一種那屈肝素鈣的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種那屈肝素鈣的制備工藝，包括以下步驟：S1肝素鈉的降解；S2降解液的還原；S3紫外照射：用的紫外燈照射還原液，消除還原液中殘留的亞硝基化合物，降低N-NO基團含量；S4轉鈣和濃縮：用5％氯化鈣溶液在超濾膜上超濾，將還原液濃縮成固液比為1∶10的濃度；S5陰離子交換層析：采用陰離子交換樹脂進行層析，收集洗脫液；S6凍干，得到所述的那屈肝素鈣。該工藝通過陰離子交換層析來控制低分子肝素鈣的分子量，使得分子量能在1％以內精確控制，同時收率能提高至50％以上，并且自動化程度高，操作便捷，為提升產能提供了有力保障。
【專利說明】-種那屈肝素鈣的制備工藝

【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥和化學領域中的一種藥用化學藥品的制備，具體涉及一種高質量 高純度的精品那屈肝素鈣的制備工藝。

【背景技術】
[0002] 普通肝素是含多種氨基葡萄糖苷的混合物。肝素鈣在體內外能延緩或阻止血液凝 固。其抗凝機理復雜，對凝血的各個環節均有作用，包括抑制凝血酶原轉變為凝血酶、抑制 凝血酶活性、妨礙纖維蛋白原轉變為纖維蛋白、防止血小板聚集。肝素鈣還可以降低血脂， 降低LDL和VLDL，升高HDL，改變血液粘滯度，保護血管內皮細胞，預防動脈粥樣硬化，促進 血液流動，改善冠狀動脈循環等作用。
[0003] 肝素鈣的抗F II a作用較肝素鈉強，抗FXa作用較肝素鈉弱。由于其是以鈣鹽形 式在體內發揮作用，經皮下注射后，在血液循環中緩慢擴散，不會減少局部細胞間毛細血管 的鈣膠質，也不改變血管通透性，幾乎無肝素鈉皮下注射可引起局部出血的副作用。適用于 預防和治療血栓-栓性疾病以及血栓形成。肝素鈣還具有較明顯的抗腎素和抗醛固酮活 性，故亦適用于人工腎、人工肝和體外循環使用。
[0004] 目前，國內有采用酒精分級沉淀、超濾膜分離、分子篩和凝膠吸附分離的方法來控 制小分子肝素鈣的分子量，酒精分級沉淀技術落后，超濾膜分離損失大量收率，分子篩效率 低，凝膠吸附分離法代價昂貴，這些因素都限制了該產品的工業化生產和產能的擴大。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種那屈肝素鈣的制備工藝，該工藝通過陰離子交換層析來 控制低分子肝素鈣的分子量，使得分子量能在1%以內精確控制，同時收率能提高至50% 以上，并且自動化程度高，操作便捷，為提升產能提供了有力保障；克服了現有技術中的分 離方法收率低，代價昂貴、自動化程度低的缺點。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現：
[0007] -種那屈肝素鈣的制備工藝，該制備工藝包括以下步驟：
[0008] S1肝素鈉的降解：以肝素鈉為原料，并將其溶解，調節pH至酸性，然后加入亞硝酸 鈉，攪拌反應3?6小時，得到降解液；
[0009] S2降解液的還原：將降解液的pH調節至中性，加入硼氫化鈉，10°C?30°C攪拌反 應12?24小時，得到還原液；
[0010] S3紫外照射：室溫下用254nm波長的紫外燈插入還原液中照射45?90分鐘，消 除還原液中殘留的亞硝基化合物，降低Ν-Ν0基團含量；
[0011] S4轉鈣和濃縮：將紫外照射后的還原液用10?20倍重量的5%氯化鈣溶液在 lOOODa的超濾膜上超濾，將肝素鈉上的鈉離子轉化為鈣離子的同時，將還原液濃縮成固液 比為1 : 10的濃度，準備進行陰離子交換層析；
[0012] S5陰離子交換層析：采用陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈣/ml-resin 上樣，溫度為室溫，檢測波長為UV232nm，上樣結束后先用300?500mmol/L的氯化鈉溶液洗 滌，再用1?2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩，收集洗 脫液，檢測分子量分布為重均分子量3800?4800 ;
[0013] S6凍干：向洗脫液中加入酒精進行沉淀，靜置過夜，棄去上清液，沉淀再加酒精進 行脫水，棄去上清，加入純化水溶解，除菌，凍干，得到所述的那屈肝素鈣。
[0014] 進一步優選地，步驟S1中的肝素鈉的降解具體方法為：以肝素鈉為原料，并將其 溶解于其重量的10?30倍純化水中，調節pH至酸性，加入重量為肝素鈉2%?5%的亞硝 酸鈉，保溫l〇°C?30°C攪拌反應3?6小時的降解液然后加入亞硝酸鈉，攪拌反應3?6 小時，得到降解液。
[0015] 進一步優選地，用醋酸將pH調節至4?5。
[0016] 進一步優選地，亞硝酸鈉的加入量為肝素鈉重量的2. 1 %?2. 5%。
[0017] 進一步優選地，步驟S2中硼氫化鈉的加入量為肝素鈉重量的0. 5%?2%。
[0018] 進一步優選地，步驟S6中所述凍干的具體方法為：向洗脫液中加入兩倍酒精進行 沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上清液，沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，力口 入一定量的純化水溶解，除菌，在-40?-10°C下進行凍干，得到所述的那屈肝素鈣。
[0019] 進一步優選地，所述的除菌為通過除菌膜進行除菌。
[0020] 本發明提供了一種那屈肝素鈣的制備工藝，該工藝通過陰離子交換層析來控制低 分子肝素鈣的分子量，使得分子量能在1 %以內精確控制，同時收率能從30%以下提高至 50%以上，且該方法能夠制備出高純度、高活性的那屈肝素鈣產品，產品質量明顯高于EP 現行版藥典標準；并且自動化程度高，操作便捷，為提升產能提供了有力保障；故該方法具 有重要的工業應用前景。

【具體實施方式】
[0021] 本發明實施例所述的一種那屈肝素鈣的制備工藝，下面以具體實驗案例為例來說 明【具體實施方式】，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定 本發明。
[0022] 實施例1 :那屈肝素鈣的制備
[0023] 肝素鈉的降解：按30kg肝素鈉投料，溶解于21?30倍肝素鈉重量的純化水中，調 節pH至5. 5?6,加入投料量4. 5%?5%的亞硝酸鈉，保溫10°C?30°C攪拌反應3?6小 時的降解液。
[0024] 降解液的還原：將降解液的pH調回至中性，加入肝素鈉投料量的1. 5%?2%的硼 氫化鈉，l〇°C?30°C攪拌反應12?24小時，得到降解還原液。
[0025] 紫外照射：室溫下用254nm波長的紫外燈插入還原液中照射45?90分鐘，消除溶 液中殘留的亞硝基化合物，降低Ν-Ν0基團含量。
[0026] 轉鈣、濃縮：還原液用10?13倍肝素鈉重量的5%氯化鈣溶液在lOOODa的超濾 膜上超濾，將肝素鈉上的鈉離子轉化為鈣離子的同時，將還原液濃縮成約1 : 10的濃度，準 備上陰離子層析柱。
[0027] 陰離子交換層析調節分子量：采用GE healthcare公司生產的Q Sepharose FF 陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈣/ml-resin上樣，溫度為室溫，檢測波長為 UV232nm，上樣結束后先用300?500mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再用1?2mol/L的氯化鈉 溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩，收集洗脫液，檢測分子量分布為重均 分子量3800?4800。
[0028] 放入冰箱凍干：向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天 棄去上清液,沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水溶解，溶解液過 除菌膜，進箱凍干，收得最終產品17. 5kg，收率為58. 33%。
[0029] 實施例2 :那屈肝素鈣的制備
[0030] 肝素鈉的降解：按30kg肝素鈉投料，溶解于15?20倍肝素鈉重量的純化水中，調 節pH至4. 5，加入投料量2%?2. 3%的亞硝酸鈉，保溫15°C?30°C攪拌反應3?6小時的 降解液。
[0031] 降解液的還原：將降解液的pH調回至中性，加入肝素鈉投料量的0. 6%?1 %的硼 氫化鈉，15°C?20°C攪拌反應12?24小時，得到降解還原液。
[0032] 紫外照射：室溫下用254nm波長的紫外燈插入還原液中照射45?90分鐘，消除溶 液中殘留的亞硝基化合物，降低Ν-Ν0基團含量。
[0033] 轉鈣、濃縮：還原液用13?16倍肝素鈉重量的5%氯化鈣溶液在lOOODa的超濾膜 上超濾，將肝素鈉上的鈉離子轉化為鈣離子的同時，將還原液濃縮成固液比約為1 : 10的 濃度，準備上陰離子層析柱。
[0034] 陰離子交換層析調節分子量：采用GE healthcare公司生產的Q Sepharose FF 陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈣/ml-resin上樣，溫度為室溫，檢測波長為 UV232nm，上樣結束后先用300?500mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再用1?2mol/L的氯化鈉 溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩，收集洗脫液，檢測分子量分布為重均 分子量3800?4800。
[0035] 放入冰箱凍干：向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天 棄去上清液,沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水溶解，溶解液過 除菌膜，進箱凍干，收得最終產品18.4kg。
[0036] 實施例3 :那屈肝素鈣的制備
[0037] 肝素鈉的降解：按30kg肝素鈉投料，溶解于10?14倍肝素鈉重量的純化水中，調 節pH至5，加入投料量3%?4%的亞硝酸鈉，保溫20°C?30°C攪拌反應3?6小時的降解 液。
[0038] 降解液的還原：將降解液的pH調回至中性，加入肝素鈉投料量的0. 5%?0. 8%的 硼氫化鈉，l〇°C?30°C攪拌反應12?24小時，得到降解還原液。
[0039] 紫外照射：室溫下用254nm波長的紫外燈插入還原液中照射45?90分鐘，消除溶 液中殘留的亞硝基化合物，降低Ν-Ν0基團含量。
[0040] 轉鈣、濃縮：還原液用17?20倍的5%氯化鈣溶液在lOOODa的超濾膜上超濾，將 肝素鈉上的鈉離子轉化為鈣離子的同時，將還原液濃縮成固液比為1 : 10的濃度，準備上 陰離子層析柱。
[0041] 陰離子交換層析調節分子量：采用GE healthcare公司生產的Q Sepharose FF 陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈣/ml-resin上樣，溫度為室溫，檢測波長為 UV232nm，上樣結束后先用300?500mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再用1?2mol/L的氯化鈉
【權利要求】
1. 一種那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：該制備工藝包括以下步驟： S1肝素鈉的降解：以肝素鈉為原料，并將其溶解，調節pH至酸性，然后加入亞硝酸鈉， 攪拌反應3?6小時，得到降解液； S2降解液的還原：將降解液的pH調節至中性，加入硼氫化鈉，10°C?30°C攪拌反應 12?24小時，得到還原液； S3紫外照射：室溫下用254nm波長的紫外燈插入還原液中照射45?90分鐘，消除還 原液中殘留的亞硝基化合物，降低N-NO基團含量； S4轉鈣和濃縮：將紫外照射后的還原液用10?20倍重量的5 %氯化鈣溶液在lOOODa 的超濾膜上超濾，將肝素鈉上的鈉離子轉化為鈣離子的同時，將還原液濃縮成固液比為 1 : 10的濃度，準備進行陰離子交換層析； S5陰離子交換層析：采用陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈣/ml-resin上樣， 溫度為室溫，檢測波長為UV232nm，上樣結束后先用300?500mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再 用1?2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩，收集洗脫液， 檢測分子量分布為重均分子量3800?4800 ; S6凍干：向洗脫液中加入酒精進行沉淀，靜置過夜，棄去上清液，沉淀再加酒精進行脫 水，棄去上清，加入純化水溶解，除菌，凍干，得到所述的那屈肝素鈣。
2. 根據權利要求1所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：步驟S1中的肝素鈉的 降解具體方法為：以肝素鈉為原料，并將其溶解于其重量的10?30倍純化水中，調節pH至 酸性，加入重量為肝素鈉2%?5%的亞硝酸鈉，保溫10°C?30°C攪拌反應3?6小時的降 解液然后加入亞硝酸鈉，攪拌反應3?6小時，得到降解液。
3. 根據權利要求2所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：用醋酸將pH調節至 4?5〇
4. 根據權利要求2所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：亞硝酸鈉的加入量為 肝素鈉重量的2. 1 %?2. 5%。
5. 根據權利要求1所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：步驟S2中硼氫化鈉的 加入量為肝素鈉重量的〇. 5%?2%。
6. 根據權利要求1所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：步驟S6中所述凍干的 具體方法為：向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上清液， 沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水溶解，除菌，在-40?-10°C下 進行凍干，得到所述的那屈肝素鈣。
7. 根據權利要求6所述的那屈肝素鈣的制備工藝，其特征在于：所述的除菌為通過除 菌膜進行除菌。
【文檔編號】A61P37/08GK104086673SQ201410361423
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】周翔, 金晶, 陶翎, 費清清 申請人:常州千紅生化制藥股份有限公司