專利名稱：禽多殺性巴氏桿菌b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽巴氏桿菌病又名禽霍亂，由禽多殺性巴氏桿菌(Pm)引起，是雞、鴨、鵝等多種禽類常見(jiàn)的一種急性傳染病，是當(dāng)前危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。
國(guó)外對(duì)禽巴氏桿菌弱毒疫(菌)苗的研究始于1881年，自Pasteur首次研制成功用于預(yù)防禽霍亂的弱毒疫苗以來(lái)，各種免疫力不同的禽巴氏桿菌弱毒菌株不斷涌現(xiàn)。1918年Mannigen用培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑的方法選育出一株無(wú)毒的突變株，免疫后兩天開(kāi)始有免疫力，免疫期為6-8周；1950年Barker通過(guò)含結(jié)晶紫的血清瓊脂培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)，獲得一株無(wú)毒的變種；Carter(1950，1951)通過(guò)雞胚繼代致弱了的禽巴氏桿菌菌株，獲得一突變株；但效果都不夠好。Rice(1979)用Cu株制成弱毒疫苗，通過(guò)飲水、點(diǎn)眼、皮內(nèi)注射等多種途徑進(jìn)行免疫，免疫期8-10周左右，Cu株具有抵抗巴氏桿菌異源株攻擊的特點(diǎn)。
在20世紀(jì)六十至八十年代，對(duì)禽巴氏桿菌病的預(yù)防多采用禽霍亂氫氧化鋁膠(滅活)苗，但該苗免疫期短，運(yùn)輸保存不方便。我國(guó)對(duì)禽霍亂弱毒疫苗的研究已達(dá)十幾株之多，如G190-E40株(黑龍江獸藥一廠)，華農(nóng)系(華南農(nóng)學(xué)院)，1010株(江蘇家禽研究所)，731株(中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所)，C762株(廣西獸藥廠)，CNCOI株(廣西農(nóng)學(xué)院)，N系(江西生物制藥廠)，G190-3(廣東生物制藥廠)，PTR株，PC株(中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所)等，以上菌株的致弱方法多樣，通過(guò)豚鼠、小白鼠或其它動(dòng)物傳代(如G190-E40，G190-3，C762)，或通過(guò)低溫或高溫選育(如731，PTR，華農(nóng)系等)，或加化學(xué)誘變劑(如N系，PC株)，或經(jīng)Co60-r射線處理(如CNCOZ)等。上述弱毒菌株均有一定的免疫效果，但普遍存在一些問(wèn)題，例如菌苗的安全性差，免疫期短，菌株遺傳性能差，不穩(wěn)定；還有些菌苗副作用大，對(duì)禽產(chǎn)蛋率有一定影響。
盡管當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)禽巴氏桿菌弱毒疫苗研究比較多，但由于禽巴氏桿菌弱毒疫苗生產(chǎn)工藝路線、工藝參數(shù)難掌握，使疫苗的生產(chǎn)成本普遍較高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、合格率低、免疫原性差、疫苗保存期短、疫苗產(chǎn)生免疫的時(shí)間慢等，滿足不了家禽業(yè)健康發(fā)展的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種免疫保護(hù)率高、安全性高、穩(wěn)定性好、免疫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的禽巴氏桿菌弱毒疫苗所需的弱毒菌株。
本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題用于制備禽巴氏桿菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株[AvianPasteurella multocida B26-T1200，于2005年4月27日保藏在中國(guó)武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號(hào)CCTCC No M205042]。
制備本發(fā)明的禽巴氏桿菌病疫苗的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株，可采用如下方式將B26本地鴨源強(qiáng)毒菌株，在含0.1％裂解羊全血的馬丁湯中幼齡傳代(12小時(shí)一代)，從37℃開(kāi)始，在傳代過(guò)程中逐漸將培養(yǎng)溫度提高到45℃，每20-30代后，按原菌株的各種特征進(jìn)行選種后繼續(xù)傳代，并對(duì)傳代菌株的毒力和免疫原性進(jìn)行測(cè)定，傳至1200代獲得禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株。采用禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株作為菌種，大量培養(yǎng)加保護(hù)劑后，經(jīng)過(guò)真空凍干制成禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒凍干苗。
本發(fā)明研制成功的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒苗安全性高、穩(wěn)定性好，免疫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。經(jīng)測(cè)定，該菌的最小免疫劑量為130萬(wàn)活菌，但41萬(wàn)活菌免疫雞就有部分雞已得到保護(hù)，3000萬(wàn)免疫雞近期保護(hù)率達(dá)100％。實(shí)驗(yàn)室測(cè)定6批禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒苗免疫期，6批苗免疫4個(gè)月平均保護(hù)率為79.2％，5個(gè)月平均保護(hù)率為75％。田間試驗(yàn)5批苗免疫雞140天平均保護(hù)率達(dá)80％。該弱毒苗于2000年已被國(guó)家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為正式規(guī)程苗，可在全國(guó)范圍內(nèi)生產(chǎn)及推廣使用。
B26-T1200株與國(guó)內(nèi)廣泛使用G190-E40株，“731”株及美國(guó)廣泛應(yīng)用的Cu株弱毒苗比較結(jié)果如下B26-T1200株、G190-E40株、“731”株、Cu株性能比較


在應(yīng)用范圍上已從雞的單一使用進(jìn)一步推廣到水禽。
本發(fā)明的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株已于2005年4月27日保藏在中國(guó)武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號(hào)CCTCC No M205042]。
具體實(shí)施例方式
禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒苗是申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)多年努力從一株鴨源強(qiáng)毒株，經(jīng)過(guò)物理學(xué)方法，在37-45℃條件下幼齡傳代至1200代獲得的弱毒菌株，并研制成弱毒疫苗，該苗比原代強(qiáng)毒株毒力降低15億倍以上，以93億菌注射雞表現(xiàn)安全，近期保護(hù)率100％，免疫保護(hù)率達(dá)94.6％，140天保護(hù)率達(dá)80％，優(yōu)于常規(guī)氫氧化鋁膠苗。
本發(fā)明以如下方式獲得禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株采用物理學(xué)誘變方法，將篩選出來(lái)的毒力較強(qiáng)、免疫原性較好的B26本地鴨源強(qiáng)毒株，在含0.1％裂解羊全血的馬丁湯中幼齡傳代(12小時(shí)一代)，從37℃開(kāi)始，在傳代過(guò)程中逐漸將培養(yǎng)溫度提高到45℃，每傳20-30代后，按原菌株的各種特征進(jìn)行選種后繼續(xù)傳代，并對(duì)傳代菌株的毒力和免疫原性進(jìn)行測(cè)定，以保持原菌株的菌落形態(tài)、菌落熒光特征和免疫原性。傳至1200代獲得禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株。采用常規(guī)的傾注平板培養(yǎng)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。獲得的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株置入常規(guī)的培養(yǎng)物，按常規(guī)的比例加入保護(hù)劑，經(jīng)過(guò)真空凍干制成禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒凍干苗。
本發(fā)明的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株主要用于生產(chǎn)禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒凍干苗，采用禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株作為菌種，經(jīng)大瓶通氣培養(yǎng)、真空凍干生產(chǎn)而成。該弱毒苗毒力比原代菌株毒力下降了15億倍以上，通過(guò)血斜連傳30代和敏感雞體連傳5代，其毒力無(wú)返祖(強(qiáng))現(xiàn)象；且產(chǎn)生免疫力迅速，菌株免疫雞后，4-5天產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，80-100％的免疫雞能抵抗強(qiáng)毒攻擊；免疫期長(zhǎng)，可達(dá)4-5個(gè)月，免疫雞4個(gè)月總保護(hù)率79.2％，5個(gè)月總保護(hù)率達(dá)75％。
以下簡(jiǎn)述使用本發(fā)明的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒凍干苗生產(chǎn)疫苗的工藝步驟
1、馬丁肉湯制備pH值為7.4，供培養(yǎng)和稀釋菌液用。
2、菌種菌種為禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒菌株，該菌株由申請(qǐng)人鑒定、保管和供應(yīng)。效檢用C48-1強(qiáng)毒株，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供。
3、生產(chǎn)用種子制備(1)一級(jí)種子保存在2-8℃，使用期不超過(guò)14日。
(2)二級(jí)種子繁殖及檢驗(yàn)取一級(jí)種子接種于含0.1％裂解血球全血的馬丁肉湯中，36-37℃培養(yǎng)24小時(shí)，作純粹檢驗(yàn)后，置2-8℃保存，使用期不超過(guò)4日。
(3)制苗用培養(yǎng)基馬丁肉湯，根據(jù)需要量制備馬丁肉湯。
(4)制苗用菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐或玻璃瓶通氣培養(yǎng)，按容積裝入適量培養(yǎng)基(70％左右)、消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基總量的1-2％接種二級(jí)種子液，并按0.1％(重量百分比或體積百分比均可，以下同)加入裂解血球全血。以逐漸增大通氣量的方法，37-38℃培養(yǎng)8-12小時(shí)，當(dāng)pH達(dá)到8.0-8.4時(shí)，停止培養(yǎng)。
(5)半成品檢驗(yàn)A.純粹檢驗(yàn)取培養(yǎng)物進(jìn)行涂片鏡檢，如無(wú)雜菌，立即配苗。同時(shí)用馬丁瓊脂作純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
B.活菌計(jì)數(shù)用含0.1％裂解血球全血及4％健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)，按常規(guī)活菌計(jì)數(shù)方法計(jì)算活菌數(shù)，作為配苗參考。
(6)配苗與分裝將檢驗(yàn)合格的若干瓶菌液，混合于同一容器中，加入適量明膠、蔗糖保護(hù)劑，充分混合，定量分裝，每頭份活菌數(shù)(雞)應(yīng)不少于3000萬(wàn)個(gè)。分裝過(guò)程中，隨時(shí)振蕩，必要時(shí)可采取保溫措施。
(7)凍干分裝后立即冷凍真空干燥，按照生產(chǎn)該疫苗的溫度曲線進(jìn)行升溫，凍干完成后，在真空狀態(tài)下壓緊膠塞，封鋁蓋后，置于2-8℃保存。
(8)貯藏在2-8℃保存，有效期為1年。
4成品檢驗(yàn)(1)物理性狀該產(chǎn)品為淡褐色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
(2)純粹檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)雜菌生長(zhǎng)。
(3)鑒別檢驗(yàn)在含0.1％裂解血球全血及10％羊血清的改良馬丁瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16-22小時(shí)，肉眼觀察，菌落表面光滑，有淡淡的藍(lán)色，在低倍顯微鏡下，45度折光觀察，菌落結(jié)構(gòu)細(xì)致，邊緣整齊，呈藍(lán)色，邊緣有虹光。
(4)活菌計(jì)數(shù)取疫苗3瓶，按瓶簽注明的羽份，用含0.1％裂解血球全血及4％健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)，按常規(guī)活菌計(jì)數(shù)方法計(jì)算活菌數(shù)，每頭份活菌(雞)應(yīng)不少于3000萬(wàn)個(gè)。
(5)安全檢驗(yàn)取疫苗1瓶，按瓶注明的羽份，以20％鋁膠生理鹽水稀釋為1mL 100羽份。用2-10月齡的健康易感雞4只，各肌肉注射1mL，觀察15日，應(yīng)全部健活。
(6)效力檢驗(yàn)取疫苗1瓶，按瓶簽注明的羽份，以20％鋁膠生理鹽水稀釋為1mL含1羽份。用2-10月齡的健康易感雞4只，各肌肉注射1mL。14日后，連同條件相同的對(duì)照雞2只，各肌肉注射致死量的C48-1強(qiáng)毒菌液，觀察15日，對(duì)照雞全部死亡，免疫雞至少保護(hù)3只為合格。
(7)剩余水份測(cè)定用真空烘干法檢測(cè)，應(yīng)符合規(guī)定。
(8)真空度測(cè)定用高頻火花真空測(cè)定器進(jìn)行密封后容器內(nèi)的真空度測(cè)定。如果容器內(nèi)出現(xiàn)白色、粉色和紫色輝光，則真空度均屬合格。
5.作用與用途用于預(yù)防2個(gè)月以上的雞、鴨、鵝巴氏桿菌病。免疫期為120天。
6.用法與用量疫苗用20％鋁膠生理鹽水稀釋為0.5mL/羽份，各肌肉注射0.5mL，雞免疫注射含活菌3000萬(wàn)個(gè)/羽，鴨免疫注射含活菌9000萬(wàn)個(gè)/羽，鵝免疫注射含活菌1億個(gè)/羽。
在配制疫苗過(guò)程中，攻毒劑量要適當(dāng)，可通過(guò)試驗(yàn)雞的測(cè)毒來(lái)確定劑量。
權(quán)利要求
1.一種用于制備禽巴氏桿菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株[Avian Pasteurella multocida B26-T1200；保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號(hào)CCTCC No M205042]。
2.如權(quán)利要求1所述的禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株的制備方法，其特征是將B26本地鴨源強(qiáng)毒菌株，在含0.1％裂解羊全血的馬丁湯中幼齡傳代(12小時(shí)一代)，從37℃開(kāi)始，在傳代過(guò)程中逐漸將培養(yǎng)溫度提高到45℃，每20-30代后，按原菌株的各種特征進(jìn)行選種后繼續(xù)傳代，并對(duì)傳代菌株的毒力和免疫原性進(jìn)行測(cè)定，傳至1200代獲得禽多殺性巴氏桿菌B26-T1200弱毒株。
全文摘要
一種用于制備禽巴氏桿菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多殺性巴氏桿菌B
文檔編號(hào)A61K39/02GK1789410SQ200510019200
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者謝芝勛, 劉加波, 龐耀珊, 謝志勤, 鄧顯文, 唐小飛 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所