復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，該方法包括制備復方女貞子；將實驗小鼠分組及處理，用于豬多殺性巴氏桿菌半數致死量的測定；飼喂結束后，對小鼠進行碳粒廓清試驗；對小鼠進行溶菌酶活性的測定；進行豬多殺性巴氏桿菌對小鼠半數致死量的測定；對感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護作用；數據分析。本發明驗證了復方女貞子作為飼料添加劑可以通過提高免疫器官指數，增加單核-巨噬細胞的活性，顯著提高溶菌酶活性，從而達到對感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠良好的保護作用。
【專利說明】復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥理實驗領域，尤其涉及一種復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小 鼠模型的構建方法。

【背景技術】
[0002] 中國是世界上最重要的生豬養殖和豬肉消費大國，擁有悠久的養豬傳統。多殺性 巴氏桿菌病是豬場常見病之一，目前主要使用疫苗預防該病，但是該菌分布廣泛，血清型 多，致使疫苗預防效果不佳。現代中藥藥理學研究表明，"滋補"類中藥具有一定的免疫增強 作用，本發明根據中藥配伍原則和組方理論，將性能相關的中藥配合應用，篩選和優化經驗 配方得到女貞子、淫羊藿、白術、茯苓四味中藥組成"復方女貞子"作為免疫增強劑飼喂小白 鼠，考察其對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠的保護作用及其機理。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構 建方法，旨在考察復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠的保護作用及其機理。
[0004] 本發明是這樣實現的，一種復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建 方法包括：
[0005] 步驟一、用女貞子、淫羊藿、白術、茯苓制備復方女貞子，女貞子、淫羊藿、白術、茯 苓的質量比為2 : 1.5 : 1 : 1;以藥材的10倍水量采用水提法提取濃縮制成1 : 1的復 方女貞子藥液（lmL藥液相當于lg原藥材），再分別稀釋成1 : 20、1 : 40和1 : 80的復 方女貞子藥液，均勻噴霧于全價鼠料的表面，制成含復方女貞子0.05%、0. 1 %、0. 15% (w/ w)的鼠料，備用；
[0006] 步驟二、將實驗小鼠分組及處理，用于豬多殺性巴氏桿菌半數致死量的測定；
[0007] 步驟三、飼喂結束后，對小鼠進行碳粒廓清試驗；
[0008] 步驟四、對小鼠進行溶菌酶活性的測定；
[0009] 步驟五、進行豬多殺性巴氏桿菌對小鼠半數致死量的測定；
[0010] 步驟六、對感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護作用；
[0011] 步驟七、數據分析。
[0012] 進一步，所述的制備復方女貞子的具體方法為：
[0013] 以藥材的10倍水量采用水提法提取濃縮制成1 : 1的復方女貞子藥液（lmL藥液 相當于lg原藥材），再分別稀釋成1 : 20、1 : 40和1 : 80的復方女貞子藥液，均勻噴霧 于全價鼠料的表面，制成含復方女貞子0.05%、0. 1^^0.15% (w/w)的鼠料，備用。
[0014] 進一步，將實驗小鼠分組及處理的具體方法為：
[0015] 80只3周齡和60只8周齡SPF級白雄鼠，飼喂滅菌飼料和飲水，室內溫度為28°C， 相對濕度為（50± 10) %，動物飼養適應3天后進行試驗，將80只3周齡小鼠隨機分成4組， 每組20只，I、ΙΙ、ΠΙ組為實驗組，分別飼喂含復含方女貞子0.05%、0. 1%、0. 15% (w/w)的 鼠料，IV組為對照組，飼喂普通鼠料，連續飼喂30d，60只7周齡小鼠用于豬多殺性巴氏桿菌 半數致死量的測定。
[0016] 進一步，碳粒廓清試驗的具體方法為：
[0017] 飼喂結束后，每組隨機取10只小鼠，稱重，每只小鼠使用胰島素注射器由尾靜脈 注入0. lmL/10g的印度墨汁（生理鹽水稀釋6倍），注射后分別在2min (Tl)、7min (T2)乙醚 麻醉后用玻璃毛細管從小鼠眼眶靜脈叢采血20μ L，溶于20mL0. 1% Na2C03溶液中搖勻，靜 置20min后每個樣品取100 μ L加入到96孔板中，取兩次樣分別加入不同孔中，以0. 1 %溶 液為空白對照，使用酶標儀在680nm波長測量其0D值，將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙 吸干血跡后稱重，根據公式計算廓清指數K值、校正廓清指數Ka值及免疫器官指數，計算公 式為
[0018]

【權利要求】
1. 一種復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述 的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法包括： 步驟一、用女貞子、淫羊藿、白術、茯苓制備復方女貞子，女貞子、淫羊藿、白術、茯苓的 質量比為2 : 1.5 : 1 : 1;以藥材的10倍水量采用水提法提取濃縮制成1 : 1的復方女 貞子藥液，再分別稀釋成1 : 20、1 : 40和1 : 80的復方女貞子藥液，均勻噴霧于全價鼠 料的表面，制成含復方女貞子0.05%、0. 1^^0.15% (w/w)的鼠料，備用； 步驟二、將實驗小鼠分組及處理，用于豬多殺性巴氏桿菌半數致死量的測定； 步驟三、飼喂結束后，對小鼠進行碳粒廓清試驗； 步驟四、對小鼠進行溶菌酶活性的測定； 步驟五、進行豬多殺性巴氏桿菌對小鼠半數致死量的測定； 步驟六、對感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護作用； 步驟七、數據分析。
2. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，所述的制備復方女貞子的具體方法為： 以藥材的10倍水量采用水提法提取濃縮制成1 : 1的復方女貞子藥液，再分別稀釋成 1 : 20、1 : 40和1 : 80的復方女貞子藥液，均勻噴霧于全價鼠料的表面，制成含復方女貞 子0.05%、0.1%、0.15%(￥/￥)的鼠料，備用。
3. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，將實驗小鼠分組及處理的具體方法為： 80只3周齡和60只8周齡SPF級白雄鼠，飼喂滅菌飼料和飲水，室內溫度為28°C，相 對濕度為（50 ± 10) %，動物飼養適應3天后進行試驗，將80只3周齡小鼠隨機分成4組，每 組20只，I、ΙΙ、ΠΙ組為實驗組，分別飼喂含復含方女貞子0.05%、0. 1%、0. 15% (w/w)的鼠 料，IV組為對照組，飼喂普通鼠料，連續飼喂30d，60只7周齡小鼠用于豬多殺性巴氏桿菌半 數致死量的測定。
4. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，碳粒廓清試驗的具體方法為： 飼喂結束后，每組隨機取10只小鼠，稱重，每只小鼠使用胰島素注射器由尾靜脈注入 0. lmL/10g的印度墨汁（生理鹽水稀釋6倍），注射后分別在2min(Tl)、7min(T2)乙醚麻 醉后用玻璃毛細管從小鼠眼眶靜脈叢采血20μ L，溶于20mL0. 1% Na2C03溶液中搖勻，靜置 20min后每個樣品取100 μ L加入到96孔板中，取兩次樣分別加入不同孔中，以0. 1 %溶液 為空白對照，使用酶標儀在680nm波長測量其0D值，將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙吸 干血跡后稱重，根據公式計算廓清指數K值、校正廓清指數Ka值及免疫器官指數，計算公式 為
其中，Μ =體重，=肝臟重，M2 =脾臟重，A為吸光光度值。
5. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，溶菌酶活性的測定的具體方法為： 每組剩下的10只小鼠采用眼眶靜脈叢采血約0. 6mL，4°C冰箱靜置保存2h后分離血清， 按以下方法檢測溶菌酶（LZM)活性： 取200μ?的待測血清、溶菌酶標準液（0. lmg/mL : 200U/mL)作為陽性對照、雙蒸水 作為空白樣，分別加入2. OmL濃度0. 25mg/mL微球菌菌液，立即混勻，37°C水浴15min，按時 取出置于〇°C的冰水浴中3min，530nm，lcm光徑，以蒸餾水調透光度100%，測定各管的透光 度，計算公式如下： 溶菌酶含量（U/mL)=(測定管透光度-對照管透光度V (標準管透光度-對照管透 光度）X2000U/mL。
6. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，豬多殺性巴氏桿菌對小鼠半數致死量的測定的具體方法為： 將菌株？1^439在加有5%犢牛血清的138培養基在371：恒溫搖床上18〇17/1^11培養 10h，將細菌依次10倍稀釋，分別取10 μ L涂于巧克力平板培養后計數；同時將上述10倍稀 釋的菌液分別腹腔注射（100 μ L/稀釋濃度）小鼠，每個濃度處理10只7周齡的白小鼠，采 用6個濃度，每天觀察并記錄小鼠死亡情況，連續觀察4天，小鼠半數致死量的計算按Reed 和Muench氏法，計算公式為： 距離比例=(高于50%的死亡百分數-50 % )八高于50%的死亡百分數-低于501% 的死亡百分數）； 0)50的對數（1^0)50)=死亡率高于50%的對數+距離比例\稀釋系數的對數。
7. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，對感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護作用的具體方法為： 將進行溶菌酶活性測定的小鼠飼喂3天，待其恢復健康后，腹腔注射1000個LD50菌液 (100 μ L)進行攻毒，每天觀察小鼠狀態并記錄死亡情況，連續觀察4d。
8. 如權利要求1所述的復方女貞子對豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型的構建方法，其 特征在于，數據分析的數據使用"平均值土標準差"表示，使用SPSS17.0軟件以單因素變 異數分析進行組間差異顯著性檢驗，P < 〇. 05為具有統計學意義。
【文檔編號】A61K36/638GK104095934SQ201410322558
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】朱麗娜, 陳仕貴, 雷凌華, 陳揚, 張子燁 申請人:湖南農業大學