型用于增加抗體對(duì)其表位的結(jié)合能力。抗體可更易于結(jié) 合至表位，且因此具有較高的締合常數(shù)（k a)?；蛘?，抗體可較慢自表位離解，且因此具有較 低的離解常數(shù)（kd)，或表位-互補(bǔ)位的k d值較小，因此使得表位和互補(bǔ)位之間的結(jié)合程度 更高。
[0188] 在某些實(shí)施例中，設(shè)計(jì)變體抗體以相反特征結(jié)合。即，抗體不緊密結(jié)合或可能不快 速結(jié)合。
[0189] 在其它實(shí)施例中，變體抗體的KD與野生型的抗體不同，但變體抗體對(duì)于特定表位 更具特異性。這意味著經(jīng)設(shè)計(jì)抗體的互補(bǔ)位具有較低結(jié)合至其它表位的風(fēng)險(xiǎn)?？贵w可具有 已改變的其它特征。例如，變體對(duì)非特異性抗體結(jié)合更具免疫性，或即使當(dāng)抗體以高濃度存 在時(shí)，在溶液中仍保持溶劑化。這種變體可存在于所討論的抗體中。例如，盡管下文檢驗(yàn)的 某些變體抗體的較高濃度導(dǎo)致了 Biacore實(shí)驗(yàn)中較慢的結(jié)合組分（例如，13. 1. 2mAb)，但某 些變體即使在相同濃度下仍不展示所述較慢組分，例如L217N-2. 1?？尚纬捎缮衔臏y(cè)定的模 型預(yù)測(cè)的變體，且隨后經(jīng)測(cè)試來測(cè)定其實(shí)際上是否以所需特征結(jié)合?？蛇x擇與表位具有較 大總相互作用能的突變體以供進(jìn)一步測(cè)試。相互作用能可以多種方式測(cè)定，其中之一如上 文所述。
[0190] 這些變體可以多種方式測(cè)試。示范性的選擇包括，而且不限于KinExA(例如， Lackie 頒布的專利第 5, 372, 783 號(hào)，1994 年 12 月 13 日）（Sapidyne Instruments Inc.，ID， Boise)、表面等離子體共振（SPR) (e. g.，BIACORETM Biacore，Inc.，Pistcataway，N. J.)、停 流螢光、共振鏡和螢光偏振。許多這些選擇不但可以記錄數(shù)據(jù)，而且可以提供用于將數(shù)據(jù)擬 合為各種理論曲線并由此測(cè)定k a、k<^PKD以及其它特性的現(xiàn)成構(gòu)件。重要的是，應(yīng)注意到 這些曲線擬合為結(jié)果數(shù)據(jù)并不排除存在一些偏差的可能性。因此，相關(guān)的締合、離解和平衡 常數(shù)不但可以通過這些曲線擬合機(jī)理來觀察，也可以根據(jù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的知識(shí)直接 相互比較。
[0191] 人類抗體和抗體的人源化
[0192] 人類抗體避免了與具有鼠科或大鼠可變和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問題。這些鼠 科或大鼠衍生蛋白質(zhì)的存在可導(dǎo)致抗體的快速清除或可導(dǎo)致抵抗患者體內(nèi)抗體的免疫反 應(yīng)的產(chǎn)生。為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，可通過將人類抗體功能引入嚙齒動(dòng)物以便于 嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生完全人類抗體來產(chǎn)生完全人類抗體。
[0193] 克隆和重構(gòu)YAC中兆堿基尺寸的人類基因座及將其引入小鼠種系的能力為說明 極大或經(jīng)原始映射的基因座的功能組分以及產(chǎn)生人類疾病的有用模型提供了有力途徑。此 夕卜，使用這種技術(shù)將小鼠基因座替換為其人類等效物可為發(fā)育期間的人類基因產(chǎn)物的表達(dá) 和調(diào)節(jié)、它們與其它系統(tǒng)的信息傳遞及其在疾病誘發(fā)和進(jìn)展中的關(guān)聯(lián)提供獨(dú)特見解。
[0194] 這種策略的重要實(shí)際應(yīng)用是小鼠體液免疫系統(tǒng)的"人源化"。將人類免疫球蛋白 (Ig)基因座引入內(nèi)源Ig基因已失活的小鼠中提供機(jī)會(huì)來研究抗體的程序化表達(dá)和組合及 其在B-細(xì)胞發(fā)育中的作用中的潛在機(jī)理。此外，這種策略可為產(chǎn)生完全人類單克隆抗體 (mAb)_ -種在人類疾病種實(shí)現(xiàn)抗體治療前景的重要里程碑提供理想來源。預(yù)期完全人類抗 體可將免疫和過敏反應(yīng)本質(zhì)最小化為小鼠或小鼠衍生mAb，且因此增加了經(jīng)投予抗體的功 效和安全性。使用完全人類抗體預(yù)期可為治療慢性和復(fù)發(fā)性人類疾病提供實(shí)質(zhì)好處，諸如 炎癥、自身免疫力和癌癥，這些都需要反復(fù)投予抗體。
[0195] 一種針對(duì)這個(gè)目的的方法是設(shè)計(jì)不足以用于具有人類Ig基因座大片段的小鼠抗 體生產(chǎn)的小鼠品系，以預(yù)期這些小鼠可在無小鼠抗體的情況下產(chǎn)生人類抗體的大指令系 統(tǒng)。大的人類Ig片段可保持大的可變基因多樣性以及對(duì)抗體生產(chǎn)和表達(dá)的合適調(diào)節(jié)。通 過采用用于抗體多樣化和選擇的小鼠工具和對(duì)于人類蛋白質(zhì)免疫耐受性的缺乏，這些小鼠 品系中再現(xiàn)的人類抗體指令系統(tǒng)應(yīng)產(chǎn)生對(duì)于任何感興趣的抗原（包括人類抗原）都具有高 親和力的抗體。使用雜交瘤技術(shù)，可易于生產(chǎn)和選擇具有所需特異性的抗原-特異性人類 mAb。如1994年所公開的，結(jié)合第一代XenoMouse品系表明這種一般策略（見Green等人， Nature Genetics7 :13-21 (1994))。XenoMouse品系設(shè)計(jì)為具有分別含有人類重鏈基因座和 κ輕鏈基因座的245kb和190kb大小的種系構(gòu)型片段的酵母人工染色體（YAC)，其含有核 可變核恒定區(qū)序列Id。含有YAC的人類Ig經(jīng)證明與供抗體重排和表達(dá)的小鼠系統(tǒng)相容且 可替換為失活的小鼠 Ig基因。這可由其誘發(fā)B-細(xì)胞發(fā)育、產(chǎn)生完全人類抗體的類似成人 的人類指令系統(tǒng)和產(chǎn)生抗原-特異性人類mAb能力來證實(shí)。這些結(jié)果也表明，引入含有較 大編號(hào)V基因的人類Ig基因座的較大部分、另外的調(diào)節(jié)元素和人類Ig恒定區(qū)可實(shí)質(zhì)上概 括完整指令系統(tǒng)，其以對(duì)于感染和免疫的人類體液反應(yīng)為特征。Green等人的著作最近由引 入大于約80%的人類抗體指令系統(tǒng)擴(kuò)展至分別引入兆堿基大小的人類重鏈基因座和κ輕 鏈基因座的種系構(gòu)型YAC片段。見Mendez等人，Nature Geneticsl5 :146-156(1997)和美 國(guó)專利申請(qǐng)案第08/759, 620號(hào)，申請(qǐng)于1996年12月3日。
[0196] XenoMouse小鼠的產(chǎn)生于以下專利中進(jìn)一步討論和敘述：美國(guó)專利申請(qǐng)案第 07/466, 008號(hào)，申請(qǐng)于1990年1月12日；第07/610, 515號(hào)，申請(qǐng)于1990年11月8日；第 07/919, 297號(hào)，申請(qǐng)于1992年7月24日，第07/922, 649號(hào)，申請(qǐng)于1992年7月30日；第 08/031,801號(hào)，申請(qǐng)于1993年3月15日；第08/112,848號(hào)，申請(qǐng)于1993年8月27日；第 08/234, 145號(hào)，申請(qǐng)于1994年4月28日；第08/376, 279號(hào)，申請(qǐng)于1995年1月20日； 第08/430,938號(hào)，申請(qǐng)于1995年4月27日；第08/464, 584號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日； 第08/464, 582號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日；第08/463,191號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日； 第08/462, 837號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日；第08/486, 853號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日； 第08/486, 857號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日；第08/486, 859號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日；第 08/462, 513號(hào)，申請(qǐng)于1995年6月5日；第08/724, 752號(hào)，申請(qǐng)于1996年10月2日和第 08/759, 620號(hào)，申請(qǐng)于1996年12月3日和美國(guó)專利第6,162, 963號(hào)、第6,150, 584號(hào)、第 6,114, 598 號(hào)、第 6, 075,181 號(hào)和第 5, 939, 598 號(hào)和日本專利第 3068180B2 號(hào)、第 3068506B2 號(hào)和第 3068507B2 號(hào)。也可見 Mendez 等人，Nature Geneticsl5 :146-156(1997)和 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495 (1998) 〇
[0197] 也可見歐洲專利第EP0463151B1號(hào)，于1996年6月12日授權(quán)公開，國(guó)際專利申 請(qǐng)案第W094/02602號(hào)，于1994年2月3日公開，國(guó)際專利申請(qǐng)案第W096/34096號(hào)，于 1996年10月31日公開，第TO98/24893號(hào)，于1998年6月11日公開，第TO00/76310號(hào)， 于2000年12月21日公開，第W003/47336號(hào)。在另一種方法中，其它公司，包括GenPharm International公司已使用"微基因座"方法。在微基因座方法中，外源Ig基因座通過包 含來自Ig基因座的物質(zhì)（個(gè)別基因）來模仿。因此，一種或一種以上V H基因、一種或一 種以上DH基因、一種或一種以上JH基因、μ恒定區(qū)和第二恒定區(qū)（優(yōu)選為Y恒定區(qū)）形 成為用于插入動(dòng)物體內(nèi)的構(gòu)造。這種方法描述于以下專利中：Surani等人的美國(guó)專利第 5, 545, 807號(hào)和每一專利都屬于Lonberg和Kay的美國(guó)專利第5, 545, 806號(hào)、第5, 625, 825 號(hào)、第 5, 625,126 號(hào)、第 5, 633, 425 號(hào)、第 5, 661,016 號(hào)、第 5, 770, 429 號(hào)、第 5, 789, 650 號(hào)、 第 5, 814, 318 號(hào)、第 5, 877, 397 號(hào)、第 5, 874, 299 號(hào)和第 6, 255, 458 號(hào)，Krimpenfort 和 Berns的美國(guó)專利第5, 591，669號(hào)和第6, 023. 010號(hào)，Berns等人的美國(guó)專利第5, 612, 205 號(hào)、第5, 721，367號(hào)和5, 789, 215號(hào)，及Choi和Dunnand的美國(guó)專利第5, 643, 763號(hào)，以及 GenPharm International美國(guó)專利申請(qǐng)案第07/574, 748號(hào)，申請(qǐng)于1990年8月29日、第 07/575, 962號(hào)，申請(qǐng)于1990年8月31日、第07/810, 279號(hào)，申請(qǐng)于1991年12月17日、第 07/853, 408號(hào)，申請(qǐng)于1992年3月18日、第07/904, 068號(hào)，申請(qǐng)于1992年6月23日、第 07/990, 860號(hào)，申請(qǐng)于1992年12月16日、第08/053,131號(hào)，申請(qǐng)于1993年4月26日、第 08/096, 762號(hào)，申請(qǐng)于1993年7月22日、第08/155, 301號(hào)，申請(qǐng)于1993年11月18日、第 08/161，739號(hào)，申請(qǐng)于1993年12月3日、第08/165, 699號(hào)，申請(qǐng)于1993年12月10日、第 08/209, 741號(hào)，申請(qǐng)于1994年3月9日。也可見歐洲專利第0546073B1號(hào)，國(guó)際專利申請(qǐng)案 W092/03918、TO92/22645、TO92/22647、TO92/22670、TO93/12227、TO94/00569、TO94/25585、 W096/14436、W097/13852 和 W098/24884 及美國(guó)專利第 5, 981，175 號(hào)。進(jìn)一步見 Taylor 等 人，1992年；Chen等人，1993年；Tuaillon等人，1993年；Choi 等人，1993年；Lonberg等人， (1994) ;Taylor 等人，（1994)和 Tuaillon 等人，（1995) ;Fishwild 等人，（1996)。
[0198] Kirin也已表明自小鼠中產(chǎn)生人類抗體，其中已通過微細(xì)胞融合引入大片染色體 或整個(gè)染色體。見歐洲專利申請(qǐng)案第773288號(hào)和第843961號(hào)。Xenerex Biosciences正 在研發(fā)一種用于潛在產(chǎn)生人類抗體的技術(shù)。在這種技術(shù)中，以人類淋巴細(xì)胞（例如，B和/ 或T細(xì)胞）重新構(gòu)成SCID小鼠。小鼠隨后經(jīng)抗原免疫，且可產(chǎn)生對(duì)抗抗原的免疫反應(yīng)。見 美國(guó)專利第5, 476, 996號(hào)、第5, 698, 767號(hào)和第5, 958, 765號(hào)。
[0199] 人類抗-小鼠抗體（HAMA)反應(yīng)已將工業(yè)生產(chǎn)導(dǎo)向制備嵌合或其它人源化抗體。盡 管嵌合抗體具有人類恒定區(qū)和鼠科可變區(qū)，仍希望可觀察到某些人類抗-嵌合抗體（HACA) 反應(yīng)，尤其在抗體的慢性或多-劑量使用中。因此，為了使HAMA或HACA反應(yīng)的考慮和/或 影響失效，仍希望提供對(duì)抗EGFRvIII的完整人類抗體。
[0200] 抗體治療
[0201] 如本文所述，EGFRvIII抗體的功能似乎對(duì)其操作模式的至少一部分很重要。例如， 就功能而言，意思是EGFRvIII抗體在以EGFRvIII操作中的活性。因此，在某些方面，希望結(jié) 合作為對(duì)抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產(chǎn)生，抗體可固定補(bǔ)充物并補(bǔ)充細(xì)胞毒性淋 巴細(xì)胞，由此參與到CDC和ADCC中。存在多種具有相同功能的抗體同位型，包括（但不限 于）以下：鼠科IgM、鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、人類IgM、人類IgGl、人類IgG3和人 類IgA。又，希望結(jié)合作為對(duì)抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產(chǎn)生，抗體可通過Fc受體 接合于諸如自然殺手（NK)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞來活化依賴抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)（ADCC)。存 在多種可ADCC的抗體同位型，包括（但不限于）以下：鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、 人類IgGl和人類IgG3。應(yīng)了解，產(chǎn)生的抗體不必一開始就具有這種同位型，但是相反地，產(chǎn) 生的抗體可具有任何同位型且抗體可為隨后使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)換的同位 型。這些技術(shù)包括使用直接重組技術(shù)（例如，見美國(guó)專利第4, 816, 397號(hào)）和細(xì)胞-細(xì)胞 融合技術(shù)（例如，見美國(guó)專利第5, 916, 771號(hào)和第6, 207, 418號(hào)）。
[0202] 在細(xì)胞-細(xì)胞技術(shù)中，制備具有含有任何所需同位型的重鏈的骨髓瘤或其它細(xì)胞 株和另一種具有輕鏈的骨髓瘤或其它細(xì)胞株。隨后這些細(xì)胞可經(jīng)融合，且可分離表達(dá)細(xì)胞 株的完整抗體。
[0203] 例如，本文討論的某些抗-EGFRvIII抗體為人類抗-EGFRvIII IgGl抗體。如果這 種抗體具有對(duì)EGFRvIII分子的所需結(jié)合，同位型應(yīng)易于轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生人類IgM、人類IgG3或 人類IgGA，盡管仍具有相同的可變區(qū)（其界定了抗體的特異性及其某些親和力）。這些分 子（包括IgGl)隨后將可固定補(bǔ)充物并參與CDC，且如果包含IgGl或IgG3恒定區(qū)，這些分 子也將可通過補(bǔ)充細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞參與依賴抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)（ADCC)。
[0204] 因此，由于產(chǎn)生了達(dá)到上文所述所需"結(jié)構(gòu)"屬性的抗體候選物，因此，其通常通過 同位型轉(zhuǎn)換可具有至少某些所需"功能"屬性。其它治療的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生
[0205] 基于本文中關(guān)于EGFRvIII產(chǎn)生和表征的抗體活性，促進(jìn)了除抗體部分之外的其 它治療形態(tài)的設(shè)計(jì)。
[0206] 這些形態(tài)包括（但不限于）高級(jí)抗體療法（諸如雙特異性抗體、免疫毒素和放射 性同位素標(biāo)記的療法）、肽療法的產(chǎn)生、基因療法，尤其為內(nèi)抗體、抗致敏療法和小分子。
[0207] 例如，結(jié)合高級(jí)抗體療法的產(chǎn)生，其中補(bǔ)充物固定和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的補(bǔ)充為 理想屬性，可能通過使用雙特異性、免疫毒素或放射性同位素標(biāo)記來增強(qiáng)細(xì)胞殺死。
[0208] 例如，結(jié)合雙特異性抗體，可產(chǎn)生包含以下的雙特異性抗體：（i)兩種抗體，一種 具有對(duì)EGFRvIII的特異性且另一種具有對(duì)結(jié)合在一起的第二種分子的特異性；（ii) 一 條鏈對(duì)EGFRvIII具有特異性且第二條鏈對(duì)第二種分子具有特異性的單抗體；或（iii)對(duì) 于EGFRvIII和另一種分子具有特異性的單鏈抗體。這些雙特異性抗體可使用熟知技術(shù)產(chǎn) 生，例如，結(jié)合（i)和（ii)，例如見 Immunol Methods4 :72-81 (1994)和上述的 Wright and Harris，及結(jié)合（iii)，例如見 Traunecker 等人，Int.J. Cancer(Suppl. )7 :51-52(1992)。 在每一種情況下，第二種特異性可賦予Fc鏈活化受體，包括（但不限于）CD16或CD64 (例 如見，Deo 等人，18 :127 (1997) )、CD3 (Micromet ' s BiTE 技術(shù)）或 CD89 (例如見，Valerius 等人，Bl〇〇d90 :4485-4492(1997))。根據(jù)前述制備的雙特異性抗體可能殺死表達(dá)EGFRVIII 的細(xì)胞，且尤其是其中本發(fā)明的EGFRvIII抗體有效的那些細(xì)胞。
[0209] 結(jié)合免疫毒素，抗體可使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的技術(shù)改質(zhì)而作為免疫毒素。
[0210] 例如見 Vitetta Immunol Todayl4 :252(1993)。也例如見美國(guó)專利第 5,194, 594 號(hào)。結(jié)合制備放射性同位素標(biāo)記的抗體，這些經(jīng)改質(zhì)抗體也可易于使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知 的技術(shù)來制備。例如見 Junghans 等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy655_686 中 (第 2 版，Chafner and Longo 編，Lippincott Raven (1996))。也見美國(guó)專利第 4, 681，581 號(hào)、第 4, 735, 210 號(hào)、第 5,101,827 號(hào)、第 5,102, 990 號(hào)（RE35, 500)、第 5, 648, 471 號(hào)和第 5, 697, 902號(hào)。每一種免疫毒素和放射性同位素標(biāo)記的分子都可能殺死表達(dá)EGFRvIII的細(xì) 胞，且尤其是其中本文所述抗體有效的那些細(xì)胞。
[0211] 可設(shè)計(jì)抗體更快速結(jié)合，或更慢自表位離解，且因此可將抗體本身設(shè)計(jì)為治療劑。 例如，抗體的經(jīng)改變特征可用于對(duì)患者投予治療劑。治療免疫偶聯(lián)物
[0212] 如所了解的，與藥物、毒素或其它分子（免疫偶聯(lián)物或免疫毒素）結(jié)合的抗體在定 靶殺死表達(dá)可通過特異性結(jié)合分子（諸如抗體）特異性結(jié)合的分子的細(xì)胞中極為有用。如 上文所述，尚未已知在任何正常組織上表達(dá)過EGFRvIII。此外，EGFRvIII顯示顯著表達(dá)于 多種人類腫瘤中。因此，EGFRvIII是用于以免疫毒素定靶的最受矚目的分子。
[0213] 已出現(xiàn)許多關(guān)于試圖特異性定靶具有單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的腫瘤細(xì)胞的報(bào) 導(dǎo)（Sela 等人，Immunoconjugatesl89_216 中（C. Vogel，ed. 1987) ;Ghose 等人，Targeted Drugsl-22 中（E. Goldberg 編，1983 年）；Diener 等人，Antibody Mediated Delivery Systemsl-23 中（J. Rodwell 編，1988 年）；Pietersz 等人，Antibody Mediated Delivery Systems25_53 中（J.Rodwell 編，1988 年）；Bumol 等人，Antibody Mediated Delivery Systems55-79中（J. Rodwell編，1988年））。細(xì)胞毒素藥物，諸如氨甲喋呤、柔紅霉素、 阿霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、美法侖（melphalan)、絲裂霉素 C和苯丁酸氮芥已與多種鼠 科單克隆看體結(jié)合。在某些情況下，通過中間體載劑分子將藥物分子連接至抗體分子， 這些中間體載劑分子諸如血白蛋白（Garnett等人，Cancer Res. 46:2407-2412(1986); Ohkawa 等人，Cancer Immumol. Tmmunother. 23 :81-86 (1986) ;Endo 等人，Cancer Res. 47 : 1076-1080 (1980))、右旋糖酐（Hurwitz 等人，Appl.Biochem. 2 :25-35(1980) ;Manabi 等人， Biochem. Pharmacol. 34 :289-291 (1985) ;Dillman等人，Cancer Res. 46 :4886-4891 (1986); Shoval 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :8276-8280 (1988))或多聚谷氨酸（Tsukada 等人， J. Natl. Cane. Inst. 73 :721-729 (1984) ;Kato 等人，J. Med. Chem. 27 :1602-1607 (1984); Tsukada 等人，Br. J. Cancer52 :111-116 (1985))。
[0214] 已采用多種連接子技術(shù)以用于制備這些免疫偶聯(lián)物，且已研究了可離解和不可離 解連接子。然而，在大部分情況下，如果藥物分子可從在定靶位點(diǎn)為非改質(zhì)形式的偶聯(lián)物釋 放出來，就只能觀察到藥物的完全細(xì)胞毒性潛能。
[0215] 已用于制備抗體-藥物偶聯(lián)物的可離解連接子之一為基于順-丙烯三羧酸的 酸-不穩(wěn)定連接子，其利用不同細(xì)胞內(nèi)間隔的酸性環(huán)境，諸如在受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用中遇 到的內(nèi)體和溶酶體。Shen和Ryser引入這種方法來制備柔紅霉素與大分子載劑的偶聯(lián)物 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102 :1048-1054 (1981))。Yang 和 Reisfeld 使用相同技 術(shù)將柔紅霉素偶聯(lián)至抗-黑素瘤抗體（J. Natl. Cane. Inst. 80:1154-1159(1988))。近來， Dillman等人也使用酸不穩(wěn)定連接子以類似方式制備柔紅霉素與抗-T細(xì)胞抗體的偶聯(lián)物 (Cancer Res. 48 :6097-6102 (1988))。
[0216] 由Trouet等人研究的另一種方法涉及將柔紅霉素經(jīng)肽空間臂連接至抗體（Proc. Natl. Acad. Sci. 79 :626-629 (1982))。這是在通過溶菌酶肽酶的作用無藥物從這種偶聯(lián)物 中釋放出來的前提下進(jìn)行的。
[0217] 然而，在活體外細(xì)胞毒性測(cè)試中已揭示，抗體-藥物偶聯(lián)物很少達(dá)到與自由非 偶聯(lián)藥物相同的細(xì)胞毒性效能。這表明，藥物分子從抗體釋放出來的機(jī)理效率很差。在 免疫毒素的范圍內(nèi)，經(jīng)單克隆抗體與催化活性蛋白質(zhì)毒素之間的雙硫橋形成的偶聯(lián)物 顯示比含有其它連接子的偶聯(lián)物更具細(xì)胞毒性。見，Lambert等人，J. Biol. Chem. 260 : 12〇35_12〇41 (l985) ;Lambert 等人，Immunotoxinsl75_2〇9 中（A. Frankel 編，I988); Ghetie等人，Cancer Res. 48 :2610-2617(1988)。這歸因于對(duì)抗體分子與毒素之間的雙硫 鍵的有效離解有利的谷胱甘肽的高細(xì)胞內(nèi)濃度。盡管如此，僅有少量關(guān)于使用雙硫橋制 備藥物和大分子之間的偶聯(lián)物的報(bào)導(dǎo)實(shí)例。Shen等人描述了氨甲喋呤轉(zhuǎn)化為巰乙基酰胺 衍生物，繼而經(jīng)雙硫鍵與聚-D-賴氨酸偶聯(lián)（J. Biol. Chem. 260 :10905-10908 (1985))。此 夕卜，一報(bào)導(dǎo)描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢霉素與抗體的偶聯(lián)物的制備（Menendez等 Α? Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract81 (1989))。另一報(bào)導(dǎo)描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢霉素 與抗體的偶聯(lián)物的制備（Hinman 等人，53Cancer Res. 3336-3342(1993))。
[0218] 缺少二硫化物連接的抗體-藥物偶聯(lián)物的一個(gè)原因是帶有含有可易于用于將藥 物經(jīng)二硫化物橋連接至抗體的部分的硫原子的細(xì)胞毒素藥物的不可利用性。此外，現(xiàn)存藥 物在其細(xì)胞毒性潛能不減少的情況下，其難于進(jìn)行化學(xué)改質(zhì)。
[0219] 現(xiàn)存抗體-藥物偶聯(lián)物的另一主要不足在于因?yàn)橛邢迶?shù)目的定靶抗原及靜止癌 藥物（如氨甲喋呤、柔紅霉素和長(zhǎng)春新堿）的相對(duì)適度細(xì)胞毒性，其不能將足夠濃度的藥物 傳遞到定靶位點(diǎn)。為了達(dá)到顯著的細(xì)胞毒性，有必要將大量的藥物分子直接或通過聚合載 劑分子連接至抗體。然而，這些高度改質(zhì)的抗體通常展示出對(duì)于定靶抗原削弱的結(jié)合且快 速?gòu)难髦谢铙w內(nèi)清除。
[0220] Maytansinoid為高度細(xì)胞毒素藥物。美登素首先由Kupchan等人自東非灌木齒 葉美登木中分離，且其顯示比常規(guī)癌癥化學(xué)治療劑（如氨甲喋呤、柔紅霉素和長(zhǎng)春新堿） 大100到1000倍的細(xì)胞毒性（美國(guó)專利第3, 896, 111號(hào)）。后來發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生 maytansinoid，諸如異戊酸美登素酯和異戊酸美登素酯的C-3酯（美國(guó)專利第4,151，042 號(hào)）。也已報(bào)導(dǎo)異戊酸美登素酯的合成C-3酯和異戊酸美登素酯的類似物（Kupchan等人， J. Med. Chem. 21 :31-37(1978) ;Higashide 等人，Nature270 :721-722(1977) ;Kawai 等人， Chem. Pharm. Bull. 32 :3441-3451 (1984))。C-3酯由其制備的異戊酸美登素酯的類似物的 實(shí)例包括芳族環(huán)上（例如，脫氯）或在C-9、C-14(例如，羥基化甲基）、C-15、C-18、C-20和 C-4, 5處經(jīng)改質(zhì)的異戊酸美登素酯。
[0221] 天然發(fā)生和合成C-3酯可分為兩個(gè)群組：
[0222] (a)具有簡(jiǎn)單羧酸的C-3酯（美國(guó)專利第4,248,870號(hào)、第4,265,814號(hào)、第 4,308,268 號(hào)、第 4,308,269 號(hào)、第 4,309,428 號(hào)、第 4,317,821 號(hào)、第 4,322,348 號(hào)和第 4, 331，598 號(hào)）和
[0223] (b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯（美國(guó)專利第4,137, 230號(hào)、第 4, 260, 608 號(hào)、第 5, 208, 020 號(hào)和 Chem. Pharm. Bull. 12 :3441 (1984))。
[0224] 發(fā)現(xiàn)群組（b)的酯的細(xì)胞毒性比群組（a)的酯的細(xì)胞毒性大得多。
[0225] 美登素為有絲分裂抑制劑。已報(bào)導(dǎo)以美登素活體內(nèi)處理L1210細(xì)胞導(dǎo)致67%的細(xì) 胞聚集于有絲分裂中。已報(bào)導(dǎo)未經(jīng)處理的比對(duì)細(xì)胞顯示3. 2%至5. 8%之間的有絲分裂指 數(shù)（Sieber 等人，^Comparative Leukemia Researchl975, Bibl. Haemat. 495_5〇0(1976))。 海膽卵和蛤蜊卵的實(shí)驗(yàn)已表明，美登素通過抑制微管蛋白質(zhì)（微管蛋白）的聚合干擾微管 形成來抑制有絲分裂（Remillard 等人，Sciencel89 :1002-1005(1975))。
[0226] 活體外，已發(fā)現(xiàn)以K^toKTyg/l·! 1劑量的美登素即可抑制P388、L1210和 LY5178鼠科白血病細(xì)胞懸浮液，其中P388細(xì)胞株最敏感。也已顯示美登素是人類鼻 咽癌細(xì)胞活體外生長(zhǎng)的活性抑制劑，且報(bào)導(dǎo)人類急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM可 由低至 lCT7mg/ml 的濃度抑制（Wolpert-DeFillippes 等人，Biochem. Pharmacol. 24 : 1735-1738(1975))。
[0227] 活體內(nèi)，美登素也顯示具有活性。顯示在50至100倍劑量范圍內(nèi)抑制P388淋 巴母細(xì)胞白血病系統(tǒng)的腫瘤生長(zhǎng)，這表明具有高治療指數(shù)；L1210小鼠白血病系統(tǒng)、人類 Lewis肺癌系統(tǒng)和人類B-16黑素癌系統(tǒng)也顯示顯著抑制活性（Kupchan，Ped. Proc. 33 : 2288-2295(1974))。
[0228] 目前偶聯(lián)maytansinoids和細(xì)胞結(jié)合劑（諸如抗體）的方法包括兩個(gè)反應(yīng)步 驟。首先將細(xì)胞結(jié)合劑（例如抗體）以交聯(lián)試劑（諸如N-琥珀酰亞胺基吡啶基二硫 代丙酸酯（SFOP))改質(zhì)以將二硫代批陡基引入抗體（Carlsson等人，Biochem. J. 173 : 723-737(1978);美國(guó)專利第5,208, 020號(hào)）。在第二個(gè)步驟中，將具有硫醇基的反應(yīng)性 maytansinoid(諸如DM1 (形式上稱為N2/ -去乙醜基-N2 -(3-疏基氧代丙基））-美 登素）作為起始試劑添加至經(jīng)改質(zhì)抗體中，導(dǎo)致改質(zhì)抗體中硫代吡啶基的置換，及由二硫 化物連接的細(xì)胞毒性maytansinoid/抗體偶聯(lián)物的產(chǎn)生（美國(guó)專利第5, 208, 020號(hào)）。在 美國(guó)專利第6, 441，163號(hào)中描述用于偶聯(lián)maytansinoids的一步驟工藝。
[0229] 由 ImmUnogen Corporation (Cambridge，MA)可獲得基于 Maytansinoid 的免 疫毒素技術(shù)。另一種重要的毒素技術(shù)是基于auristatin毒素。Auristatins衍生自 由印度洋海的海兔獲得的海兔毒素 DolastatinlO,作為有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制物質(zhì)。見 美國(guó)專利第4, 816, 444號(hào)和第4, 978, 744號(hào)。關(guān)于其它的海兔毒素，也見美國(guó)專利第 4, 414, 205 號(hào)（Dolastatin-l、2 和 3)、第 5, 076, 973 號(hào)（Dolastatin-3)、第 4, 486, 414 號(hào) (Dolastatin-A 和 B)、第 4, 986, 988 號(hào)（Dolastatin-13)、第 5,138, 036 號(hào)（Dolastatin-14) 和第4, 879, 278號(hào)（dolastatin-15)。由Dr. Pettit和亞利桑那州大學(xué)的同事分離和合 成的各種auristatine衍生物已經(jīng)測(cè)試且顯示出對(duì)細(xì)胞的高度毒性。見Pettit等人，抗 腫瘤劑 337。海兔毒素 10 結(jié)構(gòu)改質(zhì)的合成。Anticancer Drug Des. 10 (7) :529-44 (1995)， Woyke等人。有效海兔毒素10結(jié)構(gòu)改質(zhì)auristatin PHE的細(xì)胞外活性和后抗真菌作用。 Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 :3580-3584(2001)，Pettit 等人。海兔毒素 10 和肽衍生物對(duì)抗新生隱球菌的特異性活性。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 : 2961-2965(1998)，Woyke。新生隱球菌細(xì)胞周期期間微管的三維顯影和auristatin PHE對(duì) 微管整體性和核位置的影響。Submitted，Antimicrobial Agents and Chemotherapy。
[0230] 近來，已研發(fā)在作為有效負(fù)載在抗體上傳遞時(shí)似乎相當(dāng)有效的其它auristatin 衍生物。例如，已顯示單甲基auristatin E(MMAE)在與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)時(shí)作為對(duì) 于腫瘤細(xì)胞的有效毒素 。Doronina 等人，Development ofpotent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)(在線可 得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE, an anti-CD30_monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity.Blood. (2003)May8[E 印 刷 前公 開].Epub2003Apr24(在線可得）。除auristatin分子的毒性之外，研究已顯示經(jīng)肽連接 的偶聯(lián)物更穩(wěn)定，且因此在緩沖劑和血漿中比其它連接子技術(shù)對(duì)正常組織的特異性更大 且毒性更小° Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)(在線可得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE, an anti-CD30_monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May8[E 印刷前公開]·' Epub2003Apr24(在 線可得）。
[0231] 這些連接子基于支鏈肽設(shè)計(jì)且包括例如mAb-繳氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb-苯 丙氨酸 _ 賴氨酸 _MMAE 偶聯(lián)物。Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (在線可得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE，an anti-CD3〇-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May8[E 印 刷前公開]EpUb2003Apr24(在線可得）。這些設(shè)計(jì)和偶聯(lián)技術(shù)由以下所述，例如 King 等人的 Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers ：inhibition of aggregation by rnethoxytriethyleneglycol chains. J Med Chem. 45(19) :4336-43(2002)和 Dubowchik 等人的 CathepsinB-sensitive dipeptide prodrugs. 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol),mitomycin C and doxorubicin. Bioorg Med Chem Lett. 8 (23) :3347-52 (1998)。基于前述的 Auristatin E-基 免疫毒素技術(shù)由 Seattle Genetics Corporation (Seattle，WA)可得。
[0232] 存在大量由自然源萃取物及半合成和合成類似物獲得的影響微管的新穎化合 物，其似乎具有作為用于產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物的毒素的潛能。（見newmedinc.com網(wǎng)站）。這 些分子及使用這些分子的藥物實(shí)例包括以下：秋水仙堿-位點(diǎn)結(jié)合劑（Curacin)、風(fēng)車子 素（AVE806,風(fēng)車子素 A-4 前藥（CA4P)，0xi-4503)、隱藻素（LY355703)、Discodermolide、 Dolastatin 和 Analogs(Auristatin PHE、 DolastatinlO、 ILX-651、 Symplostatinl、 TZT-1027)、埃博霉素（BMS-247550、BMS-310705、EP0906、K0S-862、ΖΚ-ΕΡ0)、榴塞洛素 (Eleutherobin)、FR182877、Halichondrin B(E7389)、月芐三甲氯銨（Halimide) (NPI-2352 和 NPI-2358)、Hemiasterlins (HTI-286)、Laulimalide、Maytansinoids ( " DM1 ") (Bivamzumab 美登素 、Cantuzumab 美登素、huN901-DMl/BB-10901TAP、MLN591DMl、 My9_6_DMl、曲妥珠單抗（Trastuzumab)-DMl)、PC-SPES、Peloruside A、白藜蘆醇 (Resveratrol)、S-烯丙基巰基半胱氨酸（SAMC)、海綿素（Spongistatin)、維提島酰胺 (Vitilevuamide)、分子發(fā)動(dòng)機(jī)-驅(qū)動(dòng)蛋白（Molecular Motor-Kinesins) (SB-715992)、設(shè) 計(jì)的秋水仙堿-位點(diǎn)結(jié)合劑（A-289099, A-293620/A-318315, ABT-751/E7010, D-24851/ D-64131，ZD6126)、其它新穎紡錘體毒素（2-甲氧雌二醇（2-ME2)，苯并咪唑氨基甲酸酯 (ANG600 系列，甲苯咪唑），CP248/CP461，HMN-214, R440, SDX-103, T67/T607)。此外，在 1998 年的 Mayer, A. M. S. Marine Pharmacology :Antitumor and Cytotoxic Compounds. The Pharmacologist. 41(4) :159-164(1999)中評(píng)論了其它的鼠科衍生毒素。
[0233] 治療投予和配方
[0234] 延長(zhǎng)的作用時(shí)間可以通過交替的非經(jīng)腸途徑（諸如，靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射） 使得給料進(jìn)程較不頻繁且更為便利。
[0235] 當(dāng)用于活體內(nèi)投予時(shí)，本文所述的抗體配方應(yīng)該是無菌的。例如，這可易于通過在 凍干和重組之前或之后經(jīng)無菌過濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。抗體通常以凍干形式儲(chǔ)存或儲(chǔ)存在溶液 中。治療抗體組合物通常放置在具有無菌存取入口的容器中，例如，具有可回收配方的接合 器（諸如皮下注射針可穿過的塞子）的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶。
[0236] 抗體投予的路徑是根據(jù)已知方法，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、 動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、吸入或病灶內(nèi)途徑，或通過如下文所述的緩釋系統(tǒng)注射或灌輸。抗體優(yōu)選通 過灌輸或通過大丸劑注射連續(xù)投予。
[0237] 治療學(xué)上采用的抗體的有效量取決于（例如）治療對(duì)象，投藥途徑和患者的病況。 因此，對(duì)于治療學(xué)家而言，優(yōu)選視需要滴定劑量并改良投藥路徑以獲得最優(yōu)的治療效果。理 論上，臨床醫(yī)師將投予抗體，直到達(dá)到理想效果的劑量。這種療法的進(jìn)程易于通過常規(guī)的檢 定或通過本文所述的檢定來控制。
[0238] 如本文所述的抗體可在含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的混合物中制備。治療組合物 可優(yōu)選以液體或粉末氣溶膠（經(jīng)凍干）的形式經(jīng)靜脈內(nèi)或經(jīng)鼻或肺投予。組合物也可以視 需要非經(jīng)腸或經(jīng)皮下投予。當(dāng)進(jìn)行全身性投予時(shí)，治療組合物應(yīng)該是無菌，無熱源且在非經(jīng) 腸可接受的具有應(yīng)有pH值、等滲性和穩(wěn)定性的溶液中。這些條件為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所 已知。簡(jiǎn)而言之，通過將具有所需純度的化合物與生理學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑 混合來制備化合物劑量配方以供儲(chǔ)存和投予。這些材料在所采用的劑量和濃度時(shí)對(duì)于接 受者是無毒性的，且其包括緩沖劑，諸如TRIS HC1、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其它有機(jī)酸 鹽；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量（小于約十個(gè)殘基）肽，諸如聚精氨酸；蛋白質(zhì)，諸 如血白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨 酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡 萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子，諸如 鈉和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENPLURONICS或聚乙二醇。
[0239] 用于注射的無菌組合物可根據(jù)Remingtor^ s Pharmaceutical Sciences (第18 版，Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)中所述的常規(guī)醫(yī)藥實(shí)踐來調(diào)配。例如，可 能需要活性化合物在諸如水或天然發(fā)生的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油的媒介物，或 如油酸乙酯或其類似物的合成脂肪媒介物中的溶解液或懸浮液?？筛鶕?jù)可接受的醫(yī)藥實(shí)踐 并入緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑及其類似物。
[0240] 緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì) 為成形物件、膜或微膠囊的形式。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠（例如，由Langer等人 的 J. Biomed Mater. Res.，（1981) 15 :167-277 和 Langer 的 Chem. Tech.，（1982) 12 :98-105 所述的聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美國(guó)專利第3, 773, 919 號(hào)、EP58, 481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物（Sidman等人的Biopolymers， (1983) 22 :547-556)、非降解伸乙基-乙酸乙烯酯（Langer等人，上述）、降解乳酸-乙醇酸 共聚物，諸如LUPR0N DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球 體）和聚-D-(-)-3-羥基丁酸（EP133, 988)。
[0241] 盡管諸如伸乙基-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得可釋放分子100天， 但某些水凝膠仍持續(xù)較短時(shí)間釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)包膠蛋白質(zhì)在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保留時(shí)，它們可能 因?yàn)楸┞队?7°C的濕氣下而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性的喪失且可能改變免疫原性。可根 據(jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)合理的策略以供穩(wěn)定蛋白質(zhì)。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理為經(jīng)二硫化物 互換形成分子間S-S鍵，就可以通過改質(zhì)硫氫基殘基、自酸性溶液中凍干、控制濕氣含量、 使用合適的添加劑和研發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來達(dá)到穩(wěn)定。
[0242] 緩釋組合物也包括懸浮于可將晶體保持在懸浮液中的合適配方中抗體晶體的制 齊U。當(dāng)通過皮下或腹膜內(nèi)注射時(shí)，這些制劑可產(chǎn)生緩釋效應(yīng)。其它組合物也包括脂質(zhì)體 截留的抗體。含有這些抗體的脂質(zhì)體由本身已知的方法來制備：美國(guó)專利第DE3, 218,121 號(hào)、Epstein 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82 :3688_3692、Hwang 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（1980) 77 :4030-4034、EP52, 322、EP36, 676、EP88, 046、EP143, 949、 142, 641、日本專利申請(qǐng)案第83-118008號(hào)、美國(guó)專利第4, 485, 045號(hào)和第4, 544, 545號(hào)及 EP102, 324。
[0243] 用于給定患者的抗體配方的劑量可由主治醫(yī)師結(jié)合考慮已知的各種因素來測(cè)定 以改質(zhì)藥物的作用，包括疾病的嚴(yán)重程度和類型、體重、性別、飲食、投藥時(shí)間和路徑、其它 藥劑和其它相關(guān)臨床因素。治療有效劑量可通過活體外或活體外方法來測(cè)定。
[0244] 治療學(xué)上采用的抗體的有效量取決于（例如）治療對(duì)象，投藥途徑和患者的病況。 因此，治療學(xué)家優(yōu)選視需要滴定劑量并改良投藥路徑以獲得最優(yōu)的治療效果。根據(jù)上文提 及的因素，一般的日劑量可在約〇.〇〇lmg/kg到多至100mg/kg或更多之間。理論上，臨床醫(yī) 師將投予治療抗體，直到達(dá)到理想效果的劑量。這種療法的進(jìn)程易于通過常規(guī)的檢定或如 本文所述來控制。
[0245] 應(yīng)了解，根據(jù)本文的組合物和方法進(jìn)行的治療實(shí)體的投予應(yīng)與并入配方中的合 適載劑、賦形劑及其它試劑一起投予，以提供經(jīng)改良的轉(zhuǎn)移、傳遞、耐受性及其類似性質(zhì)。 在所有藥劑化學(xué)師已知的配方中可發(fā)現(xiàn)多種合適配方：Remington' s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Publishing Company，Easton，PA (1990))，尤其為其文中的 Block, Lawrence的第87章。例如，這些配方包括粉末、楽料、軟膏、膠質(zhì)物、錯(cuò)、油、脂質(zhì)、 含脂質(zhì)（陽離子或陰離子）氣泡（諸如Lipofectin?)、DNA偶聯(lián)物、無水吸收漿料、水中 油和油中水乳液、乳液聚乙二醇（各種分子量的聚乙二醇）、半固凝膠和含有聚乙二醇的 半固混合物。根據(jù)本發(fā)明，任何前述混合物可適于治療和療法中，只要配方中的活性成分 不會(huì)被配方鈍化，且所述配方生理學(xué)上相容且可容忍所述投藥路徑。也見BaldrickP.的 "Pharmaceutical excipient development :the need for preclinical guidance.，',Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2) :210-8(2000) ;WangW.的 "Lyophilization and development of solid protein Pharmaceuticals. "，Int.J.Pharm. 203(1-2) :1-60(2000) ;CharmanWN 的"Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts. "J Pharm Sci. 89(8) :967-78(2000) ;Powell 等人的"Compendium of excipients for parenteral formulations"，PDAJ Pharm Sci Technol. 52 :238-311 (1998)且其中引用的與配方、賦形劑 和載劑相關(guān)的額外信息已為藥劑化學(xué)師所熟知。
[0246] 抗體的制各
[0247] 如本文所述，抗體可通過使用如下文所述的XenoMouse?技術(shù)來制備。所述小鼠 隨后即可產(chǎn)生人類免疫球蛋白分子和抗體，但不足以產(chǎn)生鼠科免疫球蛋白分子和抗體。用 于達(dá)到相同目的的技術(shù)揭示于本文所揭示的專利、申請(qǐng)案和參考案中。然而，尤其為關(guān)于轉(zhuǎn) 基因生產(chǎn)小鼠及由其產(chǎn)生的抗體的一個(gè)實(shí)施例揭示于申請(qǐng)于1996年12月3日的美國(guó)專利 申請(qǐng)案第08/759, 620號(hào)和1998年6月11日公開的國(guó)際專利申請(qǐng)案W098/24893和2000年 12 月 21 日公開的 TO00/76310 中。也見 Mendez 等人的 Nature Geneticsl5 :146-156(1997)。
[0248] 通過使用這種技術(shù)，可生產(chǎn)針對(duì)多種抗體的完全人類單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施例 中，將小鼠的XenoMouse?細(xì)胞株以令人感興趣的抗原（例如，EGFRvIII)免疫，自表達(dá)抗 體的小鼠中回收淋巴細(xì)胞（諸如B-細(xì)胞），且將所述細(xì)胞與骨髓型細(xì)胞株融合以制備永生 化雜交瘤細(xì)胞株，且篩選并選擇這些雜交瘤細(xì)胞株以識(shí)別產(chǎn)生對(duì)于令人感興趣的抗原具有 特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本文提供用于產(chǎn)生可產(chǎn)生對(duì)EGFRvIII具有特異性的抗體 的多種雜交瘤細(xì)胞株的方法。此外，本發(fā)明提供由這些細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體的表征，包括這些 抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。
[0249] 或者，代替與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，根據(jù)對(duì)初始抗原（優(yōu)選為EGFRvIII 蛋白質(zhì)）的反應(yīng)活性進(jìn)一步篩選由所回收的細(xì)胞產(chǎn)生、自經(jīng)免疫小鼠 XenoMouse?細(xì)胞 株分離的抗體。所述篩選包括以EGFRvIII蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA，活體外結(jié)合至穩(wěn)定表達(dá) 全長(zhǎng)EGFRvIII的NR6M細(xì)胞且由NR6M細(xì)胞中的抗體內(nèi)在化EGFRvIII受體。隨后使用 EGFRvIII-特異性溶血性平板檢定分離分泌令人感興趣的抗體的單B細(xì)胞（Babcook等 人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，i93 :7843-7848 (1996))。定靶用于溶菌的細(xì)胞優(yōu)選為以 EGFRvIII抗原涂敷的綿羊紅細(xì)胞（SRBC)。在分泌令人感興趣的免疫球蛋白的B細(xì)胞培養(yǎng) 基和補(bǔ)充物的存在下，平板的形成表明靶細(xì)胞的特異性EGFRvIII介導(dǎo)溶菌作用?？煞蛛x 平板中心處的單抗原-特異性血漿細(xì)胞，且編碼抗體特異性的遺傳信息可自單血漿細(xì)胞分 離。使用反轉(zhuǎn)錄酶PCR可克隆編碼所分泌抗體的可變區(qū)的DNA。所述經(jīng)克隆DNA隨后可進(jìn) 一步插入合適表達(dá)載體中，優(yōu)選為載體盒，諸如pcDNA，更優(yōu)為含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈 的恒定結(jié)構(gòu)域的pcDNA載體。隨后，所產(chǎn)生的載體可轉(zhuǎn)染為宿主細(xì)胞，優(yōu)選為CH0細(xì)胞，且 培養(yǎng)于經(jīng)合適改質(zhì)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中以供誘發(fā)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或放大編碼基因的所 需序列。本文中描述產(chǎn)生對(duì)EGFRvIII具有特異性的抗體的多個(gè)單血漿細(xì)胞的分離。此外， 將編碼抗-EGFRvIII抗體特異性的遺傳物質(zhì)分離、引入隨后轉(zhuǎn)染為宿主細(xì)胞的合適表達(dá)載 體中。
[0250] 來自XenoMouse小鼠的B細(xì)胞也可用作遺傳物質(zhì)的來源，自其可產(chǎn)生抗體展示文 庫(kù)。所述文庫(kù)可使用所述領(lǐng)域的一般技術(shù)經(jīng)由核糖體展示在噬菌體、酵母或活體外制得。經(jīng) 超免疫的XenoMouse小鼠可作為一種豐富來源，自其可分離具有高親和力的抗原-反應(yīng)性 抗體。因此，經(jīng)對(duì)抗EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用于產(chǎn)生抗體展示文庫(kù)，自其可 分離對(duì)抗EGFRvIII的高親和力抗體。所述庫(kù)可針對(duì)p印3寡肽進(jìn)行篩選，且所得衍生抗體 針對(duì)表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞進(jìn)行篩選以確定對(duì)于自然展示抗原的特異性。完全I(xiàn)gG抗體隨 后可使用重組DNA技術(shù)來表達(dá)。例如見W099/53049。
[0251] -般而言，由上述細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體具有完全人類IgGl或IgG2重鏈和人類κ輕 鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體具有高親和力，當(dāng)通過固相和溶液相測(cè)量時(shí)，其一般具有約i〇_ 9m 至約10_13M的Kd值。在其它實(shí)施例中，抗體具有較低的親和力，自約10_6M至約10_ 8M。
[0252] 如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的，根據(jù)本實(shí)施例的抗體可在除雜交瘤細(xì)胞株之外 的細(xì)胞株中表達(dá)。編碼特定抗體的序列可用于合適哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)型?？赏ㄟ^任何 已知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)型以將多聚核苷酸引入宿主細(xì)胞，例如包括將多聚核苷酸封裝于病毒（或 病毒載體）中且以病毒（或載體）或通過此項(xiàng)技術(shù)中已知的轉(zhuǎn)染程序轉(zhuǎn)換宿主細(xì)胞，如由 美國(guó)專利第4, 399, 216號(hào)、第4, 912, 040號(hào)、第4, 740, 461號(hào)和第4, 959, 455號(hào)中所例示。 所使用的轉(zhuǎn)型程序取決于待轉(zhuǎn)型的宿主。此項(xiàng)技術(shù)中已熟知將異種多聚核苷酸引入哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中的方法，且其包括右旋糖酐調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融 合、電擊、多聚核苷酸封裝于脂質(zhì)體中和DNA直接微注射于胞核中。
[0253] 此項(xiàng)技術(shù)中已熟知可用作供表達(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，且其包括由多種由美國(guó) 菌種保藏中心（American Type Culture Collection(ATCC))獲得的永生化細(xì)胞株，包括（但 不限于）中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CH0)、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK)、猴腎臟細(xì)胞（C0S)、肝 細(xì)胞癌細(xì)胞（例如，Hep G2)和許多其它細(xì)胞株。通過測(cè)定哪些細(xì)胞株具有高表達(dá)水平且產(chǎn) 生具有組成型EGFRvIII結(jié)合特性的抗體來選擇尤其較優(yōu)的細(xì)胞株。
[0254] 實(shí)魁
[0255] 提供以下實(shí)例，包括進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和得到的結(jié)果僅為了達(dá)到說明的目的而并不解釋 為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0256] 最初產(chǎn)生EGFRvIII-特異抗體的策略涉及用復(fù)合抗原（肽、多種可溶性蛋白質(zhì)和 抗原表達(dá)細(xì)胞）免疫XenoMouse小鼠，隨后通過融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞或通過XenoMaWSLAM? 技術(shù)分離B細(xì)胞而分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞。抗體產(chǎn)生細(xì)胞通過ELISA為特異性而呈遞到一級(jí)篩 選，通過FMAT和/或FACS為細(xì)胞表面結(jié)合而呈遞到二級(jí)篩選。隨后進(jìn)行內(nèi)在化檢定以識(shí) 別可能對(duì)藥物輸送有用的抗體。測(cè)量這些抗體的親和力。選擇特定抗體進(jìn)行表位定位。此 夕卜，選擇特定抗體進(jìn)行體內(nèi)及體外測(cè)試以分析這些抗體對(duì)治療癌癥的功效。
[0257] 實(shí)例1'抗原制備
[0258] A. EGFRvIII PEP3-KLH 抗原制各
[0259] 連同實(shí)例 2，14-mer 人 EGFRvIII PEP3(LEEKKGNYVVTDHC(SEQ IDN0 :56)) 肽通過R & D系統(tǒng)常規(guī)合成。隨后TOP3肽與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)結(jié)合，如下：EGFRvIII PEP3(200mcg) (R & D)與 50mcg 的匙孔血藍(lán)蛋白（KLH ;Pierce，Rockford, IL)混合并用蒸 餾水定容到165mcl。加入250mcl結(jié)合緩沖液（0. 1M MES，0. 9M NaCl，pH4. 7)并通過加入 251^1的1〇11^/1111的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亞氨氫氯化物的儲(chǔ)存液伍0(：， Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交聯(lián)。在室溫下培養(yǎng)結(jié)合2小時(shí)，使用pH7. 4 的PBS通過lkDa濾膜（離心濾膜，Millipore，Bedford, ΜΑ)將未反應(yīng)的EDC離心除去。
[0260] 連同實(shí)例 3，14-mer 人 EGFRvIII PEP3(LEEKKGNYVVTDHC(SEQ IDN0 :56)) 肽通過R & D系統(tǒng)常規(guī)合成。隨后PEP3肽與KLH結(jié)合，如下：EGFRvIII PEP3 (200mcg)與 50mcg的匙孔血藍(lán)蛋白（KLH;Pierce，Rockford，IL)混合并用蒸饋水定容到165mcl。加入 250mcl 結(jié)合緩沖液（0· 1M MES，0. 9M NaCl，ρΗ4· 7)并通過加入 25mcl 的 10mg/ml 的 1-乙 基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亞氨氫氯化物的儲(chǔ)存液（EDC，Pierce，Rockford，IL)使 EGFRvIII PEP3和KLH交聯(lián)。在室溫下培養(yǎng)結(jié)合2小時(shí)，使用pH7. 4的PBS通過lkDa濾膜 (離心濾膜，Millipore，Bedford, MA)將未反應(yīng)的EDC離心除去。
[0261] B. B300. 19/EGFRvIII 轉(zhuǎn)染子
[0262] 為了制備B300. 19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染子，從A431細(xì)胞初始克隆出野生型EGFR，且用于 編碼EGFRvIII的EGFR基因被更改從而缺失編碼殘基6-273的密碼子，而在缺失的連接處 產(chǎn)生編碼甘氨酸殘基的密碼子。該缺失發(fā)生在缺失GTT (纈氨酸）和CGT (精氨酸）周圍的 密碼子內(nèi)，而得到的缺失后密碼子為GGT (甘氨酸）。（Wikstrand et al. J Neurovirol. 4 (2): 148-58(1998))
[0263] 1.野生型EGFR構(gòu)建的克隆：
[0264] 使用 Micro-fast RNA 試劑盒（Invitrogen，Burlington，ON)從 A431 (ATCC)中提 取聚 A+mRNA。用隨機(jī) pdN6 引物和 M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（NEB，New England Biolabs，Beverly， Mass.)從polyA+mRNA合成總cDNA。用下列引物由A431cDNA擴(kuò)增2. 3kb的PCR產(chǎn)物：
[0265] 正義 5，-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3，；（SEQIDN0:62)
[0266] 反義 5，-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3，（SEQIDN0:63)
[0267] 使用PfuDNA聚合酶。
[0268] 將PCR產(chǎn)物用Xhol消化，凝膠純化，并連接到被Xhol線型化的質(zhì)粒pWBFNP (見國(guó) 際專利申請(qǐng)案第W099/45031號(hào)）中，以產(chǎn)生質(zhì)粒Wt-EGFR/pWBFNP。
[0269] 2. EGFRvIII 構(gòu)建的產(chǎn)生：
[0270] 用引物對(duì) C13659/C29538 和 C29539/C14288 (BioSource International)由質(zhì)粒 Wt-EGFR/pWBFNP擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，其中C29538和C29539被T4多核苷酸激酶（NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)憐酸化：
[0271] C13659 :5，-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3，（正義）（SEQ ID NO : 64)
[0272] C29538 :5' -CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3,(反義）（SEQ ID NO :65);
[0273] C29539 :5' -GTAATTATGTGGTGACAGATC-3'(正義）（SEQ ID NO :66);
[0274] C14288 :5，-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3，（反義）（SEQ ID NO : 67)。
[0275] 被連接以在編碼EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的6至273氨基酸的序列中引入缺失，并亞克 隆到表達(dá)載體PWBDHFR2中（見國(guó)際專利申請(qǐng)案第W099/45031號(hào)）。
[0276] 用引物對(duì) C13659/C29538 由 Wt-EGFR/pWBFNP 模板用 Pfu 聚合酶（NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)擴(kuò)增產(chǎn)生代表缺失的Y端的232bp的片段。用EcoRl(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化并凝膠純化 PCR 產(chǎn)物。用引物對(duì) C29539/C14288 從Wt-EGFR/pWBFNP產(chǎn)生代表缺失的3'端的1273bp的片段，且用Pfu聚合酶擴(kuò)增模板。用 Xhol (NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化 PCR 產(chǎn)物。用 T4DNA 連接酶（NEB， New England Biolabs，Beverly，Mass.)將片段連接到用 EcoRl/Xhol 消化的 pWBDHFR2 以產(chǎn) 生構(gòu)建 EGFRvIII/pWBDHFR。
[0277] EGFR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被引入下列獲得的構(gòu)建中：從質(zhì)粒Wt-EGFR/pWBFNP中分離 出1566bp的片段并連接到用Dralll/Xhol消化的EGFRvIII/pWBDHFR以產(chǎn)生EGFRvIII-FL/ pffBDHFR〇
[0278] 3.用 EGFRvIII-FL/oTODHFR 轉(zhuǎn)染 Β300. 19 細(xì)朐：
[0279] B300. 19細(xì)胞（8xl06)被用于每700μ 1 DMEM/III介質(zhì)中的轉(zhuǎn)染。加入 20 μ g EGFRvIII-FL/pWBDHFR 和 2 μ g CMV-Puro 質(zhì)粒 DNA。用 Bio-Rad Gene Pulser 在 300volts/960uF下將細(xì)胞電擊。電擊后，在冰上冷卻細(xì)胞10分鐘，隨后加入10非選擇性介 質(zhì)（DMEM/HI葡萄糖，10 % FBS，50 μ Μ BME，2mM L-谷氨酰胺，100單位青霉素-G/mi，100單 位MCG鏈霉素/ml)。在37°C、7. 5% C02下培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。
[0280] 培養(yǎng)后，將細(xì)胞分裂于選擇性介質(zhì)（DMEM/HI葡萄糖，10% FBS，2mM L-谷氨酰胺， 50 μ Μ BME，100單位青霉素-G/ml，100單位MCG鏈霉素/ml，2ug/ml嘌呤霉素）中，在96 孔板中以2xl0 4、0. 4xl04'和0. 08xl04細(xì)胞/孔的濃度，在選擇性介質(zhì)中被選擇14天以 產(chǎn)生穩(wěn)定的克隆。將Puro抗性克隆用E752mAb (抗-EGFR抗體，在Yang等人，Crit Rev Oncol Hematol·，38(1) :17-23(2001)中有所描述）和山羊抗人IgG PE染色，隨后在FACS Vantage (Becton Dickinson)上分析。
[0281] C.構(gòu)律 EGFRvIII-RbFc 表汰構(gòu)律
[0282] 為產(chǎn)生EGFRvIII兔融合蛋白，我們首先構(gòu)建含有編碼兔Fc的DNA的載體。這與 編碼EGFRvIII的DNA連接。下面將詳細(xì)描述此方法：
[0283] 1. RbFc/pcDNA3. lHygro 的構(gòu)建：
[0284] (下列）引物1322/867用于擴(kuò)增編碼兔IgG的Hinge-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的721bp的 片段。
[0285] #1322(正義）：5，-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3，（SEQ ID NO :68)
[0286] #867(反義）：5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3，（SEQ ID NO : 69)
[0287] 將得到的PCR產(chǎn)物用ΚρηΙ和Notl消化，凝膠純化并連接到用KpnI/Notl消化的 pcDNA3. 1 (+)/Hygro(Invitrogen，Burlington，0N)，以產(chǎn)生質(zhì)粒 RbFc/pcDNA3. lHygro。
[0288] 2. EGFRvIII_RbFc/pCEP4 的構(gòu)建：
[0289] (下列）引物1290/1293用于用Pfu聚合酶擴(kuò)增自EGFRvIII-FL/pWBDHFR質(zhì)粒模 板的1165bp的產(chǎn)物。
[0290] #1290(正義）：5，-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3，（SEQ ID NO :70)
[0291] #1293(反義）：5' -CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3' (SEQ ID NO :71)
[0292] 將PCR產(chǎn)物用Nhel和ΚρηΙ消化，凝膠純化并連接到用Nhel/Kpnl消化的RbFc/ pcDNA3. 1 以產(chǎn)生質(zhì)粒 EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro。
[0293] 2170bp 的 SnaBI/XhoI 片段被從 EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro 中分離出來 并亞克隆入SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen，Burlington, ON)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒 EGFRvIII-RbFc/pCEP4。
[0294] 3.產(chǎn)生 293F EGFRvIII-RbFc 穩(wěn)定細(xì)胞系：
[0295] 用如下方法將質(zhì)粒EGFRvIH-RbFc/pCEP4通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染引入293F細(xì)胞（Gibco， Grand Island，NY):轉(zhuǎn)染前一天，1x106293F細(xì)胞被平板接種到明膠覆蓋的100mm組織培養(yǎng) 基培養(yǎng)皿中，并在5%C02、37°C下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，用10ml新鮮非選擇性介質(zhì)（DMEM/F12，10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素 G，100U/ml MCG鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞2-3小時(shí)。在微離 心管中制備轉(zhuǎn)染試劑，如下：1〇μ g的DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)與62μ 1的2M磷酸鈣混 合，并用去離子水定容到500 μ 1。用另一移液管吸取500ul的2XHBS用于轉(zhuǎn)移所述轉(zhuǎn)染試 劑。
[0296] 逐滴將移液管中的溶液加入細(xì)胞，同時(shí)為保持合適的pH值，將細(xì)胞置于5% 0)2培 養(yǎng)箱中直至進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后15-20小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞并用10ml新鮮293F非選擇性 介質(zhì)喂養(yǎng)細(xì)胞。用胰蛋白酶48-72后轉(zhuǎn)染收獲表達(dá)的細(xì)胞，并將細(xì)胞以0. 08xl04細(xì)胞/孔 平板接種到96孔板，置于293F選擇性介質(zhì)（DMEM/F12,10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素 G，100U/ml MCG鏈霉素，250ug/ml濕霉素）中14天。
[0297] 使用lug/ml的抗-EGFR抗體E763 (美國(guó)專利第6, 235, 883號(hào)）作捕捉抗體并用 1 :100稀釋的山羊抗-兔IgGHRPO(CalTag)檢測(cè)，通過ELISA篩選濕霉素抗性克隆，。
[0298] 用如下方法制作用于抗體滴定（實(shí)例3)的EGFRvIII肽-0VA :
[0299] 使用來自Pierce (#20291)的經(jīng)預(yù)稱量的DTT還原207 μ g EGFRvIII PEP3。使用 100 μ L去離子水溶解小瓶7. 7mg的經(jīng)預(yù)稱量的DTT。將DTT貯存液加入EGFRvIII PEP3。使 用pH7. 4的PBS將反應(yīng)液定容到600 μ L。室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)液30分鐘。
[0300] 通過稱量5克G10葡聚糖凝膠珠子并加入40mlPBS，混合并在室溫下靜置10分鐘， 然后以lOOOrpm離心珠子10分鐘制成G10管柱。除去上清液，并再加入20ml的PBS。將 珠子在lOOOrpm下離心10分鐘。除去上清液，加入足夠量的PBS以產(chǎn)生50% G10葡聚糖 凝膠珠子的懸浮液。在5ml旋轉(zhuǎn)柱中加入5ml所述50%懸浮混合物，隨后將該柱置于14ml 聚丙烯管中。將柱子在lOOOrpm下離心3分鐘。另外再加入3ml的PBS，然后再將柱子在 lOOOrpm下離心3分鐘。更換新的聚丙烯管，這樣所述柱子就可以使用了。
[0301] 從還原肽中移除DTT。在將肽還原的30分鐘反應(yīng)之后，向每個(gè)柱子中加入300 μ L 的還原肽。將柱子在lOOOrpm下離心3分鐘。另外再向每個(gè)柱子中加入250yL的PBS，然 后再在lOOOrpm下離心3分鐘。將還原肽收集到14ml的聚丙烯管中。
[0302] 將所述還原肽與用馬來酰亞胺激活的OVA連接，并收集到微量離心管中。將2mg 的馬來酰亞胺激活的OVA用馬來酰亞胺結(jié)合緩沖液溶解（Pierce :77126, Rockford IL)以 制成10mg/ml貯存液。將414 μ g的馬來酰亞胺激活的0VA加入微量離心管中的還原肽中。 向反應(yīng)中加入500 μ L馬來酰亞胺結(jié)合緩沖液。將反應(yīng)液在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)并隨后加入 2mg的半胱氨酸以猝滅可能存在的任何活性馬來酰亞胺基團(tuán)。室溫下允許所述半胱氨酸再 反應(yīng)30分鐘。將所述偶聯(lián)物使用pH7. 4的lx PBS洗滌并用10K離心柱離心3次。這去除 了沒有與0VA結(jié)合的所有自由肽和自由的半胱氨酸。使用凝膠加樣吸頭將所述結(jié)合物從離 心柱上取下并加入微量離心管中。最后，使用PH7. 4的IX PBS將結(jié)合物定容到期望濃度。 所述結(jié)合物的摩爾比為14. 5 :1 (肽：0VA)。
[0303] 實(shí)例 2
[0304] 通討雜種細(xì)朐產(chǎn)牛制誥-EGFRvIII抗體
[0305] 將產(chǎn)生具有Y-1恒定區(qū)的抗體的八只小鼠（XenoMouseGl小鼠）在第0天免疫，然 后對(duì)于此方案要在第11、21、32、44和54天加強(qiáng)，然后在第58天進(jìn)行融合。所有免疫均通過 在尾根部皮下給藥和腹腔給藥的方式注射。第〇天免疫是用1. 5xl07B300. 19/EGFRvIH轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞（實(shí)例1A)懸浮在與完全Freunds佐劑（CFA) (Sigma, St. Louis, M0) 1 :lv/v混合的 無致熱原的DPBS中完成的。第11、21和32天加強(qiáng)是用1. 5xl07B300. 19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞在與不完全Freunds佐劑（IFA) (Sigma, St. Louis, M0) 1 :lv/v混合的DPBS中完成的。 第44天加強(qiáng)是用與IFA1 :lv/v混合的5 μ g的PEP3 (EGFRvIII肽）-KLH結(jié)合（實(shí)例1)完 成的，且最后的加強(qiáng)是用沒有佐劑的DPBS中5μ gPEP3(EGFRvIII肽）-KLH結(jié)合完成的。
[0306] 在第58天，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，隨后回收其腹股溝和腰椎淋巴結(jié)。使用組織粉 碎機(jī)通過機(jī)械破壞從淋巴結(jié)中釋放出淋巴細(xì)胞，隨后通過CD90陰性選擇除去T細(xì)胞。通 過將洗滌并富集的 B 細(xì)胞和購(gòu)自 ATCC，cat#CRL1580 (Kearney et al，J. Immunol. 123 : 1548-1550(1979))的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8. 653細(xì)胞以1 :1的比例混合而進(jìn)行融合。 此細(xì)胞混合物通過以800g離心被輕輕地沉淀。徹底去除上清液后，用2-4ml鏈霉蛋白酶溶 液（CalBiochem，cat. #53702,0. 5mg/ml 在 PBS 中）處理不超過 2 分鐘。隨后，加入 3-5ml FBS 終止酶活性，用電細(xì)胞融合溶液ECFS (0. 3M蔗糖，Sigma，Cat#S7903,0. ImM醋酸鎂，Sigma， Cat#M2545, 0· ImM 醋酸鈣，Sigma，Cat#C4705 (St. Louis，M0))定容至 40ml。
[0307] 離心后除去上清液，通過在40ml ECFS中再次懸浮洗滌細(xì)胞。重復(fù)洗滌步驟， 再次用ECFS懸浮細(xì)胞以達(dá)到2xl06細(xì)胞/ml的濃度。使用融合產(chǎn)生器（型號(hào)ECM2001， 661161：1'〇11；[(3，111(3.，5311〇168〇,04)進(jìn)行電-細(xì)胞融合。所用的融合室大小為2.〇1111，并使用 下列儀器設(shè)置：比對(duì)條件：電壓：50V，時(shí)間：50s，膜破裂條件：電壓：3000V，時(shí)間：30 μ s，融 合后固定時(shí)間：3s。融合后，在 DMEM(JRHBiosciences)、15%FCS(Hyclone)并含有 HAT 的 溶液中懸浮細(xì)胞，并加入L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素、0ΡΙ (草酰乙酸、丙酮酸、牛胰島素） (均購(gòu)自 Sigma，St. Louis，M0)和 IL_6(Boehringer Mannheim)在 37°C及 10% C02 空氣中 培養(yǎng)。
[0308] 將細(xì)胞以4xl04細(xì)胞/孔平板接種到平底96孔組織培養(yǎng)板上。在轉(zhuǎn)移到HT(次 黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷）補(bǔ)料介質(zhì)前，培養(yǎng)被保存在HAT (次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧 啶脫氧核苷）補(bǔ)料介質(zhì)中2星期。通過在HAT介質(zhì)的存活選擇雜種細(xì)胞，并用ELISA篩選 上清液的抗原活性。ELISA格式需要在抗原涂覆平板（作為計(jì)數(shù)篩選的EGFRvIII肽-0VA 涂覆平板和野生型EGFr p印tide-OVA涂覆平板）上的培養(yǎng)上清液并使用辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的小鼠抗人類IgG檢測(cè)EGFRvIII特異結(jié)合（見表2. 1)。
[0309] 表 2. 1
【權(quán)利要求】
1. 一種經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其結(jié)合至EGFRvIII，所述抗體包括： 重鏈多肽，其包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（⑶Rs):重鏈⑶R1，其是SEQ ID NO :2中的⑶R1 ;重 鏈 CDR2,其是 SEQ ID NO :2 中的 CDR2 ;重鏈 CDR3,其是 SEQ ID NO :2 中的 CDR3 ; 輕鏈多肽，其包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（⑶Rs):輕鏈⑶R1，其是SEQ IDN0 :19中的⑶R1 ;輕 鏈 CDR2,其是 SEQ ID NO : 19 中的 CDR2 ;輕鏈 CDR3,其是 SEQ ID NO : 19 中的 CDR3 ;和 偶聯(lián)至所述抗體的毒素，其中所述毒素選自Maytansinoid和阜草素（saporin); 其中所述人類單克隆抗體特異性結(jié)合至包含序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :94)的肽
2. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述毒素包括皂草素 (saporin)〇
3. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述毒素包括Maytansinoid。
4. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述Maytansinoid包括DM-1。
5. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述重鏈多肽包含以下三種氨 基酸序列：SEQ ID NO :108, SEQ1D NO :110 和 SEQ ID NO :112。
6. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述輕鏈多肽包含以下三種氨 基酸序列：SEQ ID NO :101，SEQ1D NO :103 和 SEQ ID NO :105。
7. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中每個(gè)⑶R根據(jù)Kabat、Chothia 或Kabat和Chothia組合的⑶R定義而定義。
8. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中每個(gè)CDR根據(jù)Kabat的CDR定 義而定義。
9. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中每個(gè)⑶R根據(jù)Chothia的⑶R 定義而定義。
10. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述重鏈多肽包含以下三種 氨基酸序列：SEQ ID NO :108, SEQ1D NO :110和SEQ ID NO :112 ;其中所述輕鏈多肽包含以下 三種氨基酸序列：SEQ ID NO :101，SEQ1D NO :103 和 SEQ ID NO :105。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 特異結(jié)合至EGFRvIII的表位，其中所述表位的序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所 /_J、1 ο
12. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 特異結(jié)合SEQ ID NO :56。
13. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 對(duì)野生型的EGFR肽（SEQ ID NO : 134)的非特異性結(jié)合低于所述抗體對(duì)EGFRVIII (SEQ ID NO : 135)的特異性結(jié)合的10%。
14. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 抑制表皮生長(zhǎng)因子（EGF)與表皮生長(zhǎng)因子受體vIII (EGFRvIII)的結(jié)合。
15. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 特異性識(shí)別序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示表位的位置6處的甘氨酸殘基。
16. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 進(jìn)一步結(jié)合至序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)所示的表位。
17. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 具有小于1.3X10_9M的KD。
18. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中抗體具有 小于500pM的KD。
19. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 可被內(nèi)在化。
20. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中氨基酸序 列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)中的參與結(jié)合所述抗體的殘基選自由如下構(gòu)成的群組： EEK，KKNYV，LEK，EKNY 和 EEKGN。
21. 如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體，其中所述抗體 通過不可裂解連接子偶聯(lián)至阜草素（saporin)或者M(jìn)aytansinoid。
22. -種經(jīng)分離的人類單克隆抗體的抗體變體，其通過在權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要 求所述的經(jīng)分離的人類單克隆抗體的氨基酸序列中進(jìn)行5個(gè)或更少的氨基酸的替換、缺失 或增加而形成的變體蛋白；其中變體蛋白結(jié)合至序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所 示的肽，且其中所述抗體變體偶聯(lián)至Maytansinoid或者阜草素（saporin)。
23. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體特異結(jié)合至EGFRvIII的表位， 其中所述表位的序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示。
24. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體特異結(jié)合SEQ ID NO :56。
25. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體對(duì)野生型的EGFR肽（SEQ ID NO :134)的非特異性結(jié)合低于所述抗體變體對(duì)EGFRVIII (SEQ ID NO :135)的特異性結(jié)合的 10%。
26. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體抑制表皮生長(zhǎng)因子（EGF)與表 皮生長(zhǎng)因子受體vIII (EGFRvIII)的結(jié)合。
27. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體特異性識(shí)別序列 LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示表位的位置6處的甘氨酸殘基。
28. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體進(jìn)一步結(jié)合至序列 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO :57)所示的表位。
29. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體具有小于1. 3X 10_9M的KD。
30. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體具有小于500pM的KD。
31. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體可被內(nèi)在化。
32. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中氨基酸序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO : 56)中的參與結(jié)合所述抗體變體的殘基選自由如下構(gòu)成的群組：EEK，KKNYV，LEK，EKNY和 EEKGN〇
33. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述抗體變體通過不可裂解連接子偶聯(lián)至皂 草素（saporin)或者 MaytansinoicL
34. 如權(quán)利要求22所述的抗體變體，其中所述Maytansinoid包括DM-1。
35. -種試劑盒，包含：容器，含于其中的組合物和表明所述組合物可用于治療以 EGFRvIII的表達(dá)為特征的癌癥的包裝說明書或標(biāo)簽，其中所述組合物包含如權(quán)利要求 1-21中任一權(quán)利要求所述的抗體或權(quán)利要求22-34中任一權(quán)利要求所述的抗體變體。
36. 如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述癌癥為肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
37. 如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述癌癥為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
38. -種組合物，其包含：權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求所述的抗體或權(quán)利要求22-34 中任一權(quán)利要求所述的抗體變體，以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或稀釋劑。
39. 權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求所述的抗體或權(quán)利要求22-34中任一權(quán)利要求所述 的抗體變體在制備用于治療表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體νΙΙΙ (EGFRvIII)的癌細(xì)胞的藥物中的 用途。
40. 如權(quán)利要求39所述的用途，其中所述癌細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
41. 如權(quán)利要求39所述的用途，其中所述癌細(xì)胞包含肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺 癌、乳腺癌、腦腫瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或卵巢癌細(xì)胞。
42. 一種制備權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求所述的抗體或權(quán)利要求22-34中任一權(quán)利 要求所述的抗體變體的方法，包括： 提供在權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求中識(shí)別的所述抗體或權(quán)利要求22-34中任一權(quán) 利要求所述的抗體變體；以及 將Maytansinoid或阜草素（saporin)偶聯(lián)至所述抗體或所述抗體變體。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中提供所述抗體或所述抗體變體是通過提供產(chǎn)所述 抗體或所述抗體變體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述雜交瘤細(xì)胞包含編碼所述抗體或所述抗體變 體的核酸。
45. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中不可裂解連接子用于將Maytansinoid或阜草素 (saporin)偶聯(lián)至所述抗體或所述抗體變體。
46. -種治療表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體vIII (EGFRvIII)的癌細(xì)胞的藥物，其活性成分為 權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求所述的抗體或權(quán)利要求22-34中任一權(quán)利要求所述的抗體 變體。
47. 如權(quán)利要求46所述的藥物，其中所述癌癥為肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠 質(zhì)母細(xì)胞瘤。
48. 如權(quán)利要求46所述的藥物，其中所述癌癥為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104059147SQ201410050583
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2003年6月27日
【發(fā)明者】理查德·韋伯, 馮曉, 奧里特·福德, 拉里·格林, 瓊·古達(dá)斯, 布魯斯·基特, 劉穎, 帕拉尼·拉塔納斯瓦米, 羅伯特·拉亞, 楊曉東, 喬斯·克爾瓦蘭, 伊恩·福爾茨, 賈小池, 賈斯帕·康, 查德威克·T·金, 斯科特·L·克拉坎普, 巧娟·簡(jiǎn)·蘇 申請(qǐng)人:艾默根佛蒙特有限公司