本發明涉及基因靶向藥物檢測領域，具體涉及一種檢測EGFR耐藥性突變的方法和組合物。
背景技術：
表皮生長因子受體(EGFR)參與調節癌細胞中重要的增殖和生存相關的細胞功能，已被確定為治療多種腫瘤的相關靶點。EGFR在多種腫瘤中常有體細胞單核苷酸變異或缺失或表達變化，這些變異位點常是第一代酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼或厄洛替尼的靶向位點。
T790M突變是EGFR 20外顯子中的一個點突變，就是EGFR蛋白的第790氨基酸由T(色氨酸)變成了M(甲硫氨酸)，這個突變與第一代藥物的失效密切相關。一項對出現耐藥性的肺癌患者的研究表明約60％的耐藥性來自于EGFR的T790M突變，4％同時有HER2擴增和T790M突變，3％同時有MET擴增和T790M突變，18％的患者耐藥性產生的機理尚未明確。近30多年來，癌癥已成為人類第一死因，目前，肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌及鼻咽癌8個重點癌癥占到了癌癥死因的80％。若EGFR突變患者出現耐藥性，其治療效果則明顯停滯并且藥物的副作用還會加速患者的病情惡化，足見EGFR突變的檢測對于預防和治療癌癥患者的重要性。
而現有技術中大多是對于T790M突變的檢測和針對此突變位進行的藥物治療，而對于其它與EGFR突變引起的耐藥性的研究還鮮見報道。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明提供一種能快速準確測量M793K突變的檢 測EGFR耐藥性突變的方法和組合物。
M793K突變編碼了EGFR蛋白中793位的變化，從野生型中的甲硫氨酸(M)變為突變體中的賴氨酸(K)。在用吉非替尼或厄洛替尼治療前或早期，患者中很少出現這種突變，但是由于該突變消除了對這些藥物敏感性，攜帶突變的癌細胞被陽性地選擇，導致患者對進一步治療產生頑固性。
第一方面，本發明提供的一種檢測EGFR耐藥性突變的組合物包括多個PCR引物；
所述PCR引物為：
(1)正向引物：5’-CGTTCGGCACGGTGTATAA-3’
反向引物：5’-GCCTCCTTCTGCATGGTATT-3’
或者
(2)正向引物：5’-GGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT-3’
反向引物：5’-ATAGTCCAGGAGGCAGCCGAA-3’。
也就是PCR引物為(1)和(2)中的任意一組。M793K是指EGFR 20外顯子2378位核苷酸繼發點突變，所述的兩組包括EGFR cDNA序列核苷酸2378的引物對能夠擴增片斷，它可用于測序、限制長度多態性分析，或者用于確定是否存在2378T->A突變的任何其它技術，2378T->A突變即EGFR cDNA序列核苷酸2378位上T堿基突變為A堿基。
本發明提供的(1)或(2)組PCR引物在適宜的PCR條件下雜交至編碼突變EGFR多肽的第一多核苷酸，或者它的多核苷酸片斷，其中該引物雜交至在對應于EGFR cDNA堿基2378的位置上包括突變A的有義鏈序列或者反義鏈序列，而且該引物在所述PCR條件下很弱地或者根本不雜交至在2378位上含有野生型T的第二EGFR多核苷酸。
如序列表中第5項表皮生長因子受體DNA所示，(1)組中的正向引物為第104位至第122位DNA序列，(1)組中的反向引物為第542位至第561位的反向互補序列；(2)組中的正向引物為第130位至第143位DNA序列，(2)組中 的反向引物為第322位至第342位的反向互補序列。M793K突變點在各組中正反引物之間，突變點位于第317位，這樣，通過PCR擴增即可檢測出該突變。
優選地，上述檢測EGFR耐藥性突變的組合物還包括試劑盒；所述試劑盒包括Taq DNA Polymerase、dNTPs、反應緩沖液。Taq DNA Polymerase即TaqDNA聚合酶。
優選地，上述檢測EGFR耐藥性突變的組合物中所述試劑盒中Taq DNA Polymerase的濃度為2x。
優選地，上述檢測EGFR耐藥性突變的組合物中所述引物的終濃度為0.2uM，試劑盒中dNTPs終濃度為0.5uM，緩沖液10xTaq PCR Buffer的終濃度為1x。也就是說用于檢測的引物的終濃度為0.2uM/L。
優選地，上述檢測EGFR耐藥性突變的組合物中所述用于配置引物的終濃度溶液的引物濃度為10uM。也就是說引物配置成最終濃度前是在10uM的濃度下進行儲存，這樣使得引物在配制成最終濃度能夠更加準確。
第二方面，本發明提供了一種檢測EGFR耐藥性突變的方法，包括步驟：
A.模板制備：石蠟包埋組織切片中提取DNA，使用紫外分光光度計對其進行濃度調整，作為PCR檢測的模板；
B.反應組分配制：分別配制檢測混合物和陰性對照品混合物；其中，檢測混合物按PCR混合液10.5uL、模板DNA溶液2uL，加ddH2O補至50ul配制一管；陰性對照品混合物按PCR混合液10.5uL，不加DNA模板，加ddH2O補至50ul配制一管；ddH2O即重蒸水；所述PCR混合液即如上所述的包含PCR引物及試劑盒的混合液；
C.擴增：分別將檢測混合物、陰性對照品混合物放入PCR儀擴增，按以下程度進行擴增：
(1)94℃，2-5min，1cycle；即在94℃下反應2-5分鐘使得DNA完全分開；
(2)循環重復如下步驟30-35次：
94℃ 30S
50-60℃ 30S
72℃ 1-2kb/min；
也就是先94℃下反應30秒，再在50-60℃退火30秒，然后在72℃在每分鐘1-2kb的速度進行延伸，然后重復上述步驟，總共循環重復30-50次；
(3)72℃，5-10min；
D.結果判定：擴增產物直接點樣電泳，如果檢測物中擴增出片段和理論上設計引物時參照的目的片段大小一致，且陰性對照物無條帶，說明樣本DNA中含有該突變；如果檢測物中沒有擴增出片段，且陰性對照品無條帶，說明檢測物中不含該突變。
EGFR上新發現的點突變M793K，發明人通過分析得到出該突變和TKI抗藥性相關。證據如下：該點突變的頻率較高，真實存在；氨基酸改變由M變成K，由非極性氨基酸變成堿性氨基酸，變動大；位置重要，是TKI結合的關鍵氨基酸，M可和TKI形成氫鍵；臨床實驗中7例病人均表現出TKI治療抗性，因為沒有KRAS突變，因此抗性很可能是因為EGFR的突變引起的，6例病人未檢測到已知的T790M和C797S抗性突變，1例病人檢測到已知的C797S抗性突變，也推測M793K是一個抗性突變；TKI治療后，M793K突變的豐度明顯增加；發生突變后，EGFR與TKI的結合分值降低；細胞學證據表明，M793K突變后，對吉非替尼表現出抗性(以自身磷酸化程度作為鑒定指標)。而本發明則針對M793K突變進行了檢測方法的研究，最終目的是早期鑒定頑固性病例以便于能夠啟動替代性治療。
綜上所述，利用本發明提供的組合物和檢測方法檢測EGFR耐藥性突變，可以通過對癌癥患者的EGFR上新發現的點突變M793K進行快速準確的檢測，從而預測出TKI抗藥性，本發明提供了一種新的檢測方法或手段，進而能夠實現分子分型精準醫療應用保護，針對本突變也能夠更加準確有效地開發對應的靶向藥物。
具體實施方式
下面將對本發明技術方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發明的保護范圍。
本發明實施例共包含2個PCR反應，分別為檢測混合物1管，陰性對照檢測物1管。實施例具體檢測操作步驟如下：
1.臨床樣本基因組提取：本實施例是從非小細胞肺癌患者肺部石蠟包埋組織切片中提取DNA，并對其進行定量，作為PCR檢測的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蠟包埋組織提取試劑盒(Cat No.56404)。
(1)室溫下平衡所有Buffers。
(2)水浴鍋預熱到70℃，buffer ATL、buffer AL 70℃溶解沉淀。
(3)用手術刀整齊地切除組織樣品周邊的多余石蠟。
(4)切下3-8片5-10um厚的組織切片，放入1.5ml的離心管中，加入1ml二甲苯(xylene)，劇烈震蕩10s。
(5)室溫下，20000×g離心2min。
(6)用移液槍移除上清液，注意不要移除任何沉淀。
(7)添加1ml質量分數為95-100％的乙醇或乙醇水溶液至沉淀中，震蕩儀震蕩混勻。
(8)室溫下，20000×g離心2min。
(9)用移液槍移除上清液，注意不要移除任何沉淀，用細小槍頭盡量移除所有無水乙醇。
(10)打開管蓋，37℃孵育10min，直到殘余的無水乙醇全部蒸發掉。
(11)將沉淀重新懸浮在180ul的buffer ATL中。添加20ul的蛋白酶K，震蕩儀震蕩混勻。
(12)56℃孵育1h，直到樣品被buffer ATL完全溶解。
(13)90℃孵育1h。
(14)瞬時離心，將蓋子上的液滴離心下來；離心管中添加2ul RNase A(100mg/ml),室溫孵育2min。
(15)添加200ul的buffer AL，震蕩儀立即充分震蕩混勻。
(16)添加200ul的無水乙醇，震蕩儀立即充分震蕩混勻。
(17)瞬時離心，將蓋子上的液滴離心下來。
(18)將所有的溶解液轉移到吸附柱中，6000×g離心1min，將吸附柱重新放置到新的收集管中。
(19)向吸附柱中添加500ul的buffer AW1，6000×g離心1min；將吸附柱重新放置到新的收集管中。
(20)向吸附柱中添加500ul的buffer AW2，6000×g離心1min，將吸附柱重新放置到新的收集管中；20000×g離心3min。
(21)將吸附柱移至新的1.5ml離心管中，添加50ul的buffer ATE到吸附柱膜的中央。
(22)室溫孵育1min，20000×g離心1min。
2.紫外分光光度計測定DNA提取的質量及濃度并調整至50ng/ul。
3.配置PCR反應體系
全程4℃操作。各反應管組分含量及終濃度如下(每管總體系50ul)：
4.擴增
將上述兩管反應物放入PCR儀，設置反應程序如下：
(1)94℃ 2-5min
(2)循環重復如下步驟30-35次：
94℃ 30S
50-60℃ 30S
72℃ 1-2kb/min
(3)72℃ 5-10min。
5.電泳檢測結果
檢測物中檢測出的條帶和理論上設計引物時參照的目的片段大小一致，且陰性對照組未檢測出條帶，說明該樣本中含有EGRF M793K突變。