一種獸用卵泡刺激素類似物的制備方法
【專利摘要】一種獸用卵泡刺激素類似物及其制備方法，根據α和β肽鏈間連接序列的長度、可折疊性、疏水性、電荷效應來設計連接序列，其連接序列對應的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19、SEQ?ID?NO：20中的任一種，通過研究比較其各自的表達量和生物活性。本發明所制得的獸用卵巢刺激素類似物的融合蛋白與已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多個融合蛋白的表達量明顯提高，對于天然卵巢刺激素具有替代作用，有重大的商業價值，值得大范圍推廣。
【專利說明】一種獸用卵泡刺激素類似物的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種獸用卵泡刺激素類似物的制備方法。

【背景技術】
[0002] 卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH)是由動物腦垂體前葉嗜堿性 細胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，由α和β兩條多肽鏈（或稱亞基）以非共價鍵聯結 而成。可以促進雌激素的分泌、誘導動物發情、促進卵泡卵子成熟、超數排卵和刺激精子生 成。
[0003] 目前獸用FSH均為動物腦組織提取物，不但參雜不同含量的促黃體素致使超排效 果不穩定，還有攜帶生物源性傳染物的潛在危險。通過基因工程研發獸用FSH，是當前的研 究熱點。迄今已見諸于報道的有關基因重組FSH的基因工程策略主要有兩種。一種是α 和β兩條多肽鏈分別表達后，再通過非共價鍵聯結形成異源二聚體。這種方法受該兩條多 肽鏈彼此聯結的效率所限，因而許多研究者轉而研究如何把α和β兩條多肽鏈在基因水 平連接在一起，從而編碼為單一肽鏈的融合蛋白。其中在α和β兩條多肽鏈之間起連接 作用的氨基酸序列稱為連接序列（Linker)。Weenen等（J Clin Endocrinol Metab，2004， 89:5204-5212.)以及美國專利申請公告US 2008/0234186 A1通過人FSH的α和β兩條 多肽鏈與不同的連接序列重組，比較所形成的融合蛋白的活性。在連接序列內分別引進含 1、2和4個Ν-連接糖基化位點序列，或采用人絨毛膜促性腺激素 β亞基的羧端肽（CTP) 作為連接序列。所得到的融合蛋白FSH-NUFSH-N2和FSH-Μ、和FSH-CTP的糖基化程度和 體內半衰期均較野生型FSH明顯增加，但體內半衰期與糖基化程度的增加并不呈簡單的線 性關系。該發明強調了糖基化對長效的作用，但未充分考慮到連接序列本身對于融合蛋白 表達的影響。結果表明其表達量都僅在1.3-14pmol/ml的范圍之內（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212 和美國專利申請公告 US2008/0234186 A1)。
[0004] 連接序列的長度、可折疊性、疏水性、電荷效應等特性與融合蛋白中的α和β肽 鏈在彼此聯結之前能否各自折疊成為正確的空間結構密切相關。兩條肽鏈以及其間的連接 序列，這三者空間三維結構的相互關系直接影響融合蛋白的生物活性，也影響融合蛋白的 產量。所以適應于α和β肽鏈的連接序列堿基的選擇及其排列順序至關重要。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種獸用卵泡刺激素類似物及其制備方法。針對上述現有 技術存在的問題，根據α和β肽鏈間連接序列的長度、可折疊性、疏水性、電荷效應來設計 連接序列從而得到不同的獸用卵泡刺激素類似物。對由不同連接序列融合而成的不同的卵 泡刺激素類似物的產量和生物活性進行比較與篩選，從中選出高表達量的最佳序列。
[0006] 為達到上述目的，本發明的技術方案為：
[0007] -種獸用卵泡刺激素類似物，所述獸用卵泡刺激素類似物中，根據α和β肽鏈 間連接序列的長度、可折疊性、疏水性、電荷效應來設計連接序列，其連接序列對應的核苷 酸序列為：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20 中的任一種。
[0008] 進一步的，所述連接序列對應的核苷酸序列為：SEQ ID N013、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18 中的任一種。
[0009] 進一步的，所述獸用卵泡刺激素類似物制備方法包括如下步驟：
[0010] 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素兩個亞基β和α基因并在其間 插入已知連接序列（兩端含酶切點），進行全序列合成（SEQ ID NO :1)，再用pcDNA3. 1 (+) 質粒進行分子克隆。分別
[0011] 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素β和α亞基的基因通過兩端分 別含BamHI、SpeI酶切點的已知連接序列連接起來，進行全序列合成，其序列為SEQ ID Ν0: 1，兩端分別函Nhe I和EcoR I酶切點，再用pcDNA3. 1 (+)質粒進行分子克隆；經過雙酶切， 依次用下列19個序列取代上述的已知連接序列，SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 : 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO :11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20,以制備 19 種不同的新的 表達質粒；將所得表達質粒轉染DH5大腸桿菌，經氨芐青霉素抗性篩選，提取單克隆菌落質 粒DNA，酶切鑒定后進行測序；
[0012] 步驟二、重組質粒DNA序列經確認之后，進行單酶切，使之線性化，線性化后轉染 CH0細胞，經G418抗性篩選，單克隆化，通過western blotting挑選高表達克隆；
[0013] 步驟三、進行逐級放大傳代培養擴增，western blotting檢測培養液，證實重組 FSH高表達，細胞加防凍劑，分裝液態氮凍存；
[0014] 步驟四、復蘇，經含血清培養基培養，無血清培養馴化，逐級放大傳代培養擴增，證 實重組FSH高表達，作為種子細胞加防凍劑，分裝液態氮凍存。
[0015] 進一步的，所述獸用卵泡刺激素類似物制備方法步驟一中，雙酶切的內切酶為：限 制性內切酶Nhe I和EcoR I。
[0016] 進一步的，所述獸用卵泡刺激素類似物制備方法步驟二中，單酶切的限制性內切 酶為 Pspl406I。
[0017] 進一步的，所述獸用卵泡刺激素類似物制備方法步驟二中，所述G418抗性篩選的 濃度為800 μ g/ml。
[0018] 進一步的，所述獸用卵泡刺激素類似物制備方法步驟三中，分別選取25cm2、75cm 2、 175cm2、225cm2的細胞培養瓶進行逐級放大傳代培養擴增。
[0019] 進一步的，包含上述任一連接序列的獸用卵巢刺激素類似物及含有該獸用卵巢刺 激素類似物的藥物在促進卵泡發育方面的應用。
[0020] 相對于現有技術，本發明的有益效果為：本發明根據α和β肽鏈間連接序列的長 度、可折疊性、疏水性、電荷效應設計了一組不同的連接序列，從而得到一組不同的獸用卵 巢刺激素類似物，通過研究比較其各自的表達量和生物活性。本發明所制得的獸用卵巢刺 激素類似物的融合蛋白與已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多個融合蛋白的表 達量明顯提高，對于天然卵巢刺激素具有很好的替代作用，具有重大的商業價值，值得大范 圍推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1 :為采用western blotting半定量監測重組FSH的表達圖，將重組FSH進行 工程細胞的單克隆挑選。1 :蛋白分子量標準；2 :未轉染的CH0細胞培養液（陰性對照），加 樣量為20 μ 1 ;3-8 ;六個克隆已轉染的CH0細胞培養液，加樣量分別為15 μ 1。根據條帶顯 影的強度判斷表達量。主帶上方的條帶是重組蛋白的二聚體，主帶下方的條帶為降解產物。
[0022] 圖2 :為比較卵泡刺激素類似物的卵巢增重功能圖。標準品和7份受試品均 體現量效關系，基本呈直線關系。其中由已知的連接序列（Linkerl)和本發明設計 的連接序列（Linkerl6)與標準品三者的斜率基本一致（k分別為21.782(Linkerl)， 21. 785 (Linkerl6)，和 21. 783 (標準品）。

【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖及具體實施例對本發明方案做進一步詳細說明：
[0024] 實施例1 :表達質粒的構建和工程細胞的建立
[0025] 1.根據Genbank上記載的天然羊FSH的氨基酸序列和核苷酸序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ? cmd = Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 57619323,和 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ? cmd =Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 1365)，設計并進行全基 因SEQIDNO:l合成，含已知連接序列（Linkerl):ggatccggctccaacgccaccggctccggc tccaacgcca cctccggctc cactag 序列（J Clin Endocrinol Metab，2004,89:5204-5212)。
[0026] 2.構建表達質粒：將雙鏈SEQ ID NO 1和pcDNA3. 1(+)質粒經過分別經過雙 酶切（Nhel和EcoRI)，l%瓊脂電泳分離，萃取。將經過雙酶切處理過的SEQ ID NO 1和 pcDNA3. 1(+)質粒通過連接酶ligase連接。按標準CaCl2法轉染DH5a大腸桿菌，經氨 節青霉素抗性篩選，37°C培養。按質粒提取試劑盒（Quiagen)的說明書提取單克隆菌落 質粒DNA，命名為pcDNA3. 1-FSH1。酶切鑒定后進行測序確認、備用。將pcDNA3. 1-FSH1 經過BamHI+Spel雙酶切，經過1 %瓊脂電泳分離，棄除Linker 1，萃取獲得線性化的 pcDNA3.1-FSH，備用。雙鏈的 SEQ ID N0:2(Linker2)、SEQ ID N0:3(Linker3)、SEQ ID N0: 4(Linker4)、SEQ ID N0:5(Linker5)、SEQ ID N0:6(Linker6)、SEQ ID N0:7(Linker7)、SEQ ID NO :8(Linker8)、
[0027] SEQ ID NO :9 (Linker9)、SEQ ID NO :10 (Linker 10)、SEQ ID NO :11 (Linker 11)、 SEQ ID NO ：12(Linkerl2), SEQ ID NO ： 13 (Linkerl3), SEQ ID NO ： 14 (Linker 14), SEQ ID NO ：15(Linkerl5), SEQ ID NO ： 16(Linkerl6), SEQ ID NO ： 17(Linkerl7), SEQ ID NO： 18(Linkerl8)、SEQ ID N0:19(Linkerl9)、SEQ ID N0:20(Linker20)(以下簡稱 Linker2 ? 20)，分別經過BamHI+Spel雙酶切，分別經過1%瓊脂電泳分離、萃取。將經過雙酶切 的Linker2?20分別與pcDNA3. 1-FSH連接，獲得19份重組質粒（pcDNA3. 1-FSH2? pcDNA3. 1-FSH20)，用于轉染DH5 α大腸桿菌。經氨芐青霉素抗性篩選，分別提取單克隆菌 落質粒DNA，獲得相應的19份重組質粒pcDNA3. 1-FSH2?pcDNA3. 1-FSH20。酶切鑒定后進 行測序確認。
[0028] 3.建立工程細胞：
[0029] 3. 1. CH0細胞貼壁生長：轉染的前一天，以3?4xl05/ml的細胞密度接種6孔培養 板，培養基含10%牛血清全培養劑DMEM。共設21孔。
[0030] 3. 2.質粒的線性化和脂質體包裹：重組質粒序列經測序確認之后，采用限制性內 切酶Pspl4061分別進行酶切線性化。將2 μ 1 (1 μ g/ μ 1)經線性化了的重組質粒DNA溶入 200 μ 1無血清培養基中，混勻；另外將20 μ 1脂質體Lipofectin (Invitrogen)溶入200 μ 1 無血清培養基中，輕輕混勻，再將制備好的DNA與脂質體輕輕混合均勻，室溫放置25? 30min，待用。依照同樣方法制備21份混合溶液，其中1份省略了質粒，作為陰性對照。
[0031] 3. 3.細胞的轉染：CH0細胞在6孔培養板里含小牛血清的培養基貼壁培養至 85-95%，用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2ml無血清培養基。將上述21份混合溶液分別 加入21個孔中，輕輕搖勻。在37°C，5%的C0 2，飽和濕度中孵育12h，更換含10%牛血清的 全培養基繼續培養48?72h。
[0032] 3. 4.抗性細胞的篩選：將轉染細胞進行傳代生長24h后，更換為選擇性培養基 (5%小牛血清并含有600 μ 1 G418)繼續培養。間隔2?3d換液一次，待陰性對照細胞全 部死亡時，收集G418抗性的CH0細胞系。0. 25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37°C條 件下，消化1-2分鐘。并用培養液吹散，準確計數。分別以2xl(T6/ml密度接種細胞貼壁培 養，三天后采用已知的放射免疫法（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212.)檢測 各培養液上清液中卵泡刺激素類似物的濃度結果如表1 (pRIA，表1)。
[0033] 表1.各培養液上清液中卵泡刺激素類似物的濃度
[0034]
[0035]

【權利要求】
1. 一種獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類似物中，根據α 和β肽鏈間連接序列的長度、可折疊性、疏水性、電荷效應來設計連接序列，其連接序列對 應的核苷酸序列為：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO ： 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20 中的任一種。
2. 根據權利要求1所述的獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述連接序列對應的 核苷酸序列為：SEQ ID N013、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO :18中的任一種。
3. 根據權利要求1或2任一權利要求所述的獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述 獸用卵泡刺激素類似物制備方法包括如下步驟： 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素 β和α亞基的基因通過兩端分別含 BamHI、SpeI酶切點的已知連接序列連接起來，進行全序列合成，其序列為SEQ ID Ν0:1，兩 端分別函Nhe I和EcoR I酶切點，再用pcDNA3. 1 (+)質粒進行分子克隆；經過雙酶切，依次 用下列19個序列取代上述的已知連接序列，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20,以制備 19 種不同的新的表達質 粒；將所得表達質粒轉染DH5大腸桿菌，經氨芐青霉素抗性篩選，提取單克隆菌落質粒DNA, 酶切鑒定后進行測序； 步驟二、重組質粒DNA序列經確認之后，進行單酶切，使之線性化，線性化后轉染CH0細 胞，經G418抗性篩選，單克隆化，通過western blotting挑選高表達克隆； 步驟三、進行逐級放大傳代培養擴增，western blotting檢測培養液，證實重組FSH高 表達，細胞加防凍劑，分裝液態氮凍存； 步驟四、復蘇，經含血清培養基培養，無血清培養馴化，逐級放大傳代培養擴增，證實重 組FSH高表達，作為種子細胞加防凍劑，分裝液態氮凍存。
4. 根據權利要求3所述獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類 似物制備方法步驟一中，目的基因全序列插入pcDNA3. 1所需的雙酶切的內切酶為：限制性 內切酶Nhe I和EcoR I ;置換連接序列所需的內切酶為：BamHI和Spel。
5. 根據權利要求3所述獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類 似物制備方法步驟二中，單酶切的限制性內切酶為Pspl406I。
6. 根據權利要求3所述獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類 似物制備方法步驟二中，所述G418抗性篩選的濃度為800 μ g/ml。
7. 根據權利要求3所述獸用卵泡刺激素類似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類 似物制備方法步驟三中，分別選取25cm2、75cm 2、175cm2、225cm2的細胞培養瓶進行逐級放大 傳代培養擴增。
8. 包含權利要求1或2任一連接序列的獸用卵巢刺激素類似物及含有該獸用卵巢刺激 素類似物的藥物在促進卵泡發育方面的應用。
【文檔編號】A61P15/08GK104152457SQ201410331313
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】林俊生, 刁勇 申請人:林靜靜, 刁勇