林蛙提取混合液及其在治療及預防腳氣的藥物中的用途
【專利摘要】一種林蛙提取混合液及其在治療及預防腳氣的藥物中的用途，屬于醫學生物制藥【技術領域】。是將林蛙干除雜除塵后粉碎，再加入復合酶水解液，取離心后的上層上清液；將剩余混合物研磨后剪切，噴霧干燥成粉末狀，將該超微粉加入到醋酸中超聲后紗網過濾，離心后取上清液減壓濃縮，從而得到多糖、抗菌肽和鈣離子的混合物；將上述物質混合得到林蛙提取混合液。該混合液是純生物制劑，無任何副作用，所含抑菌效果顯著的小分子抗菌肽結合鈣離子，增強其對真菌細胞壁的破壞，并能更好地進入真菌細胞達到抑菌效果；所含短肽膠原蛋白在多糖的作用下可更好的進入正常細胞，給予細胞充足營養，增強細胞防御功能，幫助正常細胞抵御外界破壞因素，并可修復受損細胞。
【專利說明】林蛙提取混合液及其在治療及預防腳氣的藥物中的用途

【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學生物制藥【技術領域】，具體涉及一種林蛙提取混合液及其在制備治療及預防腳氣的藥物中的用途。

【背景技術】
[0002]腳氣，是一種極常見的皮膚病。成人中70?80%的人患有腳氣，只是輕重不同而已。常在夏季加重，冬季減輕，也有人終年不愈。致病菌多系毛癬菌屬與表皮癬菌種，主要菌種有紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬菌、玫瑰色毛癬菌。腳氣不易治愈的主要原因除去這些真菌有較強的耐藥性之外，在治療過程中，病患處的濕潤、厭氧環境又是其剩余真菌的有力溫床；同時患者體內含有真菌，當外用停止給藥時,體內的真菌可繼續繁殖,導致了腳氣的反復發作，很難根治。
[0003]目前，國內對林蛙皮抗菌肽進行了研究，申報的專利也在增多，以林蛙為關鍵詞，檢索國內外專利，沒有查到國外關于林蛙的專利，國內專利中CN1216768A “生物抗菌肽及其制備方法”是涉及一種具有廣譜抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制備方法；CN1583166A “林蛙抗菌肽噴霧劑及其制備方法”、CN1583165A “林蛙抗菌肽凝膠劑及其制備方法”是涉及保護林蛙皮膚抗菌肽以噴霧劑和凝膠劑兩種形式用于臨床皮膚感染、燒傷燙傷感染領域；CN1679632A“林蛙鎮痛水提物及其制備方法及其制備方法”是關于保護從林蛙皮中提取的一種具有鎮痛作用的林蛙鎮痛水提物及其制備技術。均是以林蛙皮為原料，提取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A—種利用超聲波從林蛙體中提取抗菌肽的生產制備方法是以林蛙體為原料采用超聲提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量為4KDa最適pH值為3.5，等電點Pl值為8.0 — 10.5的堿性多肽。以上專利均以抗菌肽為保護內容，申請保護其在抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗細菌和真菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌及臨床耐藥菌克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、白色念珠菌、酵母菌的一種或多種；并且抗菌治療途徑均為外用給藥。CN103432058A “林蛙膠原蛋白液及其制備工藝”是以林蛙皮提取物、西洋參皂甙、五味子浸出液、蘆薈提取物和水配制而成；CN102492760A “一種利用復合酶生產活性東北林蛙膠原蛋白低聚肽的方法”是以干東北林蛙皮為原料；CN102229972A “制備林蛙皮膠原蛋白肽的方法”是以林蛙皮為原料，以上三個專利均是以林蛙皮為原料或主要原料提取林蛙皮中所含的膠原蛋白。
[0004]現有技術中的提取方法均未提取林蛙含有的多糖和鈣離子，且僅單純提取林蛙抗菌肽，或單純提取林蛙膠原蛋白，最主要的是提取的抗菌肽或膠原蛋白的分子量范圍不固定，差值較大，未有詳細說明，未將有效成分合理利用。


【發明內容】

[0005]本發明的目的之一是提供一種林蛙提取混合液，其是由如下步驟制備得到:
[0006](I)將10?45重量份林蛙干除雜除塵后分別經20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒徑在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入復合酶水解液，復合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，風味蛋白酶I?3wt%，酶解溫度為50?55°C，酶解時間為I?2h，酶解pH為7.0?7.5，而后85?90°C下滅酶5?15min，將混合物在溫度10?30°C時離心,離心時間為I?5min,離心轉速為2000?4000rpm,取離心后混合液體積20?40%的上層上清液，此時上層上清液中含有林蛙干短肽膠原蛋白(由于離心力的作用，短鏈膠原蛋白將集中在上層上清液中，長鏈蛋白分子將會集中在混合液的中下層剩余混合物中)，其分子量為2?3KDa，等電點pi值為7.5?7.8，其中堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)占上層上清液的11.04?12.89% (質量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占上層上清液的17.99?19.13% (質量比)。
[0007]取上清后剩余混合物(原體積的60?80 % )放入膠體磨，研磨2?15min，使混合物的平均粒徑在300 μ m以下；將混合物放入高剪切分散乳化機內，剪切I?15min，使混合物平均粒徑在100?200μπι之間，將混合物進行噴霧干燥成粉末狀，此時得到林蛙干提取短肽膠原蛋白后剩余纖維、骨質等物質的超微粉；
[0008](2)將纖維、骨質等物質的超微粉加入到質量濃度為2?10%醋酸中，醋酸與超微粉的體積質量比(mL:g)為10:1?40:1 ;超聲5?75min，超聲溫度為4?30°C;經150 μ m紗網過濾，150 μ m紗網上面未過濾物質加入質量體積比為Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L氫氧化鈉，進行微波提取，微波功率為500?600W，微波時間3?9min，再次經150 μ m紗網過濾；合并兩次濾液，30?50°C下攪拌10?30min,攪拌速度為100?200rpm ;攪拌后的濾液離心，離心溫度為4?30°C,離心時間為2?40min,離心轉速為2000?15000rpm ;取上清，減壓濃縮，壓力為600?700托，溫度為65?70°C，濃縮體積比為8?40:1，此時得到多糖、抗菌肽和鈣離子的混合物，其中多糖的分子量為I?5KDa ;抗菌肽的分子量為I?3KDa，其等電點pi值為7.5?8.0，且其中堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)占多糖、抗菌肽和鈣離子混合物的11.28?13.05% (質量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占多糖、抗菌肽和鈣離子混合物的10.01?11.47% (質量比)；
[0009]將步驟(I)和步驟(2)得到的產物混合，即得到本發明所述的林蛙提取混合液。
[0010]本發明將林蛙所含抑菌效果顯著的小分子抗菌肽結合鈣離子，增強其對真菌細胞壁的破壞，并能更好地進入真菌細胞達到抑菌效果；短肽膠原蛋白在多糖的作用下可更好的進入正常細胞，給予細胞充足營養，增強細胞防御功能，幫助正常細胞抵御外界破壞因素，并可修復受損細胞。
[0011]所述林蛙提取混合液可以與藥學上可接受的載體或賦形劑形成藥物制劑，所述制劑可以為噴霧劑、氣霧劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑或濕巾等外用劑型。
[0012]所述林蛙提取混合液可以與藥學上可接受的載體或賦形劑形成藥物制劑，所述制劑可以為口服液、顆粒劑、混懸液、乳劑等口服劑型。
[0013]本發明的目的之二是提供一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液軟膏劑，其由如下步驟制備得到:
[0014](I)油相的制備:取5?15重量份石蠟、2?10重量份單硬脂酸甘油脂、10?20重量份白凡士林、5?30重量份液體石蠟、I?15重量份司盤40、2?10重量份乳化劑0P、I?8重量份對羥基苯甲酸乙酯，混合后研磨混勻，得到油相；
[0015](2)林蛙提取混合液軟膏劑的制備:將步驟(I)制得的油相與由10?45重量份林蛙干按上述方法制備得到的林蛙提取混合液分別加熱至70?100°C，將林蛙提取混合液加入到所述油相中，邊加入邊攪拌，攪拌時間為10?15min，攪拌速度為100?300rpm，再經納米勻質機勻質4?7次，115?121°C滅菌10?30min ;將I?5重量份冰片加熱到70?100°C過0.45 μ m膜，無菌條件下與上述滅菌后產物混合均勻，即得到本發明所述的用于治療及預防腳氣的林蛙提取混合液軟膏劑。
[0016]用法用量:外用，每日早晚兩次患部涂敷，I?3mL/次，7天為I療程。
[0017]本發明的目的之三是提供一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液噴霧劑，其由如下方法制備得到:
[0018]向由10?45重量份林蛙干按上述方法制備得到的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG44QQ、1?5重量份的氯化鈉、I?2重量份的苯扎溴銨，100?200rpm下攪拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下攪拌10?30min，使上述物質充分混勻，115?121°C下滅菌10?20min ；自體冷卻至室溫后分裝入氣霧劑瓶，即得林娃提取混合液噴霧劑。
[0019]本發明的目的之四是提供一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液濕巾，其由如下方法制備得到:
[0020]向由10?45重量份林蛙干按上述方法制備得到的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG44QQ、1?5重量份的氯化鈉、I?2重量份的苯扎溴銨，100?200rpm下攪拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下攪拌10?30min，使上述物質充分混勻，115?121°C下滅菌10?20min ;自體冷卻至室溫后每50?60mL加入到放有(15?20)cmX (15?20)cm無菌無紡布的獨立包裝袋內，密封即得林蛙提取混合液濕巾。
[0021]本發明的目的之五是提供一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液口服劑，其由如下步驟制備得到:
[0022](I)減壓濃縮:將由10?45重量份林蛙干按上述方法制備得到的林蛙提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力在8X 13?3 X 14帕，溫度為50?85°C，濃縮比為I?5:1，得濃縮液；
[0023](2)將I?5重量份醋酸鋅緩慢加入到濃縮液中，邊加入邊攪拌，攪拌速度為100?300rpm，攪拌時間為10?15min ;加完后用0.lmol/L的NaOH調節pH為6.2?6.5，攪勻后使其自然沉降，4°C冷卻過夜；
[0024](3)將上述產物0.45 μ m濾膜過濾，得澄清液體后，加入5?15重量份檸檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，加熱至40?75°C，100?300rpm攪拌，攪拌時間10?30min，混合均勻，趁熱0.45 μ m濾膜過濾，再向清液中加入5?15重量份黃原膠和5?15重量份山梨酸鉀，經0.22 μ m濾膜精濾；
[0025](4)灌裝壓蓋:在無菌條件下灌裝，壓蓋封口 ；
[0026](5)滅菌:加熱到62?65°C，保持30?50min，自體冷卻至常溫即為林蛙提取混合液口服劑。
[0027]用法用量:內服，每日早晚兩次口服，1mL/次，7天為I療程。
[0028]本發明的積極效果在于:林蛙提取混合液是純生物制劑，無任何副作用，所含抑菌效果顯著的小分子抗菌肽結合鈣離子，增強其對真菌細胞壁的破壞，并能更好地進入真菌細胞達到抑菌效果；所含短肽膠原蛋白在多糖的作用下可更好的進入正常細胞，給予細胞充足營養，增強細胞防御功能，幫助正常細胞抵御外界破壞因素，并可修復受損細胞。本發明對皮膚粘膜無刺激、殺菌速度快、使用簡便，適合不同年齡人群使用。本發明對足部皮膚具有保護作用，提高足部皮膚防御能力，預防腳氣的發病率。毒副作用小，標本兼治，療效顯著，臨床癥狀消失迅速，還可起到預防效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1:林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖。
[0030]采用Tricine電泳法測短肽膠原蛋白分子量，以索萊寶公司的超低分子量蛋白質marker作為標準，得出所含短肽膠原蛋白分子量約為2?3KDa。
[0031]圖中左側為標準的marker，即標準分子量蛋白質的電泳圖，由左向右依次為實施例一中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例二中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例三中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例四中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例五中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖。
[0032]圖2:多糖分子量標準曲線。
[0033]以標準葡聚糖Tl (分子量I 000)、T3(分子量3 000)、Τ5(分子量5 000)、Τ10(分子量10 000)，藍葡聚糖(分子量2 000 000)為標準品，經S印hadex G-25凝膠柱(10cmX 1.5cm)以超純水洗脫,流速為1.2mL/min, 254nm檢測多糖分子量分布，計算出每種標準葡聚糖糖峰洗脫體積。以分子量為200萬的藍葡聚糖和葡萄糖作為標準糖來確定層析柱的外水體積Vo和總體積Vt，Ve為總體積減去外水體積。以Ve/Vt為橫坐標，Ig(Mw)為縱坐標作標準曲線，計算多糖分子量的公式為:
[0034]Ig (Mw) = (K1 - K2) Ve/Vt
[0035]Mw:多糖分子量；
[0036]Ve:待測樣品的糖峰洗脫體積；
[0037]Vo:分子篩排阻層析柱的外水體積；
[0038]Vt:分子篩排阻層析柱的總體積；
[0039]KpK2S 常數。
[0040]以藍葡聚糖和不同分子量葡萄糖標準制作得出多糖分子量標準曲線；
[0041]圖3:林蛙提取混合液所含多糖經S印hadex G_25凝膠柱層析得到的洗脫曲線。
[0042]采用凝膠層析制備方法檢測，用S印hadex G_25凝膠柱層析254nm下紫外檢測儀測定林蛙提取混合液洗脫曲線，得出洗脫體積Ve。將洗脫體積Ve，帶入公式Ig(Mw)=(K1 -K2) Ve/Vt，根據標準葡聚糖曲線(圖2所示曲線)，算出林蛙提取混合液所含多糖分子量Mw約為I?5Kda。
[0043]圖4:混合多糖標準RP-HPLC分析圖譜。
[0044]采用高效液相色譜法測定繪制單糖標準曲線，稱取多糖標準樣品，加入ImL無水鹽酸-甲醇，充N2封管后，100°C水解16h后吹干液體。甲醇解后的多糖標準樣品經干燥后，加入2mol/L三氟乙酸2mL，120°C充N2封管水解3h，水解產物倒入蒸發皿中，加入適量無水乙醇45°C水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍生化及其處理，取0.5mL PMP試劑和0.5mL0.3mol/L的NaOH溶液于蒸發皿中，將干燥物溶解后取其中的0.1 mL于小離心管中，7 O °C水浴30min。進行高效液相檢測。
[0045]高效液相色譜分析條件
[0046]儀器:Shimadzu LC_14ATvp液相色譜儀，附SPD-10AVD紫外檢測器
[0047]色譜柱:DIKMAInertsil 0DS-3 μ m(150X4.6mm)
[0048]檢測溫度:35°C
[0049]檢測波長:245nm
[0050]洗脫液:82%PBS (0.1M, pH7.0), 18% Acetonitrile (v/v)
[0051]流速:1.0mT ,/mi η
[0052]圖5:林蛙提取液所含多糖組分的RP-HPLC分析圖譜。
[0053]采用高效液相法分析其單糖組成情況，利用混合多糖的標樣確定組分中單糖的比例。林蛙提取混合液中含有的單糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:巖藻糖的比例約為1:4:6:12:7:5:3(體積比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=1:1(體積比)；
[0054]圖6:林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖。
[0055]采用Tricine電泳法測抗菌肽分子量，以索萊寶公司的超低分子量蛋白質marker作為標準，得出所含抗菌肽分子量約為I?3Kda。
[0056]圖中左側為標準的marker，即標準分子量蛋白質的電泳圖，由左向右依次為實施例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例二中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例五中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0057]下面結合實施例對本發明作進一步描述。本發明所用林蛙干產自是我國東北地區長白山麓。中國林娃(Rana temporaria chensinensis)俗稱田雞、哈士蟆、雪哈等,在動物分類上屬兩棲綱、無尾目、蛙科、蛙屬，是我國東北地區長白山麓的特有品種，屬于藥、食兩用的珍貴蛙種，并且資源豐富。
[0058]實施例一林蛙提取混合液的制備
[0059]取林蛙干20g(中國林蛙長白山亞種，購自吉林大藥房)，除雜除塵后分別經20目、50目、100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒徑在500 μ m以下，按照Ig:6mL的比例加入復合酶水解液，復合酶水解液中含木瓜蛋白酶3wt%、胰蛋白酶2wt%，風味蛋白酶lwt%jK94wt%，酶解溫度為52°C，酶解時間為1.5h，酶解pH為7.2，而后87°C、1min滅酶，將混合物在溫度25°C時離心，離心時間為3min，離心轉速為2500rpm，取上層上清液(總體積的25% )，此時提取了林蛙干中含有的短肽膠原蛋白；
[0060]上層上清液所含膠原蛋白中(紫外光譜分析法分析氨基酸類別，氨基酸自動分析儀收集測定氨基酸質量分數)精氨酸、賴氨酸、組氨酸的含量(占上層上清液的質量百分數)分別為3.12%,7.43%,0.73%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(占上層上清液的質量百分數)分別為 7.86%、11.19%。
[0061]取上清后剩余混合物(原體積的75% )，放入膠體磨，研磨3min，使混合物的平均粒徑在300 μ m以下；將混合物放入高剪切分散乳化機內，剪切2min，使混合物平均粒徑在100?200μπι之間，將混合物進行噴霧干燥成粉末狀，此時得到林蛙干提取短肽膠原蛋白后剩余纖維、骨質等物質的超微粉碎；
[0062]將纖維、骨質等物質的超微粉加入到質量濃度為4%醋酸中，醋酸與超微粉的體積質量比(mL:g)為17:1。超聲，超聲時間為:30min，超聲溫度為20°C ;過濾，經150μπι紗網過濾；150μπι紗網上面未過濾物質加入質量體積比為1:5的0.02mol/L氫氧化鈉，進行微波提取，微波功率為550W，微波時間4min，再次經150 μ m紗網過濾；合并兩次濾液，攪拌15min，攪拌速度為160rpm ;攪拌后的濾液離心，離心溫度為20°C，離心時間為lOmin，離心轉速為5000rpm;取上清，減壓濃縮，壓力為600托，溫度為68°C，濃縮體積比為15:1 ;此時得到多糖、抗菌肽、鈣離子混合物(鈣離子的檢測采用EDTA滴定法檢測)；
[0063]混合物中多糖(Sephadex G - 25凝膠柱分離收集單糖,高效液相色譜法測定單糖組成)主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸組成，其中含單糖鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:巖藻糖約為1:4:6:12:1:0.5:1(體積比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=1:1(體積比)；
[0064]混合物所含抗菌肽中(紫外光譜分析法分析氨基酸類別，氨基酸自動分析儀收集測定氨基酸質量分數)精氨酸、賴氨酸、組氨酸的含量(占混合物的質量百分數)分別為2.73%,8.16%、0.69%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(占混合物的質量百分數)分別為
4.47%,5.98%。
[0065]將短肽膠原蛋白、多糖、抗菌肽、鈣離子混合，得到林蛙提取混合液，體積是53mL，其中含鈣離子 42.4mg(80mg/100ml)。
[0066]實施例二林蛙提取混合液軟膏劑的制備
[0067]處方組成(按重量份):林蛙干20g、石蠟8g，液體石蠟6g，白凡士林12g，單硬脂酸甘油酯1g,司盤40 9g,乳化劑0P3g,對輕基苯甲酸乙酯Ig,冰片lg。
[0068]制備方法:
[0069](I)林蛙提取混合液的制備
[0070]稱取林蛙干20g(中國林蛙長白山亞種，購自吉林大藥房)，按照實施例一的方法制備成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL
[0071](2)油相的制備:取8g石蠟、1g單硬脂酸甘油脂、12g白凡士林、6g液體石蠟、9g司盤40、3g乳化劑OP、lg對羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相；
[0072](3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟(2)制得的油相與林蛙提取混合液分別加熱至90°C，將林蛙提取混合液加入到所述油相中，邊加邊攪拌，攪拌時間為12min，攪拌速度為150rpm，再經納米勻質機勻質5次，115°C滅菌1min ;將冰片加熱到90°C過0.45 μ m膜，無菌條件下與上述滅菌后產物混合均勻，即得到本發明所述的用于治療及預防腳氣的林蛙提取混合液軟膏劑。
[0073]實施例三林蛙提取混合液噴霧劑的制備
[0074]處方組成(按重量份):林娃干20g、氯化鈉19mg PEG400 2 3mg,苯扎溴銨6mg。
[0075]制備方法:
[0076]稱取林蛙干20g(中國林蛙長白山亞種，購自吉林大藥房)，按照實施例一的方法制備成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，中加入上述配方量的PEG4_、氯化鈉、苯扎溴銨，120rpm攪拌,攪拌時間為1min,加水至100mL, 150rpm攪拌1min,使上述物質充分混勻，121°C滅菌lOmin。自體冷卻至室溫，分裝入氣霧劑瓶(20mL/瓶)，即得。
[0077]實施例四林蛙提取混合液濕巾的制備
[0078]處方組成(按重量份):林娃干20g、氯化鈉24mg PEG4qq llmg,苯扎溴銨2mg。
[0079]制備方法:
[0080]稱取林蛙干20g(中國林蛙長白山亞種，購自吉林大藥房)，按照實施例一的方法制備成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，中加入上述配方量的PEG4_、氯化鈉、苯扎溴銨，130rpm攪拌,攪拌時間為13min,加水至1500mL, 130rpm攪拌lOmin,使上述物質充分混勻，121°C滅菌lOmin。自體冷卻至室溫,每50mL加入到放有無菌無紡布(15cmX15cm)獨立包裝袋內，密封即得。
[0081 ] 實施例五林蛙提取混合液口服劑的制備
[0082]處方組成(按重量份):林娃干20g,朽1檬酸5g,蜂蜜21g,白砂糖22g,黃原膠6g份，山梨酸鉀Sg，醋酸鋅lg。
[0083]制備方法:
[0084](I)稱取林蛙干20g(中國林蛙長白山亞種，購自吉林大藥房)，按照實施例一的方法制備成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，
[0085](2)減壓濃縮:將林蛙提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力在9.1XlO3帕，溫度為75°C，濃縮比為1.06:1，得濃縮液501^ ；
[0086](2)調節混合液
[0087]將研細的醋酸鋅緩慢加入林蛙提取混合液中，邊加邊攪拌，130rpm攪拌，攪拌時間為1min ;加完后用0.lmol/L NaOH調節pH為6.4±0.1，攪勻后使其自然沉降，4°C過夜；
[0088](3)過濾
[0089]經0.45 μ m濾膜過濾，得澄清液體后，加入上述配方量的檸檬酸、蜂蜜、白砂糖，力口熱45°C, 150rpm攪拌,攪拌時間為12min,攪拌均勻；0.45 μ m濾膜過濾,再向清液中加入上述配方量的黃原膠、山梨酸鉀，120rpm攪拌,攪拌時間為1min,攪拌均勻；經0.22 μ m濾膜精濾；
[0090](4)灌裝壓蓋
[0091]在無菌條件下灌裝，每瓶10mL，壓蓋封口；
[0092](5)滅菌
[0093]將灌裝好的林蛙提取混合液口服制劑加熱到65°C，保持30min，自體冷卻至室溫即為成品。
[0094]以下試驗例表明本發明在治療腳氣藥物中的用途
[0095]試驗例I
[0096]采用完全隨機的方法，將600例受試對象分配到治療組(420例，共7組)和對照組(180例，3組)。治療組分別采用實施例二、實施例三、實施例四、實施例五、實施例二 +實施例五、實施例三+實施例五、實施例四+實施例五制成的林蛙提取混合液制劑，對照組采用新腳氣膏(市售廣州九福堂生物制藥)、林蛙皮抗菌肽(采用CN1216768A方法制備)、林蛙體抗菌肽(采用CN103073628A方法制備)。根據療效標準判斷療效，結果見表I。
[0097]用法:實施例二組、實施例三組、實施例四組、新腳氣膏組、林蛙皮抗菌肽組、林蛙體抗菌肽組為外用組，每日早晚兩次清洗足部后使用藥物，實施例二組每次用藥量為2g，用藥方式為涂抹足部，2次/d ;實施例三組每次用藥時噴足部5次，大約為2mL藥液，2次/d ;實施例四組每次用藥時擦拭足部Imin以上，2次/d ;新腳氣膏組每次用藥量為2g，用藥方式為涂抹足部，2次/d ;林蛙皮抗菌肽組每次用藥量為2mL，用藥方式為涂抹足部，2次/d ；林蛙體抗菌肽組每次用藥量為2mL，用藥方式為涂抹足部，2次/d ；
[0098]實施例五組為口服組；實施例二 +實施例五組、實施例三+實施例五組、實施例四+實施例五組為外用+ 口服組。實施例五組每日早晚口服，每次10mL，服藥期間無食物禁忌；實施例二 +實施例五組每日早晚口服實施例五，每次10mL，并且早晚兩次清洗足部后外用實施例二，每次用藥量為2g，用藥方式為涂抹足部，2次/d ;實施例三+實施例五組每日早晚口服實施例五，每次10mL，并且早晚兩次清洗足部后外用實施例三，每次用藥時噴足部5次，大約為2mL藥液，2次/d ;實施例四+實施例五組每日早晚口服實施例五，每次10mL，并且早晚兩次清洗足部后外用實施例四，每次用藥時擦拭足部Imin以上，2次/d。
[0099]各組同時停用其他相關手段和治療藥物，均以7天為I療程。
[0100]臨床分類主要有:糜爛型腳氣、水泡型腳氣、鱗屑角化型腳氣。臨床主要癥狀表現為:
[0101]糜爛型:趾間潮濕，浸潰發白，干涸脫屑后，剝去皮屑為濕潤、潮紅的糜爛面或伴有裂口，有奇癢，易繼發感染。
[0102]水皰型:好發于足緣、足底部，初起為壁厚飽滿的小水皰，有的可融合成大皰，皰液透明，周圍無紅暈。自覺奇癢，搔抓后常因繼發感染而引起丹毒、淋巴管炎等。
[0103]鱗屑角化型:好發于足跟、足緣部。由于真菌感染引起皮膚干燥、角質粗厚、脫屑，易發生皸裂。本型無水皰及化膿，病程緩慢，多常年不愈，大多數患者由糜爛型、水皰型轉化--? 。
[0104]統計學方法:計量資料用t檢驗，記數資料用X2及Rdiit檢驗，P〈0.05為差異有統計學意義。
[0105]療效評定標準:
[0106]參照《中藥新藥治療腳氣的臨床研究指導原則》中關于疾病療效判定標準。痊愈:癥狀，體征消失或基本消失，積分值減少1>95% ;顯效:癥狀，體征明顯改善，積分值減少^ 70% ;有效:癥狀，體征有好轉，積分值減少> 30% ;無效:癥狀，體征未見好轉，積分值減少 <30% ο
[0107]表1:本發明治療腳氣的情況(例)
[0108]

【權利要求】
1.一種林蛙提取混合液，其由如下步驟制備得到: (1)將10?45重量份林蛙干除雜除塵后分別經20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒徑在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入復合酶水解液，復合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，風味蛋白酶I?3wt%，酶解溫度為50?55°C，酶解時間為I?2h，酶解pH為7.0?7.5，而后85?90°C下滅酶5?15min，將混合物在溫度10?30°C時離心,離心時間為I?5min,離心轉速為2000?4000rpm,取離心后混合液體積20?40%的上層上清液； (2)將取上清后剩余混合物放入膠體磨，研磨2?15min,使混合物的平均粒徑在300 μ m以下；將混合物放入高剪切分散乳化機內，剪切I?15min，使混合物平均粒徑在100?200 μ m之間，將混合物進行噴霧干燥成粉末狀，此時得到剩余混合物的超微粉； 將上述超微粉加入到質量濃度為2?10%醋酸中，醋酸與超微粉的體積質量比為10?40mL:lg ;超聲5?75min，超聲溫度為4?30°C;經150 μ m紗網過濾，150 μ m紗網上面未過濾物質加入質量體積比為Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L氫氧化鈉，進行微波提取，微波功率為500?600W，微波時間3?9min，再次經150 μ m紗網過濾；合并兩次濾液，30?50°C下攪拌10?30min,攪拌速度為100?200rpm ;攪拌后的濾液離心,離心溫度為4?30°C,離心時間為2?40min，離心轉速為2000?15000rpm ;取上清，減壓濃縮，壓力為600?700托，溫度為65?70°C，濃縮體積比為8?40:1 ; (3)將步驟(I)和步驟(2)得到的產物混合，即得到林蛙提取混合液。
2.權利要求1所述的林蛙提取混合液在制備治療及預防腳氣的藥物中的用途。
3.一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液軟膏劑，其由如下步驟制備得到: (1)油相的制備:取5?15重量份石臘、2?10重量份單硬脂酸甘油脂、10?20重量份白凡士林、5?30重量份液體石蠟、I?15重量份司盤40、2?10重量份乳化劑ΟΡ、1?8重量份對羥基苯甲酸乙酯，混合后研磨混勻，得到油相； (2)林蛙提取混合液軟膏劑的制備:將步驟(I)制得的油相與權利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液分別加熱至70?100°C，將林蛙提取混合液加入到所述油相中，邊加入邊攪拌，攪拌時間為10?15min，攪拌速度為100?300rpm，再經納米勻質機勻質4?7次，115?121°C滅菌10?30min ;然后將I?5重量份冰片加熱到70?100°C過0.45 μ m膜，無菌條件下與上述滅菌后產物混合均勻，即得到用于治療及預防腳氣的林蛙提取混合液軟膏劑。
4.一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液噴霧劑，其由如下方法制備得到:向權利要求I所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG4.、I?5重量份的氯化鈉、I?2重量份的苯扎溴銨，100?200rpm下攪拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下攪拌10?30min，使上述物質充分混勻，115?121°C下滅菌10?20min ；自體冷卻至室溫后分裝入氣霧劑瓶，即得到治療及預防腳氣的林蛙提取混合液噴霧劑。
5.一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液濕巾，其由如下方法制備得到:向權利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG4.、I?5重量份的氯化鈉、I?2重量份的苯扎溴銨，100?200rpm下攪拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下攪拌10?30min，使上述物質充分混勻，115?121°C下滅菌10?20min ；自體冷卻至室溫后每50?60mL加入到放有(15?20) cmX (15?20) cm無菌無紡布的獨立包裝袋內，密封即得到治療及預防腳氣的林蛙提取混合液濕巾。
6.一種治療及預防腳氣的林蛙提取混合液口服劑，其由如下步驟制備得到: (1)減壓濃縮:將權利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力在8 X 13?3 X 14帕，溫度為50?85°C，濃縮比為I?5:1，得濃縮液； (2)將研細的I?5重量份醋酸鋅緩慢加入到濃縮液中，邊加入邊攪拌，攪拌速度為100?300rpm，攪拌時間為10?15min ;加完后用NaOH調節pH為6.2?6.5，攪勻后使其自然沉降，4°C冷卻過夜； (3)將上述產物0.45 μ m濾膜過濾，得澄清液體后，加入5?15重量份檸檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，加熱至40?75°C，100?300rpm攪拌，攪拌時間10?30min,混合均勻，趁熱再次0.45 μ m濾膜過濾，再向清液中加入5?15重量份黃原膠和5?15重量份山梨酸鉀，最后經0.22 μ m濾膜精濾； (4)灌裝壓蓋:在無菌條件下灌裝，壓蓋封口； (5)滅菌:加熱到62?65°C，保持30?50min，自體冷卻至室溫即得到治療及預防腳氣的林蛙提取混合液口服劑。
【文檔編號】A61K9/12GK104173382SQ201410360106
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】滕樂生, 李佺, 謝晶, 劉艷, 逯家輝, 孟慶繁, 張 杰, 劉瑜, 劉博通, 滕利榮, 王迪, 周毓麟 申請人:吉林大學