原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于獸藥【技術領域】，具體涉及原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用。所述應用中，原花青素添加必要的輔料制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、針劑或膏劑。本發明通過實驗證實，原花青素能夠提高大鼠腎小球數目，減小腎小囊囊腔寬和腎小球直徑，降低腎臟TGF-β1、TIMP-1和P16的表達量；提高pRB在大鼠腎臟組織的表達。也即是說，原花青素具有抗腎臟組織衰老的作用，能夠被用于制備抗畜禽腎臟組織衰老的藥物。
【專利說明】原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用藥物領域，具體涉及原花青素的新用途。

【背景技術】
[0002] 腎臟組織衰老是由干細胞衰退、DNA退化、衰老基因活躍以及飲食精神因素等各種 綜合因素而致的結果，以腎小球硬化、腎間質纖維化和腎小管萎縮為特征。腎臟衰老時實質 和間質細胞數逐漸減少，細胞的增殖能力減退，甚至完全停滯，使功能細胞難以更新，腎臟 萎縮，機能減退。同時，DNA損傷修復能力下降，最終引起腎功能不全甚至腎功能衰竭，進而 引起尿毒癥等一系列全身性疾病。
[0003] 動物與人一樣，隨著年齡的增加，其腎臟機能減退，腎臟內環境穩定能力與應激能 力下降，結構、組分逐步退行性變，并最終趨向死亡。腎臟隨年齡而衰老是一種不可逆轉的 現象。然而人類基于其所掌握的科學知識和對自身生命的愛惜，勤于保養，則可以延緩腎臟 組織的衰老過程。
[0004] 隨著人類社會的發展，動物的生命價值也逐漸受到重視。尤其是一些寵物狗寵物 貓等，它們經常被視作家庭成員的一部分，采用一定措施延緩其腎臟的衰老，換取更長久的 相互陪伴，已成為眾多動物主人的迫切需求。此外，對于生產型畜禽，遭遇急性、亞急性腎衰 時如果不予救治，既會給廣大飼養者帶來極大的損失，亦不符合人道主義法則。因此，開發 適于動物使用的抗腎臟衰老藥物，已經成為獸藥領域亟待解決的問題。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是為了提供一種原花青素的新用途。
[0006] 基于上述目的，本發明采取了如下技術方案：原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰 老藥物中的應用。
[0007] 所述應用中，原花青素添加必要的輔料制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、針劑或 膏劑。其給藥方式可以為口服給藥、注射給藥或透皮給藥。
[0008] 原花青素是Oligomeric Proantho Cyanidins (0PC)的中文學名，是一種有著特 殊分子結構的生物類黃酮，一般為葡萄籽提取物或法國海岸松樹皮提取物。原花青素通常 為紅棕色粉末，氣微、味澀，溶于水和大多有機溶劑，具有非常強的體內活性，能夠清除體內 自由基。實驗證明，0PC的抗自由基氧化能力是維生素 E的50倍、維生素 C的20倍，并且 能夠迅速被機體完全吸收，口服20分鐘即可達到最高血液濃度，代謝半衰期達7小時之久。
[0009] 本發明通過大量實驗證實，原花青素能夠提高大鼠腎小球數目，減小腎小囊囊腔 寬和腎小球直徑，降低腎臟TGF-β ρ --ΜΡ-1和P16的表達量；提高pRB在大鼠腎臟組織的 表達。也即是說，原花青素具有抗腎臟組織衰老的作用，能夠被用于制備抗畜禽腎臟組織衰 老的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是正常組大鼠與模型組大鼠外周血血清SOD值比較圖； 圖2是正常組大鼠與模型組大鼠外周血血清MDA值比較圖； 圖3是各組腎臟組織HE染色結果對比圖； 圖4是各組TGF-β 1和--ΜΡ-1的表達對比圖； 圖5是各組P16和pRB蛋白的表達對比圖。

【具體實施方式】
[0011] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0012] 實施例1 原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用：將原花青素粉裝入膠囊直接制成 膠囊劑。
[0013] 實施例2 原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用：按重量比稱取原花青素10份、淀 粉30份、糊精25份、蔗糖25份，制成片劑。
[0014] 實施例3效果實驗 (一）材料與方法 1. 1實驗動物 選用8周齡SD雄性大鼠100只，體重180-220g，購自西安交通大學動物醫學院實驗動 物中心。
[0015] 1.2藥品及試劑 原花青素，美國sigma公司生產；D-半乳糖購自上海試劑二廠；S0D試劑盒購自南京 建成生物工程公司；MDA試劑盒購自南京建成生物工程公司；TGF-β i和--ΜΡ-1多克隆抗 體購自美國Santa Cruz公司；pl6和pRB單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗羊， 兔抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；SP二抗試劑盒購自北京中山生物技術公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中山生物技術公司；APES購自北京中山生物技術公司；細胞裂解試 劑盒購自北京泰格美生物技術公司；BCA蛋白質定量檢測試劑盒購自北京泰格美生物技 術公司；Prestained Protein Marker購自上海吉泰新繹生物科技有限公司；PVDF膜購自 Millipore公司；ECL顯色系統購自北京泰格美生物技術公司。
[0016] 1.3實驗儀器 CSR-1-30型超純水機購自北京愛思泰克公司；Morris水迷宮購自中國醫學科學院藥 物研究所；S648型電熱恒溫水浴箱購自上海躍進醫療器械廠，恒溫范圍（37-KKTC);電熱 恒溫水浴鍋購自上海醫療器械三廠；細胞培養箱，日本三洋；制冰機購自日本SANK)公司； HXGL00450A型醫用干燥箱購自江蘇省墟溝電器廠；電熱壓力蒸汽消毒鍋購自山東安得醫 療科技有限公司；TDL-40B離心機購自上海安亭科學儀器制造廠；S0RVALL Biofuge fresco 低溫離心機購自德國；低溫冰箱，日本SANYO公司；ESJZ00-4電子天平購自沈陽龍騰電子有 限公司；液體快速混合器YKH- I型購自江西醫療器械廠；HI98127酸度計購自HANNA公司； 10 μ 1微量移液器購自Eppendorf公司；20 μ 1微量移液器購自Eppendorf公司；50 μ 1微 量移液器購自Eppendorf公司；200 μ 1微量移液器購自Eppendorf公司；1000 μ 1微量移 液器購自Eppendorf公司；ΒΗ-2型OLYMPUS顯微鏡及攝像裝置購自日本；光學顯微鏡購自 Olympus ;SZX-B水浴振蕩器購自哈爾濱市東方電控開關廠；Hand Depress封口機器購自溫 州市鼎力機械包裝有限公司；1670掃描儀購自EPSON ;勻漿器，玻璃板、膠條、梳子，DYY-7型 轉移電泳儀，DYY-6B型穩壓穩流轉移電泳儀購自北京市六一儀器廠。
[0017] 1.4實驗設計和方法 1.4. 1亞急性衰老大鼠模型的制備 隨機選取大鼠20只作為正常組（腹腔注射等量的生理鹽水），其余大鼠腹腔注射6%的 D-半乳糖溶液（用生理鹽水稀釋），按300mg/kg/d給藥，連續注射60d，建立亞急性衰老大 鼠模型。在造模的過程中測定衰老大鼠的外周血血清S0D、MDA含量的變化，并進行Morris 水迷宮行為測試，以確定模型是否建立成功。
[0018] 1. 4. 2動物的分組及處理 選用造模成功的衰老大鼠，隨機分為：模型組、原花青素保護組（低、中、高劑量）組，每 組20只。模型組、正常組灌胃等量的生理鹽水，其它各組分別灌胃原花青素（低、中、高劑 量），連續60d。低劑量按10 mg/kg/day，中劑量按20 mg/kg/day，每天灌胃一次。高劑量 組按40 mg/kg/day，每天分兩次灌胃。
[0019] 標本處理：（1)每組選用10只大鼠經4%多聚甲醛灌注固定，取雙側腎，常規石蠟 包埋、切片，片厚5μπι。HE染色觀察腎臟形態結構的變化，顯微鏡下計數腎小球數目，測量 腎小囊囊腔寬和腎小球直徑；SP免疫組織化學方法檢測腎臟中TGF-β i 4Ρ--ΜΡ-1的表達。 (2)其余大鼠斷頭處死，取雙側腎，液氮中保存，采用Western Blotting方法檢測大鼠腎臟 組織pRB和P16含量。
[0020] 1. 4. 3測定外周血血清SOD、MDA的含量 參照南京建成生物工程公司試劑盒說明書方法操作。
[0021] 1.4. 4 Morris水迷宮進行定位航行測試 定位航行試驗通過對訓練大鼠游泳尋找平臺，觀測其逃避潛伏期長短可檢測動物的學 習能力，以確定模型是否建立成功。共歷時5d，每天上午、下午各2次。將大鼠面向池壁分 別從各象限的4個入水點放入水中，記錄其在60s內尋找到平臺的時間。如果大鼠在60s 未找到平臺，潛伏期記為60s，并由實驗者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留20s，再放回籠 中。每次間隔時間為lh，記錄第5d的逃避潛伏時間。
[0022] 1.4.5形態學染色切片的制備 1.4. 5. 1取材及固定 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（5ml/kg)麻醉，開胸，經左心室插管入主動脈，灌注 PBS(0. 01m〇l/L，pH 7. 4)，待沖干凈血液后，灌注預冷的4%多聚甲醛，然后取雙側腎，切成 小塊，放入4%多聚甲醛后固定過夜。
[0023] 1.4. 5. 2 脫水、包埋 將固定好的腎組織塊經常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。
[0024] 1.4. 5. 3連續切片，片厚5 μ m，每隔30張取蠟帶分別貼于涂有蛋白甘油（用于普 通HE染色）和APES (用于免疫組化）的載玻片上。
[0025] 1. 4. 6 HE 染色 1. 4. 6. 1染色方法 常規蘇木精-伊紅染色，脫水、透明、封片。
[0026] 1.4.6.2 鏡下計數 100倍視野下計數腎小球數目。每只動物計數3張切片，每張切片10個視野。400倍 視野下每片選取10個腎小球（能看到血管極或尿極），用測微尺測量腎小囊囊腔寬和腎小 球直徑。
[0027] 1. 4. 7免疫組織化學染色 1. 4. 7. 1染色方法 切片脫蠟至水后，PBS(0. 01mol/L，PH 7. 4)浸泡沖洗3次，每次5min -入3%過氧化氫 -甲醇液，室溫下孵育30min以消除內源性過氧化物酶的活性一蒸餾水沖洗，PBS浸泡沖 洗3次，每次5min -滴加正常山羊血清，37°C恒溫箱濕盒內孵育30min -濾紙吸去血清，滴 加稀釋后（1:100)的兔抗了6?-01和1'頂?-1多克隆抗體，4°C冰箱濕盒內過夜（20h) - PBS 浸泡沖洗3次，每次5min -滴加生物素標記的二抗（羊抗兔IgG)，37°C恒溫箱濕盒內孵育 30min - PBS浸泡沖洗3次，每次5min -滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，37°C恒 溫箱濕盒內孵育30min - PBS浸泡沖洗3次，每次5min - DAB顯色（lml蒸饋水加 Buffer 緩沖液、DAB顯色液及過氧化氫各一滴，充分混勻后使用），光鏡下監視一PBS浸泡沖洗，終 止顯色一蘇木精復染一梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0028] 陰性對照用PBS替代一抗，其余步驟相同。
[0029] 1.4. 7. 2 結果判定 細胞內出現棕黃色粗顆粒或細膩顆粒彌漫分布為陽性反應。
[0030] 1. 4. 7. 3定量數據處理 TGF- β i和--ΜΡ-1陽性率用Mivnt圖像分析儀進行分析，每張切片隨機選取10個視野， 每個視野計數總細胞數和陽性細胞數，計算出陽性細胞的百分比。每組計數3只動物的腎 臟，每個標本計數3張切片。
[0031] 1. 4. 8 Western blotting 檢測 1.4.8. 1腎組織蛋白質提取 將腎組織加入預冷的PBS (含lmol/L NaF)后勻楽，離心（3000r/min，5min)，棄上清，力口 PBS混勻再次離心，直到上清液清亮為止。
[0032] 在沉淀中加入細胞裂解液，置冰上反應5min,振蕩器上震蕩30s,如此反復共 40min后，4?條件下離心（12000r/min, 15min)，收集上清液，即為提取的蛋白質。
[0033] 1.4. 8. 2蛋白質濃度測定 按B以蛋白含量定量法測定蛋白質濃度。
[0034] 1. 4. 8. 3免疫印跡法 制備4%積層膠和分離膠（P16-12%，pRB-8%)，將每例蛋白取量40 μ g，5倍上樣緩沖液混 合均勻，沸水浴5-10min，自然冷卻后用微量加樣器依次加入上樣孔內，以積層膠穩壓80V， 分離膠穩壓120V進行電泳，直至溴酚藍移動至膠底部終止電泳。然后用濕式電轉移法將蛋 白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h。分別加入鼠抗鼠 P16抗體（1:200, Santa Cruz，CA)和羊抗鼠 pRB抗體（1:1000，Cell Signaling)，搖床室溫孵育lh或4°C過夜。 TBST洗膜3次，每次lOmin。分別加入過氧化物酶標記的兔抗羊和兔抗鼠 IgG(l:1000)，搖 床室溫孵育lh，TBST洗膜3次，每次lOmin。將PVDF膜平鋪于保鮮膜上，加入ECL試劑，室 溫下反應3min，在暗盒內曝光2_5min，顯影，定影。
[0035] 1.5統計分析 所有數據均以（X 土s)表示，應用SPSS19.0統計軟件進行統計處理。采用方差分析， 兩兩之間采用q檢驗，標準α =〇. 05。
[0036] (二）實驗結果 2. 1血清SOD、MDA含量的變化 如圖1和2所示，通過對比正常組大鼠與模型組大鼠外周血血清的S0D值和MDA值可 知，模型組大鼠的外周血血清S0D含量明顯降低、MDA含量明顯升高，與正常組大鼠相比有 顯著性差異（P〈〇.〇l)。
[0037] 2. 2 Morris水迷宮定位航行測試結果 前2d正常組和模型組成績無顯著性差異，隨學習時間的延長各組潛伏期均逐漸縮短， 連續5d的定位航行實驗發現，模型組的潛伏期與正常組比較明顯延長（P〈0. 01)，表明模型 建立成功。
[0038] 2.3腎臟組織HE染色結果 正常組腎小球分布密集，呈圓形或橢圓形，外周規整，血管球內毛細血管襻密集，腎小 囊的囊腔狹小。腎小管的管腔大多為規整、狹小。模型組腎小球分布稀疏，腎小球直徑明顯 增大，腎小囊囊腔顯著增寬，血管球不規則而松散，體積縮小，縮向血管極一側，并可見散在 的空泡樣腎小球。腎小管多數管腔擴大，上皮細胞低矮變薄或有體積明顯增大。可見淋巴 細胞浸潤。
[0039] 原花青素用藥后，腎臟組織的形態有所改善。圖3是各組腎臟組織HE染色結果的 對比圖，從圖3可知，與模型組比較：原花青素低劑量組腎小球數目有所增加，腎小囊囊腔 和腎小管管腔縮小，但無統計學意義（P>〇. 05)，中高劑量組改善明顯，高劑量組明顯好于其 余各組（P〈〇. 01)。
[0040] 2. 4 TGF- β i在腎臟組織的表達 免疫陽性產物表達在細胞質，呈棕黃色或棕褐色，分布在腎小球毛細血管管壁，腎小 球壁層細胞，腎小管間質及間質血管管壁。如圖4所示，模型組除分布在上述部位外，腎 小管上皮細胞也見表達，陽性率明顯高于正常組（P〈〇. 01)。原花青素各組隨劑量的增高 陽性率呈下降趨勢。其中高劑量組和模型組有顯著差異（P〈〇. 01)，并且好于其余治療組 (Ρ〈0· 05)。
[0041] 2. 5 --ΜΡ-1的表達變化 免疫陽性產物表達在細胞質，呈棕黃色或棕褐色，位于腎小球球內系膜細胞、腎小管間 質和腎小管上皮細胞，腎小球毛細血管管壁見少量表達。如圖4所示，模型組ΤΙΜΡ-1的陽 性率明顯高于正常組（Ρ〈〇. 01);原花青素低、中劑量組--ΜΡ-1的表達有所下降，但與模型 組比較無顯著差異（Ρ>〇. 05);原花青素組與模型組比較有差異（Ρ〈0. 05);高劑量組和模 型組差異顯著（P〈〇.〇l)。
[0042] 2. 6 Ρ16蛋白的表達變化 Western Blotting結果顯示（圖5):模型組大鼠腎臟組織Ρ16含量明顯高于正常組 (P〈〇. 01);原花青素組大鼠腎臟組織P16含量均低于模型組，且呈劑量依賴性，尤以高劑量 組與模型組差別顯著（Ρ〈〇·〇1)。
[0043] 2. 7 pRB蛋白的表達變化 Western Blotting結果顯示（圖5):正常組大鼠腎臟組織pRB含量明顯高于模型組 (P〈〇. 01)，原花青素組大鼠腎臟組織pRB含量均高于模型組，其中高劑量組大鼠腎臟組織 PRB蛋白含量水平最高，與模型組差別顯著（P〈0. 01)。
[0044] (三）結論 實驗結果表明，原花青素能夠使衰老畜禽腎臟腎小球數目增多，使腎小囊囊腔縮窄，腎 小球直徑變小等，從而改善畜禽腎臟組織的形態結構；能降低畜禽腎臟組織TGF-β i的表 達，從而減少ECM在腎間質的過量沉積，減輕腎間質的纖維化和腎小球的硬化；能降低衰老 畜禽腎臟組織TIMP-1的表達，提高明膠酶MMP的活性，促進ECM的降解，減輕腎間質的纖維 化和腎小球的硬化；能降低畜禽腎臟組織P16蛋白含量，磷酸化形式的RB含量顯著升高，解 除細胞周期停滯，使細胞順利進入S，促進細胞增殖，從而延緩衰老。也即是說，原花青素能 起到延緩腎臟衰老的作用，可用于制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物。
【權利要求】
1. 原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用。
2. 如權利要求1所述原花青素在制備抗畜禽腎臟組織衰老藥物中的應用，其特征在 于，原花青素添加必要的輔料制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、針劑或膏劑。
【文檔編號】A61P39/06GK104083358SQ201410243447
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】孫江宏, 李坤鵬, 管倩 申請人:河南牧翔動物藥業有限公司