一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應用，選用生長在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素，采用微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50℃，乙醇濃度70%，提取時間30min；制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，結合果蠅生存實驗和體內生化指標測定結果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效；通過小鼠肝損傷實驗表明，從昆侖雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，對CCl4致小鼠肝損傷有一定的保護作用，應用從昆侖雪菊中提取原花青素具有良好的延緩衰老功效，具有廣泛的實用價值。
【專利說明】 一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及原花青素的提取制備的【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種從昆侖雪菊原花青素的提取方法及其應用的制備【技術領域】。

【背景技術】
[0002]新疆昆侖雪菊,學名為兩色金雞菊{Coreopsis tine tori a)是菊科金雞菊屬一年生草本植物的干燥頭狀花序.在新疆主要分布于和田地區海拔高3000米左右的昆侖山區，有較豐富的野生資源。長期以來，昆侖雪菊被當地居民當花茶飲用，新疆維吾爾醫院也作為一種維藥材應用.具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功，用花泡茶飲，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒，是具有廣闊前景和研究價值的新品種。作為藥食兩用資源，昆侖雪菊在近幾年已經成為市場的賣點，已成為人們的高檔饋贈禮品。關于昆侖雪菊黃酮研究較多，而對昆侖雪菊原花青素的研究鮮見報道。
[0003]原花青素iProcyemidinsWC)是一種黃燒_3_醇或黃燒_3，4_ 二醇聚合而成的一大類多酚化合物的總稱，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑。原花青素還具有保護心血管、預防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、美容等，并具有改善人體微循環的功能。原花青素作為植物中一類普遍的次級代謝產物同花色素、生物黃酮等物質一樣廣泛分布于各種植物的種子、葉子、果實、花和皮、殼等處，目前國內外多從葡萄籽中提取原花青素，其次是從松樹皮中提取。而以昆侖雪菊花作為提取原花青素原料，研究其提取方法和含量的文章還未見報道。
[0004]動態超高壓微射流(DHPM)是一種特殊形式的高壓均質技術，它利用高壓使液體物料高速流過狹窄的縫隙時受到強大的剪切力、撞擊力以及空穴爆炸力等綜合作用，使細胞破碎、促進細胞內容物溢出，從而提高有效成分的提取率的過程。目前已有學者研究了 DHPM在提取和大分子改性方面的應用，如對馬鈴薯葉中總黃酮提取及活性影響、木瓜蛋白酶活性的影響、脂肪酸脂質體的制備、對胰蛋白酶的活性、穩定性和構象的影響等，但尚無關于將DHPM技術運用于雪菊原花青素提取的相關研究報道。


【發明內容】

[0005]針對現有技術中未見有關將DHPM技術運用于雪菊原花青素提取的研究和報道，本發明需要解決的技術問題就在于克服現有技術的缺陷，旨在提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應用，制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，結合果蠅生存實驗和體內生化指標測定結果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效，具有廣泛的應用價值。
[0006]本發明提供的技術方案:
本發明以生長在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素，優化提取工藝，并對提取物進行抗氧化、延緩果蠅衰老作用及對CC14誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用的研究，確定了從昆侖雪菊中提取原花青素在延緩衰老中的應用具有良好的效果；制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，是一種天然的抗氧化劑，結合果蠅生存實驗和體內生化指標測定結果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效；通過小鼠肝損傷實驗表明，從從昆侖雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，對CC14致小鼠肝損傷有一定的保護作用，應用從從昆侖雪菊中提取原花青素具有良好的延緩衰老功效，具有廣泛的應用價值。
[0007]本發明具體提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比計，具體提取方法步驟如下:
(I)生長在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機中粉碎后過40目篩。
[0008](2)用石油醚對雪菊粉脫脂8小時并在50°C烘干2h。
[0009](3)乙醇浸潤:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜。
[0010](4)預均質:使用均質壓力為30MPa,均質2次。
[0011](5)動態超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時間30min。
[0012](6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時間2.5 h，提取溫度60 °C，回流提取2次，離心并合并濾液,經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30°C,轉速40rpm。
[0013](7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30°C,轉速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76%。
[0014](8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一 50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
[0015]進一步，本發明通過體外抗氧化實驗表明，對于清除羥基自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.052mg/mL與0.045mg/mL ;對于清除DPPH.自由基，抗壞血酸與原花青素的IC50值分別為0.003mg/mL與0.025mg/mL，表明原花青素的清除羥基自由基與DPPH.自由基活性比抗壞血酸強；昆侖雪菊原花青素與抗壞血酸的總抗氧化能力IC5tl值分別為0.002mg/mL與0.003mg/mL,由此可表明昆侖雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0016]本發明通過果蠅生存實驗結果表明，采用本發明采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素添加量達到0.0067%時雌性與雄性的平均壽命均顯著高于相應對照組；果蠅體內實驗測定表明，原花青素添加量為0.0201%劑量組的SOD活性較對照組顯著提高，而MDA含量卻顯著降低，表明采用本發明提供的動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素具有延緩果蠅衰老的功效。
[0017]本發明通過小鼠肝損傷實驗結果表明，采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素可以減輕實驗性肝損傷所致炎性反應，降低肝體指數，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得結論，本發明采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素對CC14造成的實驗性肝損傷有保護作用，其機制可能與雪菊原花青素抗氧化作用有關。
[0018]本發明提供給了原花青素含量的具體計算方式:
顯色劑制備:A液為0.5%香草醛溶液(稱取0.500g香草醛溶于甲醇液中，最后定容到10mL) ;B液為4%的鹽酸液(取4mL濃鹽酸溶于甲醇中，定容至10mL );顯色劑:A:B=1:1，現用現配。
[0019]原花青素對照品的制備:精密稱取原花青素對照品10.0 mg，放置于1mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得到濃度是1.0mg/mL的原花青素對照品溶液。
[0020]原花青素標準曲線:準確吸取原花青素對照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5mL別然后用甲醇定容至10mL。各取ImL分別加入5mL顯色劑,搖勻,避光。在30±1°C恒溫水浴中保持30min，保溫比色。取出比色管，在Amax=500nm波長下，測定其吸光度，繪制標準曲線。根據原花青素濃度與吸光值的數量關系，繪制出標準曲線。得標準回歸曲線方程為:A=0.4066C-0.0018, r=0.9996，說明原花青素濃度在0.050?1.250mg/mL之間呈良好的線性關系。
[0021 ]原花青素含量=2.4594A+0.0044
本發明提供給了原花青素提取得率計算方式:
實驗數據采用Minitlabl5分析軟件進行數據分析，以原花青素提取得率為考察指標原花青素提取得率計算公式:得率/%=[CXVXn/W] X 100%
其中:C為根據標準曲線計算出的濃度mg/mL ^為提取液的體積mL ;11為樣品溶液的稀釋倍數；W為樣品的質量mg。
[0022]本發明采用統計方法利用Minitabl5、SPSS17.0、Excel等軟件對實驗數據進行分析。
[0023]通過實施本發明具體的
【發明內容】
可以達到以下有益效果:
(I)本發明采用動態超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素，并利用正交實驗優化提取工藝，同時對昆侖雪菊原花青素的抗氧化性及延緩衰老作用進行了研究，探討了雪菊原花青素對小鼠CC14肝損傷的保護作用；實驗結果表明，動態超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素的最佳條件是:微射流壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時間30min，此條件下原花青素的提取率為22.29%，純度為25.68 ±0.98%，經AB-8大孔樹脂純化后純度為66.76±0.34%。體外抗氧化實驗表明，對于清除羥基自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.052mg/mL與0.045mg/mL ;對于清除DPPH.自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.003mg/mL與0.025mg/mL，表明原花青素的清除羥基自由基與DPPH.自由基活性比抗壞血酸強；昆侖雪菊原花青素與抗壞血酸的總抗氧化能力IC5tl值分別為0.002mg/mL與0.003mg/mL,由此可表明昆侖雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0024](2)本發明通過果蠅生存實驗結果表明，采用本發明采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素添加量達到0.0067%時雌性與雄性的平均壽命均顯著高于相應對照組；果蠅體內實驗測定表明，原花青素添加量為0.0201%劑量組的SOD活性較對照組顯著提高，而MDA含量卻顯著降低，表明采用本發明提供的動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素具有延緩果蠅衰老的功效。
[0025](3)本發明通過小鼠肝損傷實驗結果表明，采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素可以減輕實驗性肝損傷所致炎性反應，降低肝體指數，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得結論，本發明采用動態超高壓微射流輔助提取技術從中提取出雪菊原花青素對CC14造成的實驗性肝損傷有保護作用，其機制可能與雪菊原花青素抗氧化作用有關。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明提供的活性研究試驗路線圖。
[0027]圖2顯示為乙醇濃度對提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0028]圖3顯示為提取溫度對提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0029]圖4顯示為提取時間對提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0030]圖5顯示為微射流壓力對提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0031]圖6顯示為原花青素清除羥基自由基活性圖。
[0032]圖7顯示為原花青素清除DPPH.自由基活性圖。
[0033]圖8顯示為原花青素總抗氧化活性圖。

【具體實施方式】
[0034]下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例，本發明中基本涉及到的％無特別指明都是重量百分比計。
[0035]試驗原料:昆侖雪菊采自新疆和田的昆侖山區，由新疆和田沙漠玫瑰有限責任公司采摘并提供，由新疆醫科大學藥學院的胡君萍博士鑒定為菊科金雞菊品種。學名為兩色金雞菊C.tinctoria,本實驗所用的為其干燥的花序；原花青素標準品(純度95%),天津市尖峰天然產物研究;AB-8大孔吸附樹脂，天津南開大學實驗化工廠；天津建成生物試劑有限公司；2，2-二苯基-1-苦味酰苯肼(DPPH)，天津市化學試劑三廠；S0D試劑盒、MDA試劑盒自南京建成生物工程研究所。CCL4，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；聯苯雙酯(1.5mg/粒)，浙江萬邦藥業股份有限公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司。
[0036]主要化學試劑:乙醇、甲醇、香草醛、濃鹽酸、雙氧水、碘化鉀、三氯甲烷、鄰二氮菲、磷酸納、硫酸亞鐵、石油醚、丙酸、瓊脂粉、酵母粉，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵等化學試劑均為分析純。
[0037]實驗動物:黑檀體果蠅(Ebony，e)由新疆大學生命科學與技術學院微生物實驗室提供同濟大學生命科學與技術學院鑒定；昆明種小鼠，體重18_22g，雌雄各半120只，合格證號N0.65000200000072，由新疆實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK (新)2011-0001。本發明具體采用的活性研究試驗路線圖參見附圖1。
[0038]試驗儀器:SABA18全自動生化儀,意大利；IKA旋轉蒸發儀,廣州儀科實驗室技術有限公司；V-1100D型可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱，日本三洋電子生物儀器有限公司；TDL_5_A離心機，上海安亭科學儀器廠；THZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；FZ102-SM真空冷凍干燥設備，德國西門子公司；SHB-1II循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華有限公司；H-1微型混合器，上海康禾光電儀器有限公司；高速冷凍離心機，德國SIGMA電儀器有限公司；體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；隔水式恒溫培養箱GHP-9050，上海-恒科技有限公司；985-370型勻漿器，美國B1spec公司等。
[0039]本發明中選用的所有原輔材料，所選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0040]實施例一:新疆昆侖雪菊原花青素的提取
本發明具體提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比計，具體提取方法步驟如下:
(I)生長在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機中粉碎后過40目篩。
[0041](2)用石油醚對雪菊粉脫脂8小時并在50°C烘干2h。
[0042](3)乙醇浸潤:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜。
[0043](4)預均質:使用均質壓力為30MPa,均質2次。
[0044](5)動態超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時間30min。
[0045](6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時間2.5 h，提取溫度60 V，回流提取2次，離心并合并濾液,經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30°C,轉速40rpm。
[0046](7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30°C,轉速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76%。
[0047](8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一 50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
[0048]實施例二:提取新疆昆侖雪菊原花青素最優工藝的確定
選擇濃度為60%(V/V)的乙醇作為提取溶劑，反復浸提兩次，以乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度溫度4個因素做單因素實驗，以昆侖雪菊原花青素提取得率和DPPH.清除率為評價提取工藝條件的指標。
[0049]1.1乙醇濃度對提取得率及DPPH.清除率的影響
準確稱取1.0OOg雪菊花粉，石油醚脫脂至無色并烘干，料液比1:40，配置40%，50%，60%，70%, 80%, 90%乙醇濃度放置于4°C冰箱中靜置過夜，經30MPa，均質2次后，在微射流壓力100 MPa下處理2次，50°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測吸光度值，計算得率；計算DPPH.清除率，結果如附圖2所示:
由附圖2所示，在乙醇濃度40-60%的范圍內，提取得率及DPPH.清除率均呈現增長趨勢，隨著提取劑用量的增加，原花青素提取得率明顯增大，這是因為對于一定量的粉末原料，溶劑用量的增加降低了濃度，增加了原料與溶劑接觸面的濃度差，從而提高了原花青素與溶劑的擴散速度，原花青素提取得率升高。此時DPPH.的清除率為78.64%，隨著乙醇濃度進一步增加，但是當乙醇濃度超過60%時，原料中的絕大部分原花青素已被溶解出來，提取得率緩慢降低，對DPPH.清除率也有所下降，因此選擇60%的乙醇作為溶劑。
[0050]1.2提取溫度對提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理條件同2.1.1.1，在微射流壓力100 MPa下處理2次，20°C，30°C AOV, 50°C，60°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測吸光度值，計算得率；計算DPPH.清除率，結果如附圖3示。
[0051]從附圖3可以看出，提取溫度在20~40°C之間時，隨著提取溫度的增加，原花青素提取得率相應增大，這是由于升高溫度增加了溶劑分子和原花青素分子的動能，促進了原花青素的擴散作用，使原花青素溶出率增大。但當溫度超過40°C時變得緩慢降低，這可能是因為溫度升高，溶劑的揮發加快，減少了溶劑和原料之間的有效接觸面，使出原花青素提取得率下降。且在40°C時，DPPH.的清除率高達88.00%，，因此選擇40°C為最佳提取溫度。
[0052]1.3提取時間對提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理條件同2.1.1.1，在微射流壓力10MPa下處理2次，40°C水浴提取10、20、30、40、50分鐘，提取2次，離心合并濾液后測吸光度值，計算得率；計算DPPH.清除率，結果如附圖4所示。
[0053]由附圖4可見，隨著提取時間的增加，雪菊原花青素提取得率出現先增加后減小的趨勢，當提取時間30min時雪菊原花青素提取得率不再增加反而有所下降。分析原因可能是長時間作用下，有效成分發生降解或者是由于時間過長，造成雜質含量增加，有效成分含量隨之下降，從而導致提取得率的降低。其DPPH.的清除率達到78.85%。因此選擇30min為最佳提取時間。
[0054]1.4微射流壓力對提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理條件同上，在微射流壓力分別40MPa，60MPa，80 MPa, 10MPa,120Mpa下處理2次，40°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測吸光度值，計算得率；計算DPPH.清除率，結果見附圖5。
[0055]由附圖5所示，隨著微射流壓力的增大，提取得率及DPPH ?清除率均呈現顯著增長趨勢，說明增加微射流壓力有利于溶劑滲透到植物細胞內部，加速相互滲透，以增加原花青素在乙醇中的溶解度。在微射流壓力上升到10MPa時，DPPH.清除率達到57.32%。隨著壓力進一步的增大，提取得率及DPPH.清除率都趨于平緩，因此，考慮到儀器的承受負荷，選擇10MPa為最佳。
[0056]結論:動態超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素最優工藝為:提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時間30min，此條件下原花青素的提取率為22.29%，純度為25.68±0.98%，經AB-8大孔樹脂純化后純度為66.76±0.34%。
[0057]實施例三:新疆昆侖雪菊原花青素最優工藝的確定
以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、微射流壓力為自變量設計四因素三水平L9 (34)正交優化實驗昆侖雪菊原花青素提取工藝。
[0058]表1:正交試驗結果表

【權利要求】
1.一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，其特征在于，％按照重量百分比計，具體提取方法步驟如下: (1)生長在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機中粉碎后過40目篩； (2)用石油醚對雪菊粉脫脂8小時并在50°C烘干2h； (3)乙醇浸潤:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜； (4)預均質:使用均質壓力為30MPa,均質2次； (5)動態超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時間30min ； (6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時間2.5 h，提取溫度60 V，回流提取2次，離心并合并濾液，經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30 °C,轉速40rpm ； (7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經過旋轉蒸發工藝，蒸發溫度30°C，轉速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76% ； (8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
2.一種昆侖雪菊原花青素在延緩衰老中的應用。
【文檔編號】A61K31/352GK104173401SQ201410365439
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】敬思群, 柴文杰 申請人:新疆大學, 敬思群