小分子多肽TAT-p53DM及其在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了小分子多肽TAT-p53DM及其在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用，利用人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和p53DM的融合蛋白多肽TAT-p53DM，TAT可以攜帶p53DM蛋白多肽經(jīng)血液穿過(guò)血腦屏障被神經(jīng)元攝取，將其運(yùn)用到離體和在體的缺血性卒中模型上，可有效發(fā)揮其阻斷神經(jīng)元死亡相關(guān)蛋白激酶1死亡結(jié)構(gòu)域（DAPK1DD）與腫瘤抑制蛋白p53DNA結(jié)合基序（p53DM）結(jié)合的生物學(xué)作用，抑制DAPK1下游引起神經(jīng)元凋亡與壞死的信號(hào)，降低缺血性卒中后腦損傷，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)臨床治療缺血性卒中的藥物提供了分子靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】小分子多肽TAT-p53DM及其在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)疾病治療藥物研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子多肽TAT-P53DM，還涉及小分子多肽TAT-p53DM在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]腦卒中以高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點(diǎn)，被公認(rèn)為目前嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見(jiàn)難治性疾病，缺血性腦卒中是由于腦血流中斷(缺血)引起的血栓形成或栓塞的一類嚴(yán)重神經(jīng)疾病，患者會(huì)突然出現(xiàn)癱瘓，語(yǔ)言功能損傷或視力喪失甚至死亡。在美國(guó)，通常每40秒就有一例腦卒中發(fā)生，每4分鐘就有一例死亡，據(jù)2007年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦卒中的死亡率高達(dá)41.6%。伴隨著人口老齡化，這個(gè)絕對(duì)數(shù)量還在逐漸上升。在幸存者當(dāng)中，70%的人工作能力受到損害，30%生活不能自理。因此，給家庭和社會(huì)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。在美國(guó)，2010年腦卒中的估計(jì)花費(fèi)在73.7億美元，而到2050年，會(huì)達(dá)到1.52萬(wàn)億美元。在俄羅斯和中國(guó)，每十萬(wàn)人口死亡率比美國(guó)高5-10倍。然而，針對(duì)腦缺血損害所采取的治療手段非常有限，目前唯一有效的治療是運(yùn)用組織纖溶酶原激活物(tPA)的溶栓療法。出于安全考慮和溶栓治療的時(shí)間窗較窄(〈4.5小時(shí))，多數(shù)患者只能得到對(duì)癥支持治療。迄今為止，實(shí)驗(yàn)室針對(duì)腦缺血治療所開(kāi)發(fā)的小分子化合物已超過(guò)1000種，并開(kāi)展了約200項(xiàng)臨床試驗(yàn)，但所有這些方法運(yùn)用到臨床都面臨失敗，因此，針對(duì)缺血性卒中腦損傷，探討新的治療方法對(duì)抗腦損傷減少神經(jīng)細(xì)胞死亡極其重要。
[0003]在局部缺血的情況下，缺氧缺糖會(huì)耗盡細(xì)胞能量，從而導(dǎo)致廣泛的有害細(xì)胞反應(yīng)。這些反應(yīng)包括離子穩(wěn)態(tài)的失衡，活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的產(chǎn)生，以及線粒體功能障礙。結(jié)果，細(xì)胞通過(guò)壞死和凋亡兩種途徑走向死亡。已知壞死和凋亡是通過(guò)多種信號(hào)通路如Ca2+超載和R0S/RNS產(chǎn)生所激活，并和谷氨酸遞質(zhì)(NMDA)受體的過(guò)度興奮有關(guān)。然而，谷氨酸受體也參與正常基因表達(dá)，神經(jīng)可塑性和神經(jīng)元存活等重要生理功能，因此直接拮抗谷氨酸受體并不是治療缺血性卒中的理想靶點(diǎn)。
[0004] TAT稱細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides),是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型的高效運(yùn)輸載體。TAT能穿透細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜，攜帶肽、蛋白質(zhì)和DNA分子等通過(guò)受體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)和胞核發(fā)揮生物效應(yīng)。為提高靶細(xì)胞在體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)移效率和蛋白質(zhì)表達(dá)提供了一個(gè)高效、簡(jiǎn)便的方法。目前的體內(nèi)及體外試驗(yàn)顯示HIV-TAT，可以穿過(guò)包括神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的所有組織細(xì)胞，且未觀察到明顯的毒副作用。TAT可以將與之相連的多肽或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而且在體內(nèi)可以通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸至腦組織，跨越血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，被帶入細(xì)胞的多肽或蛋白質(zhì)則保留了它們各自原有的生物活性，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。
[0005]基于 申請(qǐng)人:最近的研究與TAT技術(shù)， 申請(qǐng)人:合成了一個(gè)由P53DM的氨基酸271-282序列(270RVCACPGRDRRT281)組成的膜滲透性小分子多肽TAT_p53DM，通過(guò)運(yùn)用到離體和在體的缺血性卒中模型上，有效發(fā)揮其阻斷神經(jīng)元DAPK1DD與p53DM結(jié)合的生物學(xué)作用，抑制DAPKl下游引起神經(jīng)元凋亡與壞死的信號(hào)，降低缺血性卒中后腦損傷，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)臨床治療缺血性卒中的藥物提供了分子靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供了一種小分子多肽TAT-p53DM，其序列為SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明將 TAT 穿膜妝(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, YGRKKRRQRRR)與p53蛋白的DNA結(jié)合基序(p53DM)的一段氨基酸序列(氨基酸270-281, Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr, RVCACPGRDRRT)連接，得到具有生物活性的 TAT_p53D M小分子多肽，利用TAT的穿膜功能將p53DM多肽輸送進(jìn)入血液穿過(guò)血腦屏障，并被大腦神經(jīng)細(xì)胞攝取從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供了小分子多肽TAT-p53DM對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，具體為SEQ ID N0.2 7]\(tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc-cgcgtgtgcgcgtgcccgggccgcgatcgccgcacc)，但不局限于該序列，所有編碼TAT-p53DM多肽的核苷酸序列都為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種小分子多肽TAT-p53DM在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用，將其與神經(jīng)元細(xì)胞共同孵育或是靜脈注射，發(fā)現(xiàn)其可有效降低缺血性卒中后神經(jīng)元死亡(壞死與凋亡)，并明顯改善缺血后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀與行為學(xué)的效應(yīng)。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0010]本發(fā)明的思路如下:
[0011] 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn),缺血性卒中后，死亡相關(guān)蛋白激酶I (Death Associated ProteinKinasel, DAPKl)的死亡功能域(Death Domain, DD)和腫瘤抑制蛋白p53的DNA結(jié)合基序(DNA binding Motif, DM)相互作用，并介導(dǎo)下游神經(jīng)元壞死與凋亡。阻斷DAPK1DD與p53DM的相互作用，能有效降低缺血性卒中后神經(jīng)元死亡(壞死與凋亡)。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)， 申請(qǐng)人:將 TAT 穿膜妝(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, YGRKKRRQRRR)與 p53 蛋白DNA結(jié)合基序(p53DM)的一段氛基酸序列(氛基酸270-281, Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr, RVCACPGRDRRT)連接，獲得具有生物活性的 TAT_p53DM 多肽，通過(guò)對(duì)離體培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行孵育，TAT-p53DM多肽直接被神經(jīng)元攝取；也可通過(guò)在體靜脈注射方式，使TAT-p53DM多肽進(jìn)入血液穿過(guò)血腦屏障并被大腦神經(jīng)細(xì)胞攝取發(fā)揮其生物學(xué)功能。
[0012]一種小分子多肽TAT_p53DM，其序列如下:
[0013]Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-GIy-Arg-Asp-A rg-Arg-Thr (YGRKKRRQRRR-RVCACPGRDRRT)。
[0014]TAT-p53DM 的對(duì)照為 TAT_scramble-p53DM (TAT_s_p53DM)，其序列為:
[0015]Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-Thr-Ar g-Arg-Arg(YGRKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)。
[0016] TAT-p53DM多肽及其對(duì)照TAT_s-p53DM為商業(yè)化公司合成。
[0017]小分子多肽TAT-p53DM在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下:[0018](I) TAT-P53DM在缺血性卒中細(xì)胞模型的應(yīng)用
[0019]氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation, 0GD)被廣泛認(rèn)為是缺血性中風(fēng)的體外細(xì)胞模型。我們對(duì)體外培養(yǎng)10天的原代神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行OGD處理60分鐘和90分鐘，在60分鐘OGD處理的情況下，PI標(biāo)記出46%細(xì)胞壞死，TUNEL標(biāo)記出21%的細(xì)胞凋亡。當(dāng)培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)90分鐘OGD處理后，PI標(biāo)記出89%細(xì)胞，18%細(xì)胞對(duì)TUNEL出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)大部分細(xì)胞在OGD處理下死亡。用5 μ M的TAT-p53DM對(duì)培養(yǎng)的原代神經(jīng)元進(jìn)行孵育處理，OGD處理后的原代培養(yǎng)神經(jīng)元，被PI和TUNEL標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，說(shuō)明TAT-p53DM處理可以在細(xì)胞水平降低缺血后神經(jīng)元死亡。
[0020](2) TAT-p53DM在缺血性卒中動(dòng)物模型的應(yīng)用
[0021]大腦中動(dòng)脈栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCA0)是公認(rèn)的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停ㄟ^(guò)向小鼠頸動(dòng)脈中插入線拴堵塞大腦中動(dòng)脈能引起大腦中動(dòng)脈支配的皮層紋狀體缺血，拔出線拴，則引起血流再灌注，從而引起缺血再灌注損傷，以模擬臨床腦梗塞或腦栓塞的癥狀。通過(guò)TTC染色反映缺血梗死體積，TUNEL及FJ染色反映缺血后神經(jīng)元的死亡，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)Rotarod反映動(dòng)物協(xié)調(diào)平衡能力，神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分(Neurological Score, N.S.)反映缺血后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,水迷宮實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)與學(xué)習(xí)記憶能力。對(duì)動(dòng)物缺血再灌注后3小時(shí)和6小時(shí)的小鼠股靜脈注射lmg/ml的TAT_p53DM溶液，動(dòng)物缺血再灌注第7天處死，取出腦組織，TTC染色顯示給予TAT-p53DM的小鼠腦缺血梗死體積顯著低于對(duì)照組TAT-s-p53DM或生理鹽水Vehicle組。TUNEL及FJ染色顯示，給予TAT_p53DM的小鼠缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡數(shù)量顯著低于對(duì)照組TAT-s-p53DM或生理鹽水Vehicle組。此外，TAT_p53DM注射的小鼠轉(zhuǎn)棒行為學(xué)與水迷宮行為學(xué)結(jié)果均較TAT-s-p53DM或Vehicle組得到顯著改善。進(jìn)一步證明，TAT-p53DM對(duì)缺血性卒中模型具有確切的治療作用。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0023](I)本發(fā)明所涉及的小分子多肽TAT-p53DM合成純度高，完全可溶，適合靜脈注射，無(wú)毒副作用，便于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)；
[0024](2 )本發(fā)明利用人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和P53DM的融合蛋白多肽，意在采用靜脈注射的方式達(dá)到改善缺血性卒中后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,減少缺血性卒中神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦損傷的目的。本發(fā)明公開(kāi)的人工合成的TAT-p53DM重組蛋白多肽，TAT可以攜帶p53DM蛋白多肽經(jīng)血液穿過(guò)血腦屏障被神經(jīng)元攝取，可以轉(zhuǎn)化應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血性卒中，使其具有實(shí)際操作的可行性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為一種小分子多肽TAT-p53DM的人工合成色譜圖。
[0026]圖2為T(mén)AT-p53DM阻斷神經(jīng)元DAPK1DD與p53DM結(jié)合的結(jié)果示意圖。
[0027]圖3為離體細(xì)胞水平TAT-p53DM對(duì)缺血性卒中治療作用的流程圖。
[0028]圖4為T(mén)AT-p53DM減少OGD處理后神經(jīng)元壞死及凋亡的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0029]圖5為在體動(dòng)物水平TAT-p53DM對(duì)缺血性卒中治療作用的實(shí)施方案圖。
[0030]圖6為T(mén)AT_p53DM減少缺血性卒中后缺血梗死體積與神經(jīng)元死亡的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0031]圖7為T(mén)AT-p53DM改善缺血性卒中后運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0032]圖8為T(mén)AT-p53DM改善缺血性卒中后學(xué)習(xí)與記憶功能的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。在實(shí)施例中涉及的所有細(xì)胞培養(yǎng)，凋亡與壞死染色，缺血?jiǎng)游锬Ｐ停o脈注射以及組織學(xué)與行為學(xué)的所有操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)(①Tu W，Xu X, Peng L, ZhongX, Zh ang ff, Soundarapandian MM, Balel C，Wang M, Jia N, Zhang W，Lew F，Chan SL, Cheη Y, Lu Y (2010)DAPKlinteraction with NMDA receptor NR2B subunits mediates braindamage in stroke.Cel1140:222-234 ;② Yang Y, Shu X, Liu D, Shang Y,Wu Y, Pei L,X uX, Tian Q, Zhang J, Qian K, Wang YX, Petralia RS, Tu ff, Zhu LQ, Wang JZ, Lu Y (2012) EPACnull muTATion impairs learning and social interactions via aberrant regulati onof miR-124and Zif268translation.Neuron73:774-788.)的材料與方法部分說(shuō)明。
[0034]實(shí)施例1:
[0035]TAT-p53DM的人工合成
[0036]TAT-p53DM的序列為SEQ ID N0.1所示，由武漢百意欣生物技術(shù)有限公司人工合成，合成報(bào)告如下所示，色譜如圖1所示。
[0037]TAT-p53DM 人工合成 HPLC 報(bào)告
【權(quán)利要求】
1.一種人工合成的小分子多肽，其序列為SEQ ID N0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述小分子多肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQID N0.2所示。
4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的序列在制備治療或預(yù)防缺血性卒中藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的序列在制備治療或預(yù)防缺血性卒中小鼠藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的序列在制備降低缺血后神經(jīng)元壞死藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的序列在制備降低缺血后神經(jīng)元凋亡藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK103936838SQ201410141844
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】魯友明, 裴磊, 朱鈴強(qiáng), 徐傳瑞 申請(qǐng)人:武漢啟瑞科技發(fā)展有限公司, 華中科技大學(xué)