類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及神經營養因子【技術領域】，是一種類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的應用；本發明類葉升麻苷能夠顯著提高模型組雌性昆明小鼠腦組織中NT-3、NGF、BDNF及其受體TrkB的mRNA的表達、增強腦內BDNF和TrkB蛋白含量以及增強腦組織皮層和海馬區NT-3、NGF及其受體TrkA的蛋白表達水平，說明類葉升麻苷具有增強神經營養因子及受體的作用，能夠改善因神經營養因子及其受體表達降低引起的神經細胞損傷，且作用顯著性優于維生素E（vitaminE，VE）組和吡拉西坦片組。
【專利說明】類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及神經營養因子【技術領域】，是一種類葉升麻苷在制備保護神經營養因子 及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] 神經營養因子（neurotrophic factors, NTFs)是機體產生的能促進神經細胞 存活、生長和分化的一類多肽或蛋白質，它不僅在發育過程中調節神經元存活，在生化 和生理上激活酶的活性發揮生理功能，而且還能阻止成年神經元損傷后的死亡，促使神 經元修復、軸突再生、調節突觸可塑性和神經遞質等神經系統的活動。調控神經元細胞 的有5種相關因子：神經生長因子（nerve growth factor, NGF)、腦源性神經營養因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經營養素-3 (neurotrophin-3，NT-3)、 NT-4(neurotrophin_3，NT-4)和 NT-5(neurotrophin_3，NT-5)，這些因子具有不同的結 構特征和受體信號機制，生物學效應也不盡相同。NTFs的特異性受體是原肌球蛋白激酶 (Trk) A、B和C受體，是典型的酪氨酸激酶受體，TrkA、B、C分別是NGF、BDNF、NT-3的受體。 神經營養因子抑制神經系統中的神經元細胞凋亡，缺乏神經營養因子時發生的凋亡是一種 依賴于大多數新蛋白合成和細胞死亡相關基因的細胞死亡。已經十分清楚確定，神經營養 因子抑制神經元細胞在神經系統發育中的預定死亡。
[0003] 實驗研究已經證實，NGF具有作為用于若干種疾病的治療劑的潛能。這些疾病 包括神經變性疾病、神經炎癥和一些類型的癌癥、多發性硬化、視神經脊髓炎、肌萎縮性側 索硬化（ALS)、帕金森病、阿爾茨海默病、弗里德賴希共濟失調、亨廷頓舞蹈病、盧伊體癡呆 (dementia with Lewy bodies)、脊髓性肌萎縮、嚴重抑郁障礙、精神分裂癥、青光眼或周 圍神經病（糖尿病性或 AIDS 神經病））（Longo 等人，2007; Schulte-Herbriiggen, 2007; Shi, 2007; Hellveg, 2008; Shoval, 2005; Apfel, 2002; Anand, 2004)。NGF 能 阻止損傷后的基底前腦膽堿能神經元變性，可用來治療早老性癡呆。近年來的研究發現， BDNF能促進中腦多巴胺能神經元存活和分化，對治療Parkinson病具有一定的潛在價值， 也能阻止紅核神經元逆行性死亡，能阻止成年動物神經元損傷后的膽堿能神經元脫失。動 物實驗表明，NT-3能促進皮質脊髓束神經細胞軸突生長，且在脊髓損傷后能促進運動功能 的修復。目前許多研究指出，抑郁癥患者BDNF和TrkB水平明顯降低，而抗抑郁治療可以 逆轉此改變，上調BDNF及其受體TrkB的表達，并阻止應激引起的BDNF表達下調反應，同 時，損傷性刺激可引起多種NTFs (NGF、NT-3)的表達減少。NGF除在神經元和寡突細胞中 的神經保護特性外還誘導自身免疫脫髓鞘過程中的免疫抑制這一發現使得它成為治療中 樞神經系統炎性疾病的極為良好的候選物。然而，因不能通過血腦屏障（BBB)(P 〇dusl〇 和Curran, 1996)、其半衰期短及其副作用（Apfel, 2002)，所以NGFs不是理想的藥物候選 物。已經進行了多種努力來尋找具有NGFs激動劑活性、更好的藥代動力學特性和較少的 副作用的小分子。為了實現這一目的，已經嘗試了不同的方法（Poduslo和Curran, 1996 ; Longo 等人，1997; Maliartchouk 等人，2000; Maliartchouk 等人，2000b ;Peleshok 和 Saragovi,2006)〇
[0004] 因此，對提供具有神經保護特性的藥物、特別是NGF模擬物存在持續的需求，優選 具有多種潛能作用，而沒有NGF的缺陷具有相似作用的替代物是目前特別需求開發的。
[0005] 神經損傷疾病以及精神疾病作為一種慢性疾病，中醫藥以及天然藥物在這方面有 極大的優勢與潛力。植物中提取的天然產物在生物活性方面具有結構明確，毒性小，作用持 久、顯著等特點。苯乙醇苷類化合物普遍分布于植物界中，有著廣泛的生物活性。類葉升麻 苷為存在于肉蓯蓉、車前草等植物中，是苯乙醇苷類化合物，在抗氧化、提高免疫、抗細胞凋 亡、神經保護等方面作用顯著。
[0006] 然而，目前沒有任何文獻報道或披露關于類葉升麻苷對神經營養因子及其受體的 增強作用。


【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細 胞損傷藥物中的應用，本發明首次提出了類葉升麻苷作用于神經營養因子及其受體而起到 保護神經細胞損傷的作用。
[0008] 本發明的技術方案是通過以下措施來實現的：一種類葉升麻苷在制備保護神經營 養因子及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的應用。
[0009] 下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進： 上述神經營養因子為NGF、BDNF和NT-3中的一種以上。
[0010] 上述神經營養因子受體為TrkA或/和TrkB。
[0011] 上述類葉升麻苷以干品重量計，類葉升麻苷的含量為90%至99. 9%。
[0012] 上述類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合成得到的類葉升麻苷。
[0013] 本發明類葉升麻苷能夠顯著提高模型組雌性昆明小鼠腦組織中NT-3、NGF、BDNF 及其受體TrkB的mRNA的表達、增強腦內BDNF和TrkB蛋白含量以及增強腦組織皮層和海 馬區NT-3、NGF及其受體TrkA的蛋白表達水平，說明類葉升麻苷具有增強神經營養因子及 受體的作用，能夠改善因神經營養因子及其受體表達降低引起的神經細胞損傷，且作用顯 著性優于維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 附圖1為正常對照組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0015] 附圖2為模型組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0016] 附圖3為維生素 E組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0017] 附圖4為吡拉西坦組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0018] 附圖5為類葉升麻苷低劑量組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。 [0019] 附圖6為類葉升麻苷中劑量組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0020] 附圖7為類葉升麻苷高劑量組雌性昆明小鼠海馬CA1區放大40倍的HE染色圖。
[0021] 附圖8為正常對照組、模型組、類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉 升麻苷高劑量組、維生素 E組和吡拉西坦片組分別對雌性昆明小鼠腦組織NT-3、NGF和TrkA 蛋白表達放大40倍的影響圖。
[0022] 附圖9為正常對照組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0023] 附圖10為正常對照組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0024] 附圖11為模型組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0025] 附圖12為模型組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0026] 附圖13為維生素 E組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0027] 附圖14為維生素 E組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0028] 附圖15為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍的影響 圖。
[0029] 附圖16為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響圖。
[0030] 附圖17為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍 的影響圖。
[0031] 附圖18為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響 圖。
[0032] 附圖19為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍 的影響圖。
[0033] 附圖20為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響 圖。
[0034] 附圖21為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NT-3表達放大40倍 的影響圖。
[0035] 附圖22為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠皮層NT-3表達放大40倍的影響 圖。
[0036] 附圖23為正常對照組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的影響圖。
[0037] 附圖24為正常對照組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響圖。
[0038] 附圖25為模型組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的影響圖。
[0039] 附圖26為模型組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響圖。
[0040] 附圖27為維生素 E組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的影響圖。
[0041] 附圖28為維生素 E組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響圖。
[0042] 附圖29為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的影響圖。
[0043] 附圖30為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響圖。
[0044] 附圖31為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的 影響圖。
[0045] 附圖32為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響 圖。
[0046] 附圖33為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的 影響圖。
[0047] 附圖34為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響 圖。
[0048] 附圖35為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區NGF表達放大40倍的 影響圖。
[0049] 附圖36為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠皮層NGF表達放大40倍的影響 圖。
[0050] 附圖37為正常對照組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0051] 附圖38為正常對照組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0052] 附圖39為模型組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0053] 附圖40為模型組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0054] 附圖41為維生素 E組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0055] 附圖42為維生素 E組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0056] 附圖43為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍的影響 圖。
[0057] 附圖44為吡拉西坦片組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響圖。
[0058] 附圖45為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍 的影響圖。
[0059] 附圖46為類葉升麻苷低劑量組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響 圖。
[0060] 附圖47為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍 的影響圖。
[0061] 附圖48為類葉升麻苷中劑量組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響 圖。
[0062] 附圖49為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠海馬CA1區TrKA表達放大40倍 的影響圖。
[0063] 附圖50為類葉升麻苷高劑量組對雌性昆明小鼠皮層TrKA表達放大40倍的影響 圖。
[0064] 附圖51為類葉升麻苷的結構式。

【具體實施方式】
[0065] 本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體 的實施方式。
[0066] 實施例1，一種類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細胞損 傷藥物中的應用。
[0067] 實施例2,作為上述實施例的優化，實施例2中神經營養因子為NGF、BDNF和NT-3 中的一種以上。
[0068] 實施例3,作為上述實施例的優化，實施例3中神經營養因子受體為TrkA或/和 TrkB。
[0069] 實施例4,作為上述實施例的優化，實施例4中類葉升麻苷以干品重量計，類葉升 麻苷的含量為90%至99. 9%。
[0070] 實施例5,作為上述實施例的優化，實施例5中類葉升麻苷為從植物中提取的類葉 升麻苷或者通過合成得到的類葉升麻苷。
[0071] 類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的應 用的試驗步驟如下： 類葉升麻苷對D-半乳糖聯合A1C13誘導衰老小鼠模型的影響 1實驗方法 1. 1造模及給藥方法 雌性昆明小鼠，體質量為20±2g，隨機分為7組，每組12只：（1)正常對照組；（2)模型 組；（3)類葉升麻苷低劑量組（0. 5mg/kg); (4)類葉升麻苷中劑量組（15mg/kg); (5)類葉升 麻苷高劑量組（450 mg/kg);(6)維生素 E (vitamin E，VE)組（150mg/kg);(7)批拉西坦片 組（300mg/kg);除正常對照組外，其余組雌性昆明小鼠均腹腔注射D-半乳糖60mgAkg*d)， 灌胃A1C1 3 5mgAkg*d)，灌胃和注射劑量均為0. 1 mL/10 g，正常對照組灌胃和注射等量生 理鹽水，連續灌胃和注射90d ;從造模第61d開始，同時分別給予類葉升麻苷低劑量組、類葉 升麻苷中劑量組和類葉升麻苷高劑量組灌胃類葉升麻苷，維生素 E (vitamin E，VE)組灌胃 維生素 E，吡拉西坦片組灌胃吡拉西坦片，類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉 升麻苷高劑量組、維生素 E (vitamin E，VE)組和批拉西坦片組分別連續灌胃30d;類葉升 麻苷、VE和批拉西坦片灌胃前溶于5g/L的羧甲基纖維素鈉 （carmellose sodium, CMC-Na) 中，現用現配。
[0072] 1. 2溶液配制 1. 2. 1 D-半乳糖溶液配制方法：精密稱取D-半乳糖0. lg溶于20ml 0. 9%生理鹽水中， 混合均勻、過濾除菌，現用現配。
[0073] 1.2.2 A1C13 · 6H20 溶液配制方法：精密稱取 A1C13 · 6H20 0.0905g 溶于 100ml 0. 9%生理鹽水中，混合均勻，現用現配。
[0074] 1. 2. 3 0. 5%的伊紅酒精溶液配制方法：稱取伊紅Y 0. 5g，加少量蒸餾水溶解后， 滴加冰醋酸至漿糊狀，過濾，將濾渣烤干，用l〇〇ml 95%酒精溶解。
[0075] 1. 2. 4蘇木素染液配制方法：將2. 5g蘇木素溶于20ml無水乙醇，再將5g硫酸錯 鉀溶于330ml蒸餾水中，溶解后混合于150ml甘油中，最后加入10ml冰醋酸和0. 25g碘酸 鈉。
[0076] 1. 2. 5 1%鹽酸酒精分化液配制方法：將1ml濃鹽酸(質量百分數> 37%)加入99ml 70%的酒精中，混勻。
[0077] 1. 3 檢測 正常對照組、模型組、類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉升麻苷高劑量 組、維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組中的雌性昆明小鼠最后一次給藥后2h，每 組隨機選取6只雌性昆明小鼠，將雌性昆明小鼠斷髓處死，迅速取出腦組織，制備腦組織勻 漿，備用；然后將每組剩余的6只雌性昆明小鼠用4%甲醛灌注，取腦，放置于4%甲醛固定液 中進行固定，用于HE染色和免疫組織化學檢測。
[0078] 1. 3· 1 HE染色(采用常規HE染色方法） 1.3. 2熒光定量PCR檢測 根據NCBI網站報道的基因序列，利用Premier 5.0軟件設計引物：1)神經營養因 子-3(NT-3, neurotrophins-3):上游引物為 5'-GGA GTT TGC CGG MG ACT CTC-3'，下游引 物為 5' -GGG TGC TCT GGT AAT TTT CCT TA-3'；2)神經生長因子（Nerve growth factor, NGF):上游引物位為 5'-AAG CCC ACT GGA CTA AAC T-3'，下游引物為 5'-ACC TCC TTG CCC TTG ATG -3' ；3)腦源性神經營養因子（BDNF, brain-derived neurotrophic factor):上 游引物位為 5'-GTT ATT TCA TAC TTC GGT TGC-3'，下游引物為 5'-ATG GGA TTA CAC TTG GTC TCG -3'；4)酪氨酸激酶受體 A (TrkA, Tyrosine kinase receptor A):上游引物位為 5)酪氨酸激酶受體B(TrkB, Tyrosine kinase rec印tor B):上游引物位為 5'-TGC GCT TCA GTG GTT CTA CAA-3'，下游引物為 5' -CCG TGG AGG GGA TTT CAT TAC-3'；6) β-actin :上 TGC TTG CTG-3。以上引物由上海英駿生物技術有限公司合成。從腦組織中抽提總RNA，反 轉錄成cDNA后進行RT-PCR擴增，以2- ΛΛ ct計算目的基因 mRNA表達。
[0079] 1. 3. 3 ELISA法檢測蛋白含量 取小鼠腦組織稱重，加入等倍體積的預冷生理鹽水，于冰盤中用組織勻漿機，勻漿；然 后，用低溫離心機在4°C、3500r/min離心lOmin，提取上清；采用雙抗體夾心ELISA法檢測 腦組織BDNF和TrkA蛋白含量，具體操作按Promega ELISA試劑盒說明書。
[0080] 1.3. 4免疫組織化學檢測蛋白表達 利用免疫組化SP法檢測目的表達水平。簡述如下：將固定的腦組織進行脫水透明，浸 蠟、包埋，切片脫蠟至水，然后用10mL/L甲醇雙氧水處理10min，0. 1 mol/L PBS洗后，在切 片上滴加抗原修復液處理l〇min，0. 1 mol/L PBS洗后，切片上滴加正常山羊血清封閉液處 理20min，甩去多余液體，然后在切片上滴加兔抗小鼠的蛋白抗體（1:100)，4°C孵育過夜， 0.1111 〇1/1?85清洗；在切片上滴加生物素化的山羊抗兔186(1:100)，371：孵育201^11，0.1 mol/L PBS清洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素工作液，37°C孵育20min，0. 1 mol/ L PBS洗清洗；DAB顯色、蘇木素復染細胞核，常規脫水、透明、封片。在雌性昆明小鼠海馬組 織區域隨機選取5個高倍鏡視野，拍照，使用Image-Pro Plus 6. 0圖像分析軟件計數目的 蛋白表達的陽性細胞表達率以及測定目的蛋白表達平均吸光度值并進行分級。平均吸光度 值(陽性細胞顯色強度）評分標準為：〇 (陰性)，1 (弱陽性)，2 (陽性)，3 (強陽性)。
[0081] 1. 3. 5 Western blot 法檢測 NT-3 蛋白表達 提取腦組織總蛋白，測定蛋白濃度；蛋白上樣量為50--g，經電泳、轉膜、封閉后，加入 兔抗抗體（1:1 〇〇〇)，4°C孵育過夜，Tris-HCl緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標記的山 羊抗兔IgG (1:2 000)中室溫孵育2 h后，進行ECL反應，以β-actin抗體為內參照；目的 蛋白和相應的β -actin片段的條帶吸光度比值為相對表達量分別進行比較。
[0082] 1. 3. 6統計學分析 采用SPASS16. 0統計學軟件對實驗數據進行統計學分析，數據結果用' x± s表示，組間 比較采用單因素方差分析和t檢驗；P < 0. 05為差異有統計學意義。
[0083] 2 結果 2.1類葉升麻苷對小鼠腦組織形態的影響 各組對雌性昆明小鼠腦組織形態的影響見圖1至圖7所示，由圖1至圖7可以看出， HE染色后，雌性昆明小鼠神經細胞胞漿呈紫紅色，核呈紫藍色，可以清楚地觀察細胞的整體 形態。實驗中，正常對照組雌性昆明小鼠皮層腦細胞結構正常，數量較多，胞核清晰，胞漿豐 富，間質無水腫表現，海馬CA1區錐體細胞3?4層，排列整齊，細胞相對稠密，細胞核圓而 大，核仁清晰，未見炎細胞浸潤，未見細胞空泡變性、未見細胞壞死；模型組雌性昆明小鼠皮 層神經細胞減少，體積變小，胞核與胞漿界限模糊，核固縮成三角形或不規則形，核仁消失， 海馬CA1區錐體細胞層數減少，排列紊亂，明顯變稀疏，不規則，細胞體積變小，部分細胞出 現空泡變性，細胞出現固縮壞死；與模型組比較，維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦 片組雌性昆明小鼠皮層神經細胞結構較正常，數量較多，雖仍有不同程度的神經細胞變形， 但變形神經細胞數量明顯減少，海馬CA1區錐體細胞排列整齊，相對稠密，未見細胞出現空 泡、固縮壞死；類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組和類葉升麻苷高劑量組雌性昆明 小鼠皮層神經元細胞結構正常，密度增高，胞核清晰，胞漿豐富，海馬CA1區錐體細胞排列 整齊，細胞層數增加，排列相對稠密，空泡、固縮壞死細胞減少，僅零星可見，雌性昆明小鼠 腦組織細胞的數量和排列均明顯得到改善，說明類葉升麻苷具有明顯的神經元細胞保護作 用，其作用明顯優于維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組。
[0084] 2. 2類葉升麻苷對NT-3、NGF、BDNF及其受體TrkA和TrkB的mRNA表達的影響 類葉升麻苷對NT-3、NGF、BDNF及其受體TrkA和TrkB的mRNA表達的影響見表1所 示，由表1可以看出，模型組雌性昆明小鼠腦內NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表達水平 顯著降低0° < 〇. 01 )，而TrkA的mRNA表達水平降低，但不具有統計學意義0° > 0. 05);除 類葉升麻苷低劑量組對NT-3的mRNA表達水平無影響外，類葉升麻苷中劑量組和類葉升麻 苷高劑量組均能顯著增高雌性昆明小鼠腦內NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表達水平0° < 0.01)，而對TrkA的mRNA表達水平可以提高，但不具有統計學意義0°> 0.05);吡拉西 坦組也能夠顯著增高雌性昆明小鼠腦內NT-3、NGF、BDNF的mRNA表達水平0° < 0. 05或產 < 0. 01)，對TrkB的mRNA表達水平無影響0° > 0. 05);而維生素 E (vitamin E，VE)組則 對NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表達水平均無影響0° > 0. 05);從表1可以看出，類葉 升麻苷對神經營養類因子及其受體的影響作用優于吡拉西坦組和VE組。
[0085] 2. 3類葉升麻苷對BDNF及其受體TrkB蛋白含量的影響 類葉升麻苷對雌性昆明小鼠腦組織中BDNF和TrkB蛋白含量的影響見表2所示，由表 2可以看出，與正常對照組相比，模型組雌性昆明小鼠腦內BDNF和TrkB的蛋白含量顯著降 低0°< 0.05或/0.01);與模型組相比，類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組和 類葉升麻苷高劑量組均能顯著增高雌性昆明小鼠腦內BDNF和TrkB的蛋白含量0° < 0. 05 或產< 0.01);吡拉西坦組也能顯著增高雌性昆明小鼠腦內BDNF蛋白含量0°< 0.05)，但 對TrkB蛋白含量無影響0°> 0.05);維生素 E (vitamin E，VE)組對BDNF和TrkB蛋白含 量均無影響0° > 〇. 05);說明類葉升麻苷對BDNF及其受體TrkB的影響作用顯著性優于吡 拉西坦組和VE組。
[0086] 2. 4類葉升麻苷對NT-3、NGF及其受體TrkA蛋白表達的影響 類葉升麻苷對雌性昆明小鼠腦組織中NT-3、NGF和TrkA蛋白表達的影響見表3所示； 類葉升麻苷對雌性昆明小鼠腦組織中NT-3蛋白表達的影響見表4所示；類葉升麻苷對雌性 昆明小鼠皮層和海馬CA1區NGF蛋白表達的影響見表5所示；類葉升麻苷對雌性昆明小鼠 皮層和海馬CA1區TrkA蛋白表達的影響見表6所示；由圖8至圖50和表3、4、5、6可以看 出，與正常對照組相比，模型組雌性昆明小鼠腦內NT-3、NGF及其受體TrkA蛋白表達水平顯 著降低0° < 0. 05或產< 0. 01);與模型組相比，類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組 和類葉升麻苷高劑量組雌性昆明小鼠腦內NT-3、NGF及其受體TrkA蛋白表達水平顯著增高 0° < 0. 05或/7 < 0. 01);維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦組也能顯著增高雌性昆 明小鼠腦內NT-3、和TrkA蛋白表達水平0°< 0. 05或/0. 01)，但不能影響NGF蛋白表 達水平0° > 0· 05)。
[0087] 類葉升麻苷對NT-3蛋白表達的影響，由圖9至圖22和表4的免疫組織化學染色圖 觀察發現正常對照組、模型組、類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉升麻苷高 劑量組、維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區NT-3 表達的變化，在光鏡下可見NT-3免疫組化染色陽性標記物為棕褐色顆粒，位于胞質中，胞 核呈陰性反應；圖像分析系統分析結果顯示，與正常對照組相比，模型組雌性昆明小鼠皮層 和海馬CA1區神經元NT-3陽性細胞數明顯減少，胞漿著色變淺，光密度值降低0°< 0.05 或產< 0. 01);與模型組相比，類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組和類葉升麻苷高 劑量組均能增加雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區APP陽性細胞數0° < 0. 05或/^ < 0. 01)， 顯著加深胞漿著色程度，提高光密度值〇°< 0.05或/7 <0.01);維生素 E (vitamin E，VE) 組和吡拉西坦組均能明顯增加雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區NT-3陽性細胞數(產< 0. 05 或P < 0.01)，提高光密度值0°< 0.01)。
[0088] 類葉升麻苷對NGF蛋白表達的影響，由圖23至圖36和表5的免疫組織化學染色圖 觀察發現正常對照組、模型組、類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉升麻苷高 劑量組、維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區NGF 表達的變化，在光鏡下可見NGF免疫組化染色陽性標記物為棕褐色顆粒，表達部位分布較 廣，在神經元的胞膜、胞漿、核膜上均可見到；與正常對照組相比，雌性昆明小鼠皮層和海馬 CA1區NGF陽性細胞顯著減少0°< 0.01)，染色變淺，光密度值顯著降低0°< 0.01);與模 型組相比，類葉升麻苷治療各組的雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區NGF陽性細胞數目均能 顯著增多0° < 0. 05或/^ < 0. 01)，染色變深，尤其在海馬CA1區0° < 0. 01) ;VE組和吡拉 西坦組能明顯增加模型組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區的NGF陽性細胞數目0° < 0. 05 或 P < 0· 01)和染色程度 0° < 0· 05 或/7 < 0· 01 )。
[0089] 類葉升麻苷對TrkA蛋白表達的影響，由圖37至圖50和表6的免疫組織化學染色 圖觀察發現正常對照組、模型組、類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉升麻苷 高劑量組、維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區 TrkA表達的變化，在光鏡下可見TrkA免疫組化染色陽性標記物為深淺不一的棕黃色顆粒， 位于神經元胞漿內；結果顯示模型組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1區TrkA陽性細胞的數量 和平均光密度值評分均明顯低于正常對照組0° < 0. 01)，且細胞的胞漿染色較淡，尤其在 海馬CA1區差異具有顯著性Μ < 0. 01);類葉升麻苷低劑量組、類葉升麻苷中劑量組、類葉 升麻苷高劑量組、維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦組雌性昆明小鼠皮層和海馬CA1 區可見較多胞漿呈淺棕黃至深棕黃色顆粒狀的陽性細胞，其TrkA陽性細胞的數量和平均 光密度值評分較模型組均顯著增加，差異具有顯著性0° < 〇. 05或產< 0. 01)。
[0090] 通過類葉升麻苷對NT_3、NGF及其受體TrkA蛋白表達的影響可以看出類葉升麻苷 能夠顯著提高模型組雌性昆明小鼠腦組織中NT-3、NGF、BDNF及其受體TrkB的mRNA的表達 以及增強腦組織皮層和海馬區NT-3、NGF及其受體TrkA的蛋白表達水平，說明類葉升麻苷 具有增強神經營養因子及受體的作用，且作用顯著性優于維生素 E (vitamin E，VE)組和吡 拉西坦片組。
[0091] 綜上所述，本發明類葉升麻苷能夠顯著提高模型組雌性昆明小鼠腦組織中NT-3、 NGF、BDNF及其受體TrkB的mRNA的表達、增強腦內BDNF和TrkB蛋白含量以及增強腦組織 皮層和海馬區NT-3、NGF及其受體TrkA的蛋白表達水平，說明類葉升麻苷具有增強神經營 養因子及受體的作用，能夠改善因神經營養因子及其受體表達降低引起的神經細胞損傷， 且作用顯著性優于維生素 E (vitamin E，VE)組和吡拉西坦片組。
[0092] 以上技術特征構成了本發明的實施例，其具有較強的適應性和實施效果，可根據 實際需要增減非必要的技術特征，來滿足不同情況的需求。

【權利要求】
1. 一種類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經細胞損傷藥物中的 應用。
2. 根據權利要求1所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用，其特征在于神經營養因子為NGF、BDNF和NT-3中的一種以上。
3. 根據權利要求1或2所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神 經細胞損傷藥物中的應用，其特征在于神經營養因子受體為TrkA或/和TrkB。
4. 根據權利要求1或2所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神 經細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷以干品重量計，類葉升麻苷的含量為90% 至 99. 9%。
5. 根據權利要求3所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷以干品重量計，類葉升麻苷的含量為90% 至 99. 9%。
6. 根據權利要求1或2所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神 經細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過 合成得到的類葉升麻苷。
7. 根據權利要求3所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合 成得到的類葉升麻苷。
8. 根據權利要求4所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合 成得到的類葉升麻苷。
9. 根據權利要求5所述的類葉升麻苷在制備保護神經營養因子及其受體引起的神經 細胞損傷藥物中的應用，其特征在于類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合 成得到的類葉升麻苷。
【文檔編號】A61K31/7032GK104147021SQ201410363553
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】閆明, 高莉, 彭曉明, 霍仕霞 申請人:新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所