具有抗腫瘤活性的PD-L1 IgV親和肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的靶向PD-L1?IgV的親和肽產品及其制備和應用。該親和肽特異性結合于PD-L1?IgV區，其氨基酸序列為ANGSRLV，分子量為715.4。該親和肽可通過Fomc固相多肽合成法人工合成制備，可在制備抗結腸癌（CT26）藥物中作為主要活性成分發揮作用。本發明通過利用噬菌體展示肽庫篩選技術，以PD-L1?IgV為靶點進行高通量的篩選，人工合成了具有抗腫瘤活性的親和肽。發明人進一步證明了本發明所提供的親和肽具有較好的抗腫瘤活性，能明顯抑制小鼠體內腫瘤的增長，從而為基于PD-L1的藥物研究和開發提供新的思路和理論基礎。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的PD-L1 I gV親和肽及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種具有抗腫瘤活性多肽產品的篩選、 制備及應用，更具體的，本發明涉及一種具有抗腫瘤活性的靶向ro-Li igv的親和肽產品及 其制備和應用。

【背景技術】
[0002] 近年來，腫瘤的防控形勢非常嚴峻。隨著臨床診斷、手術治療、化療和放療等水平 的提高，使得一部分病人能夠得到早發現、早治療，并且獲得較好的預后，但是，尋找新的治 療手段和治療藥物一直是全球范圍內的研究熱點。與傳統的治療方法相比，腫瘤免疫治療 能夠激活或者誘導腫瘤患者建立起對腫瘤抗原的特異性免疫應答，清除原發的腫瘤細胞， 并且建立免疫記憶，阻止腫瘤的復發和轉移。
[0003] 在腫瘤免疫治療過程中，負性共刺激分子主要介導免疫耐受和逃逸，而前人在腫 瘤免疫治療過程中遇到的最大挑戰就是由于腫瘤免疫耐受和逃逸所導致的療效不佳。因 此，探討通過抑制負性共刺激分子所介導的信號通路以打破機體已經建立的對腫瘤細胞的 免疫耐受具有重要的理論意義和應用價值。
[0004] T細胞的激活需兩個來自細胞外的信號刺激，即淋巴細胞活化的雙信號作用。細胞 活化的第一信號主要來自細胞抗原識別受體（TCR )與MHC分子抗原肽復合物的特異性結 合，此過程為抗原識別。細胞活化的第二信號又稱共刺激信號，是由抗原遞呈細胞（APC)和 細胞表面的粘附分子對提供。這些粘附分子被稱為共刺激分子，是一類細胞膜表面分子，可 為T、B細胞的活化提供輔助信號，從而調節細胞的增殖、活化及分化。根據產生的效應不 同，可將共刺激分子分為正性共刺激分子和負性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、 IC0S、4-1BB等分子，而負性共刺激分子則包括CTLA-4、PD-1、--Μ-3等分子。
[0005] Η)-1 /PD-L1作為B7/⑶28家族成員，已被證實通過抑制T細胞的活化和增殖來 負調控免疫應答，并在調節免疫耐受、腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用。因而利用H)-L1的阻 斷劑作為腫瘤免疫治療藥物或佐劑具有很好的應用前景和安全性，而現有技術中，尚缺少 較好的ro-Li的阻斷劑產品。


【發明內容】

[0006] 本發明目的在于提供一種具有較好抗腫瘤活性的靶向ro-Ll IgV的親和肽產品， 可以特異性利用ro-Li蛋白IgV區（PD-L1 IgV)作為結合靶點，從而最終阻斷ro-1 /PD-L1 的活化，解除對T細胞的活化和增殖的抑制作用，從而發揮抗腫瘤作用。
[0007] 具體而言，本發明采用的技術方案如下： 一種具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll Igv親和肽，特異性結合于ro-Ll Igv區，其氨基酸序 列為：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子量為 715. 4。
[0008] 所述具有抗腫瘤活性靶向H)-L1 IgV親和肽，添加藥學上可接受的載體或/和添 加劑后，在制備抗結腸癌（CT26)藥物中作為主要活性成分發揮作用。
[0009] 所述具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll IgV親和肽，通過Fomc固相多肽合成法人工合成 制備。
[0010] 在對靶點進行高通量篩選親和肽過程中，發明人采用了庫容量大、操作簡便的噬 菌體展示肽庫技術進行了篩選。噬菌體展示肽庫技術是將外源蛋白或多肽序列插入在M13 喔囷體衣殼蛋白P III的N末端，通過蛋白的融合表達將插入的隨機多膚序列展不在喔囷體 表面。由于展示多肽位于P III的N末端，這些小肽通常能夠保持較為獨立的空間結構，從而 能夠模擬配體與特異性受體靶標相互作用。
[0011] 本發明通過利用噬菌體展示肽庫篩選技術，以ro-Ll IgV為靶點進行高通量的篩 選，人工合成了具有抗腫瘤活性的親和肽。發明人進一步通過小鼠體內荷瘤實驗，證明了本 發明所提供的靶向ro-Li igv親和肽具有較好的抗腫瘤活性，能明顯抑制小鼠體內腫瘤的 增長，從而為基于ro-Li的藥物研究和開發提供新的思路和理論基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是ELISA鑒定親和肽噬菌體單克隆與ro-Ll的親和力結果圖； 圖2是親和肽的質譜鑒定圖； 圖3是親和肽對荷CT26結腸癌小鼠體重變化的影響結果圖； 圖4是親和肽對荷CT26結腸癌小鼠瘤體積變化的影響結果圖； 圖5是親和肽對荷CT26結腸癌小鼠移植瘤的瘤重圖。

【具體實施方式】
[0013] 下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0014] 實施例1 本發明所提供的具有抗腫瘤活性靶向ro-Li igv親和肽，特異性結合 于ro-Li igv區，是利用噬菌體展示肽庫技術篩選得到的，其氨基酸序列為： Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子量為 715. 4。
[0015] 由于單抗藥物的成本高昂，且不能大規模生產，因此，我們選用由原核表達純化的 PD-L1 IgV區蛋白作為靶點，通過噬菌體展示技術來篩選得到能與ro-Ll IgV特異性結合的 多肽，用以阻斷ro-1/PD-Ll信號通路。為便于本領域技術人員實施本發明，對其篩選過程 簡要說明如下： 篩選過程中所用培養基和主要溶液的配制說明如下： LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，加超純水定容至1 L， 121 °C高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后室溫貯存備用。
[0016] LB固體培養基：1 L LB液體培養基中加入15 g瓊脂粉，加熱使瓊脂粉充分溶解， 攪拌均勻并分裝為1〇〇 mL/瓶，121°C滅菌20 min，冷卻至室溫后貯存備用。
[0017] LB/IPTG/Xgal平板：將100 mL LB固體培養基用微波爐加熱溶解，冷卻至60°C左 右時，加入75 μ L IPTG/Xgal，小心混勻，避免產生氣泡，傾倒入六孔板。平板于4°C冰箱避 光貯存備用。IPTG/Xgal按以下配方制備：稱取0.5 g IPTG和0.2g Xgal溶于5 mL DMF (N，N-二甲基甲酰胺）中，混勻后分裝為300 μ L小份，于-20°C避光貯存。
[0018] 上層瓊脂：稱取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，MgCl2 · 6H20 1 g，瓊脂糖 7 g，加超純水定容至1L，微波爐煮沸3次，使瓊脂糖充分溶解，冷卻至60°C左右，分裝成60 mL的小份，121°C高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后室溫存放備用。
[0019] LB-Tet (四環素）平板：微波爐加熱溶解100mL LB固體培養基，冷卻至60°C左右 時，加入100 μ L Tet貯液，混勻后傾倒六平板，待冷卻凝固后4°C避光貯存，一周內使用完。 四環素（Tet)貯液按以下配方制備：稱取200 mg鹽酸四環素，溶于10 mL的無水乙醇中，分 裝為300 μ L小份，于-20°C避光貯存。
[0020] 包被液-0· 1 M NaHC03緩沖液（pH 8. 6):稱取NaHC03 0· 84g用80mL三蒸水溶解 后用似0!1調？!1至8.6，定容至10〇1^，1211：高壓蒸汽滅菌2〇1^11，冷卻后41：存放備用。
[0021] 封閉液-0· 1M NaHC03 (pH8. 6)、5 mg/mL BSA :稱取 NaHC03 0· 84 g、BSA 0· 5 g 用 80mL三蒸水溶解后用NaOH調pH至8. 6,定容至100mL，過濾除菌，分裝為5 mL小份，4°C貯 存備用。
[0022] 洗脫液-0· 2 Μ 甘氨酸-HC1 緩沖液（pH 2. 2)、1 mg/mL BSA :量取 50mL (λ 2M 甘氨 酸溶液和44 mL 0. 2Μ HC1溶液，加入200 mg BSA，加水定容至200 mL，過濾除菌，4°C備用。
[0023] 中和液-1M Tris-HCl緩沖液（pH 9. 1):稱取12. 114 g Tris堿，適量超純水溶解， HC1調pH至9. 1，定容、過濾除菌，分裝備用。
[0024] TBS緩沖液-50 mM Tris-HCL(PH7. 5)、150mM NaCl :按以下步驟制備，第一步先稱 取6. 055 g Trisbase，用少量雙蒸水（30(T500ml)溶解，再用濃HC1將pH調至7. 5，最后加 雙蒸水至1000 ml，此步驟制備得Tris緩沖液（50 mM，PH7. 5);第二步稱取NaCl 8. 766g， 先以少量雙蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制備的Tris緩沖液（50 mM，pH7. 5)100ml，最后 加雙蒸水至l〇〇〇ml，充分搖勻，高壓滅菌即得。
[0025] 洗滌液（TBST) :0· 1% (v/v) Tween-20 TBS，TBS 即前述 TBS 緩沖液。
[0026] PEG/NaCl :稱取 PEG-8000 20 g，NaCl 14. 61 g，加超純水定容至 100 mL，121°C 高 壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫，4°C貯存備用。
[0027] TMB儲存液：稱取10 mg TMB溶于1 mL DMS0,4°C避光保存備用。
[0028] TMB底物緩沖液-磷酸-檸檬酸緩沖液（pH 5. 0):按以下步驟制備：首先制備0. 1 M/L檸檬酸液，即稱取檸檬酸（C6H807 *H20)19. 2g，加水至1000 mL，為甲液；然后制備0. 2 M/L磷酸氫二鈉液體，即稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04)71. 7 g，加水至1000 mL，為乙液；最后取 甲液24. 3 mL，乙液25. 7 mL，加水定容至100 mL，即為TMB底物緩沖液-磷酸-檸檬酸緩沖 液（pH 5.0)。
[0029] TMB底物顯色液：取100 μ L TMB貯存液于溶于上述10 mL TMB底物緩沖液-磷 酸-檸檬酸緩沖液（pH 5.0)中，再加入體積分數為30% H202 10 μ L，混勻即可，需要注意的 是ΤΜΒ底物顯色液需現配現用。
[0030] 終止液：為濃度為2 M/L的硫酸液。
[0031] 篩選步驟： (1) 包被：將原核表達并純化的ro-Li蛋白的Igv區，經過尿素濃度梯度復性后得到目 的蛋白ro-LlIgV(溶于0· 1M pH 8. 6的NaHC03溶液)。用目的蛋白包被96孔板，15 μ g/ 孔（150μ?，100μ g/mL)，密閉濕盒4°C孵育過夜； (2) 封閉：棄去包被液，用槍頭吸出剩余殘液并迅速加滿封閉液，密閉濕盒4°C孵育3 h ； (3) 洗滌：TBST洗滌6次，每次不少于2 min，注意無菌操作，動作要快以免微孔板干 燥； (4) 結合：快速加入預先用TBST稀釋至滴度為2X1011的文庫的噬菌體100 μ L/孔，室 溫溫和搖動lh ;在這個過程中，與靶蛋白具有親和力的噬菌體會結合在蛋白上； (5) 洗滌：TBST洗滌10次，洗去未結合的噬菌體； (6) 洗脫：每孔加入100 μ L洗脫液，室溫溫和搖動20min ; (7) 中和：用移液槍小心吸出洗脫的噬菌體，轉移至預先已加好15 μ L中和液的滅菌 離心管中，溫和吹打混勻； (8) 擴增：把第一輪篩選得到的噬菌體與大腸桿菌ER2738加入LB液體培養基（Tet+) 中共同培養，進行擴增和純化，得到次級肽庫； (9) 滴度測定：分別對各輪篩選得到的噬菌體以及擴增后的次級肽庫在LB/IPTG/Xgal 平板上進行噬菌體滴度測定，并進行回收率計算，噬菌體回收率=[洗脫噬菌體數/投入噬 菌體數]X 100% ; (10) 重復篩選：將擴增得到的噬菌體投入下一輪篩選，重復上述篩選過程。經5輪親 和篩選，即可使得含目的多肽的噬菌體得到高度富集； (11) 測序：挑取第五輪篩選后的滴度測定平板上的噬菌斑進行擴增，取200 μ L新鮮 擴增的噬菌體貯存液送往金唯智測序公司進行全自動測序，測序引物為-96 gill測序引物： 5' -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。
[0032] 多肽序列分析：根據DNA測序結果推導其所編碼的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨 基酸序列。
[0033] 篩選結果： (1)分別對各輪篩選得到的噬菌體洗脫液進行滴度測定，并計算投入噬菌體回收率，結 果見下表。

【權利要求】
1. 一種具有抗腫瘤活性靶向ro-Li Igv親和肽，其特征在于，該親和肽特異性結合于 FO-Ll IgV 區，其氛基酸序列為：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子 量為715. 4。
2. 權利要求1所述具有抗腫瘤活性靶向H)-L1 IgV親和肽在制備抗結腸癌藥物的應 用。
3. 權利要求1所述具有抗腫瘤活性靶向ro-Ll IgV親和肽的制備方法，其特征在于，通 過Fomc固相多肽合成法制備。
【文檔編號】A61K38/08GK104098651SQ201410303775
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】高艷鋒, 劉蓓媛, 祁元明, 李國棟, 李雯雯, 陳鯉翔, 趙園園, 周秀曼 申請人:鄭州大學