抑制肺癌細胞增殖的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法。所述方法包括：選用指數生長期的肺癌細胞，采用胰酶消化肺癌細胞；采用由組分1和組分2構成的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，并同時采用不同濃度的組分1處理所述肺癌細胞，組成多組對比樣品；在處理后加入染料溶液，放置在培養箱孵育得到藍紫色結晶甲瓚，棄除上清液；采用二甲基亞砜溶解藍紫色結晶甲瓚，并用酶標儀在490nm波長下檢測肺癌細胞的存活率，按照所述存活率計算增殖率和克隆數，并分別比對不同樣品的增殖率和克隆數。
【專利說明】抑制肺癌細胞增殖的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫療和醫藥領域，特別是涉及一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物，一種抑制肺癌細胞增殖的藥物制劑以及一種肺癌細胞增殖的檢測方法。
【背景技術】
[0002]肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，惡性腫瘤是危害人類生命健康的細胞性疾病，腫瘤細胞從生物體內正常細胞轉化為惡性細胞，其形態、功能、代謝和增殖等都會發生深刻變化，可以看作是細胞的異常分化導致的其具有永生性。
[0003]絕大多數肺癌起源于支氣管粘膜上皮，近年來，隨著吸煙和各種環境因素的影響，肺癌的發病率和死亡率逐年增長其死亡率已占癌癥死亡率之首，世界各國特別是工業發達國家，肺癌的發病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。在治療肺癌的方向上，如何抑制肺癌細胞的增殖和克隆，就成為腫瘤治療中一個關鍵問題。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種新型的抑制肺癌細胞增殖的機制。 [0005]為了解決上述問題，本發明公開了一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)_3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
[0006]優選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(O: 5)~(5:5)。
[0007]本發明還提供了一種抑制肺癌細胞增殖的藥物制劑，以抑制肺癌細胞增殖的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體；
[0008]所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549 ；
[0009]所述組合藥物由3- [2，4-雙((3S) _3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
[0010]優選地，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(O: 5)~(5:5)。
[0011]優選地，所述制劑為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植入劑。[0012]本發明還提供了一種肺癌細胞增殖的檢測方法，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括:
[0013]選用指數生長期的肺癌細胞，采用胰酶消化肺癌細胞；
[0014]采用由組分I和組分2構成的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，并同時采用不同濃度的組分I處理所述肺癌細胞，組成多組對比樣品，所述組分I為3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺，所述組分2為產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述組分I在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素革巴蛋白的抑制劑；
[0015]在處理后加入染料溶液，放置在培養箱孵育得到藍紫色結晶甲瓚，棄除上清液；[0016]采用二甲基亞砜溶解藍紫色結晶甲瓚，并用酶標儀在490nm波長下檢測肺癌細胞的存活率，按照所述存活率計算增殖率和克隆數，并分別比對不同樣品的增殖率和克隆數。
[0017]優選地，所述組合藥物中所述組分I與所述組分2的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
[0018]與現有技術相比，本發明包括以下優點:
[0019]依據本發明實施例，采用3_[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及2-脫氧-D-葡萄糖組成的組合藥物作用于非小細胞肺癌細胞株A549，其中，3-[2，4_雙((3S)_3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑，2-脫氧-D-葡萄糖在肺癌細胞的增殖過程中產生糖酵解作用，通過實驗驗證，本發明創新提出的組合藥物中，加入2-脫氧-D-葡萄糖可顯著增強AZD2014對A549細胞增殖的抑制效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發明的一種肺癌細胞增殖的檢測實施例的流程圖；
[0021]圖2是本發明的示例中四組樣品的細胞存活率的檢測結果的對比圖；
[0022]圖3是本發明的示例中四組樣品的增殖率的計算結果的對比圖；
[0023]圖4是本發明的示例中四組樣品的克隆數的計算結果的對比圖。
【具體實施方式】
[0024]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0025]癌細胞是一種變異的細胞，是產生癌癥的病源，癌細胞與正常細胞不同，有無限生長、轉化和轉移三大特點，能夠無限增殖并破壞正常的細胞組織，也因此難以消滅。在治療肺癌的方向上，如何抑制肺癌細胞的增殖，就成為腫瘤治療中一個關鍵問題。
[0026]本發明提供了一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5, 6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及2-脫氧-D-葡萄糖組成，其中，所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑，2-脫氧-D-葡萄糖在肺癌細胞的增殖過程中可以產生糖酵解作用。[0027]A549細胞系是由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養建系，患者為58歲白人男性。A549能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。24%的細胞是亞三倍體細胞，含有66條染色體，并且，產生64、65、67條染色體細胞的頻率也很高，大部分細胞都具有2條X和2條Y染色體。
[0028]3-[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺即AZD2014,是mT0R(ammalian target of rapamycin,哺乳動物雷帕霉素革巴蛋白)的復合體 mTORCl (ammalian target of rapamycin complexl)和 mT0RC2 (ammal i an targetof rapamycin complex2)的雙重抑制劑,在肺癌細胞凋亡的過程中作為雷帕霉素祀蛋白的抑制劑，具有潛在的抗腫瘤活性胺。2-DG即2-脫氧-D-葡萄糖，是葡萄糖類似物，能夠短時間一直糖酵解作用。
[0029]本發明實施例中，優選地，所述組合藥物中所述3- [2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
[0030]相應的，本發明還提供了一種抑制肺癌細胞增殖的藥物制劑，以抑制肺癌細胞增殖的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體。
[0031 ] 其中，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3- [2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶_7_基]-N-甲基苯甲酰胺以及產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
[0032]本發明實施例中，優選地，所述組合藥物中所述3- [2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N`-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
[0033]本發明實施例中，優選地，所述制劑可以為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植人劑之中的任意一種。
[0034]相應的，本發明還提供了一種肺癌細胞增殖的檢測方法，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括:
[0035]步驟101、選用指數生長期的肺癌細胞，采用胰酶消化肺癌細胞。
[0036]本發明實施例中，首先從非小細胞肺癌細胞株A549選取肺癌細胞，選用指數生長期的肺癌細胞，并采用胰酶消化肺癌細胞。
[0037]在采用胰酶消化肺癌細胞后，還可以進行細胞計數，計數后，對細胞懸液進行稀釋，終濃度維持在一定濃度并分別種板，每孔中加入細胞懸液，例如5X104cells/ml左右，分別種96孔板，每孔加入100 μ L稀釋后的細胞懸液。
[0038]步驟102、采用由組分I和組分2構成的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，并同時采用不同濃度的組分I處理所述肺癌細胞，組成多組對比樣品，所述組分I為3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺，所述組分2為產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述組分I在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
[0039]本發明實施例中，采用組合藥物處理肺癌細胞，并對肺癌細胞的增殖進行檢測，組合藥物由組分I和組分2構成，組分I為3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺，組分2為產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，組分I在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
[0040]驗證組合藥物以及各個組分的效果，可以采用不同濃度的組分I處理所述肺癌細胞，并與采用組分I和組分2組成的組合藥物處理肺癌細胞，從而形成比對，加入組分2和不加入組分2的樣品進行對比可以得出組分2的效果，加入不同濃度的組分I的樣品進行對比，可以得出組分I加入量對抑制肺癌細胞增殖效果的影響。
[0041]本發明實施例中，優選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
[0042]步驟103、在處理后加入染料溶液，放置在培養箱孵育得到藍紫色結晶甲瓚，棄除上清液。
[0043]加藥處理一定時間后的細胞可以分別加入染料溶液，本發明實施例中優選MTT(3- (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，MTT是一種檢測細胞存活和生長的方法，檢測原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在加入染料溶液后，放置在培養箱孵育后，會形成藍紫色結晶甲瓚，棄除上清液。
[0044]步驟104、采用二甲基亞砜溶解藍紫色結晶甲瓚，并用酶標儀在490nm波長下檢測肺癌細胞的存活率，按照所述存活率計算增殖率和克隆數，并分別比對不同樣品的增殖率和克隆數。
[0045]二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據肺癌細胞的存活率可以進一步計算肺癌細胞的增殖率和克隆數，克隆數表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量，貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞，克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。
[0046]為了使本領域技術人員更好地理解本發明，通過具體的示例對本發明的肺癌細胞增殖的檢測方法進行說明。
[0047]為了使本領域技術人員更好地理解本發明，通過具體的示例對本發明的肺癌細胞凋亡的檢測方法進行說明。
[0048]選用指數生長期的A549細胞，用0.25%的胰酶消化細胞，分別進行細胞計數，計數后，對細胞懸液進行稀釋，終濃度維持在:5X104cells/ml左右，分別種96孔板，每孔加入100 μ L稀釋后的細胞懸液。
[0049]待細胞貼壁后，分別用AZD20140、1、2、5 μ M處理非小細胞肺癌Α549細胞株，加藥處理24h和48h后分別加入20 μ L濃度為5mg/ml的MTT溶液，放置在37°C培養箱孵育4h。4h后會形成藍紫色結晶甲瓚，棄上清。
[0050]每孔各加入150 μ L DMSO溶解藍紫色結晶甲瓚，酶標儀490nm波長檢測其細胞存
活率，并進一步計算增殖率和克隆數。
[0051]圖2是本發明的示例中四組樣品的細胞存活率的檢測結果的對比圖，從圖中可以看出分別用AZD20140、l、2、5yM處理非小細胞肺癌A549細胞株，處理時間分別為24h和48h,圖中顯示隨著AZD2014濃度和時間的增加，細胞存活率逐漸降低。
[0052]圖3是本發明的示例中四組樣品的增殖率的計算結果的對比圖，圖中黑色柱顯示的是單獨用AZD2014(0、1、2、5 μ Μ)處理后的Α549細胞存活率，灰色柱顯示的是用5 μ M2-DG分別聯合不同濃度的AZD2014 (0、1、2、5 μ Μ)處理后Α549細胞存活率，如圖所示，2-DG與AZD2014聯合處理后Α549細胞的存活率明顯低于單獨用AZD2014 (0、1、2、5 μ Μ)處理后Α549細胞的存活率。
[0053]圖4是本發明的示例中四組樣品的克隆數的計算結果的對比圖，從圖中可以看出
[0054]細胞克隆技術又稱單個細胞分離培養技術，即從細胞群體中分離出一個細胞，使其在體外培養體系中繁殖成新的細胞群體，這種由單個細胞所形成的細胞群(或集落)稱為一個細胞克隆，細胞克隆內的所有細胞保持均一性。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3-1.0mm之間。各種理化因素可能導致細胞克隆形成能力發生改變。通過一定的實驗方法可以對細胞克隆形成能力進行檢測。細胞克隆形成實驗常用于反映細胞群體依賴性和增殖能力。如圖所示，圖中黑色柱顯示的是單獨用AZD2014 (0、1、2、5μΜ)處理后的Α549細胞克隆形成數，灰色柱顯示的是用5 μ M2-DG分別聯合不同濃度的AZD2014(0、1、2、5 μ Μ)處理后Α549細胞克隆形成數，如圖所示，2-DG與AZD2014聯合處理后Α549細胞的克隆形成數明顯少于單獨用AZD2014 (0、1、2、5μΜ)處理后Α549細胞的克隆形成數。
[0055]綜上所述，加入抑制糖酵解的2-脫氧-D-葡萄糖后可顯著增強AZD2014對Α549細胞增殖的抑制效果。
[0056]依據本發明實施例，采用3_[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及2-脫氧-D-葡萄糖組成的組合藥物作用于非小細胞肺癌細胞株A549，其中，`3-[2，4_雙((3S)_3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑，2-脫氧-D-葡萄糖在肺癌細胞的增殖過程中產生糖酵解作用，通過實驗驗證，本發明創新提出的組合藥物中，加入2-脫氧-D-葡萄糖可顯著增強AZD2014對A549細胞增殖的抑制效果。
[0057]對于方法實施例，為了簡單描述，故將其都表述為一系列的動作組合，但是本領域技術人員應該知悉，本發明并不受所描述的動作順序的限制，因為依據本發明，某些步驟可以采用其他順序或者同時進行。其次，本領域技術人員也應該知悉，說明書中所描述的實施例均屬于優選實施例，所涉及的動作和部件并不一定是本發明所必須的。
[0058]以上對本發明所提供的一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物，一種抑制肺癌細胞增殖的藥物制劑以及一種肺癌細胞增殖的檢測方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在【具體實施方式】及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
【權利要求】
1.一種抑制肺癌細胞增殖的組合藥物，其特征在于，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
2.如權利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
3.一種抑制肺癌細胞增殖的藥物制劑，其特征在于，以抑制肺癌細胞增殖的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體； 所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549 ； 所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑。
4.如權利要求3所述的組合藥物，其特征在于，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
5.如權利要求3所述的組合藥物，其特征在于，所述制劑為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植入劑。
6.一種肺癌細胞增殖的檢測方法，其特征在于，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括: 選用指數生長期的肺癌細胞，采用胰酶消化肺癌細胞； 采用由組分1和組分2構成的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，并同時采用不同濃度的組分1處理所述肺癌細胞，組成多組對比樣品，所述組分1為3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺，所述組分2為產生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成，所述組分I在肺癌細胞的增殖過程中作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑； 在處理后加入染料溶液，放置在培養箱孵育得到藍紫色結晶甲瓚，棄除上清液； 采用二甲基亞砜溶解藍紫色結晶甲瓚，并用酶標儀在490nm波長下檢測肺癌細胞的存活率，按照所述存活率計算增殖率和克隆數，并分別比對不同樣品的增殖率和克隆數。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述組合藥物中所述組分I與所述組分2的摩爾濃度比為(0:5)~(5:5)。
【文檔編號】A61P35/00GK103800347SQ201410055201
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月18日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】湯郡, 鄒爭志, 聶培培, 陳穎, 莊元元, 彭碧玲, 何娟 申請人:廣州金域醫學檢驗中心有限公司