肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于藥物輸送【技術領域】。具體涉及一種肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體及其制備方法和應用。該方法通過將視黃醇分子偶聯到聚乙烯亞胺載體上，利用其對肝星狀細胞的主動靶向功能，用作肝纖維化和肝硬化治療的基因藥物輸送載體。載體中陽離子材料聚乙烯亞胺通過非共價的靜電作用包裹基因藥物，使藥物更容易釋放出來，載體中的視黃醇賦予載體肝星狀細胞靶向特性，提高了藥物的利用率，降低了其毒副作用，載體進入血液循環后可結合白蛋白，從而延長載體的循環時間。為肝纖維化和肝硬化等常見的慢性進行性肝臟疾病提供了一種新的有效的抗肝纖維化和肝硬化的基因藥物靶向輸送載體。
【專利說明】肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體及其制備方法和應用
一、【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物輸送【技術領域】。具體涉及一種肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體及其制備方法和應用。
二、【背景技術】
[0002]肝纖維化和肝硬化是常見的慢性進行性肝臟疾病，是肝臟對慢性損傷進行的一種修復反應。受損的肝細胞和活化的枯否氏細胞分泌的各種細胞因子會導致肝星狀細胞(HSC)活化成為肌纖維母細胞，活化的星狀細胞合成并分泌大量的以膠原為主的細胞外基質沉積在肝臟，導致肝纖維化的產生，肝纖維化可進一步發展成為肝硬化。
[0003]隨著對肝纖維化和肝硬化發病分子機理認識的深入及基因治療技術的發展，使基因治療肝纖維化和肝硬化成為可能。目前基因治療主要集中于調控肝纖維化和肝硬化進程中起主要作用的肝星狀細胞(HSC)活化相關的細胞因子的表達。報告較多的有轉化生長因子β (TGF-β)肝細胞生長因子(HGF)及干擾素Y (IFN-y)等。但是由于藥物進入肝臟后主要被肝細胞或枯否氏細胞吸收，而在肝內細胞群體中所占比例較小的肝星狀細胞(HSC)藥物吸收困難，導致治療效果并不理想。
[0004]針對上述問題，靶向輸送成為肝纖維化和肝硬化治療研究中非常有前途的治療策略。藥物靶向載體能夠選擇性地分布于肝臟，并能高特異性、高親和力地與肝星狀細胞(HSC)結合，將藥物特異性釋放至肝星狀細胞(HSC)而發揮抗肝纖維化和肝硬化作用，同時減少因藥物在其他臟器中分布而引起的不良反應。但常用載體存在血液循環時間短，藥物釋放困難等問題，目前尚缺少一種有效的抗肝纖維化和肝硬化的基因藥物靶向輸送載體。
三、
【發明內容】
[0005]本發明需要解決的問題是提供一種具有肝星狀細胞靶向功能的基因輸送載體及其制備方法和該載體能夠用于肝纖維化和肝硬化治療基因藥物的靶向輸送。
[0006]本發明的技術方案為將肝星狀細胞靶向配體偶聯到陽離子載體上。所用的靶向配體是視黃醇(Retinol)分子；所述的陽離子載體是聚乙烯亞胺(PEI)。
[0007]為了更好的實現本發明，發明人提供以下優選方案:
[0008]所述偶聯過程為:取0.56g N, N-羰基二咪唑(⑶I)溶于20ml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后加入Ig視黃醇，在避光條件下30°C恒溫攪拌24小時；再加入4.32g聚乙烯亞胺(PEI)，繼續攪拌24小時；將上述溶液轉入截留分子量為12000-14000的透析袋中，雙蒸水透析4天；將透析液凍干得到藥物輸送載體材料。
[0009]所述聚乙烯亞胺(PEI)優選以下幾種:線型PEI，分子量為1，300道爾頓，2，500道爾頓，4，000道爾頓，25，000道爾頓，40，000道爾頓，250，000道爾頓；支化PEI，分子量為600道爾頓，I, 200道爾頓，I, 800道爾頓，10，000道爾頓，25，000道爾頓，70，000道爾頓，50，000-100，000 道爾頓，800，000 道爾頓。
[0010]相對于現有輸送載體，本發明的有益效果是:
[0011]載體中陽離子材料聚乙烯亞胺通過非共價的靜電作用包裹基因藥物，使藥物更容易釋放出來，載體中的視黃醇賦予載體肝星狀細胞靶向特性，提高了藥物的利用率，降低了其毒副作用，載體進入血液循環后可結合白蛋白，從而延長載體的循環時間。為肝纖維化和肝硬化等常見的慢性進行性肝臟疾病提供了一種新的有效的抗肝纖維化和肝硬化的基因藥物靶向輸送載體。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是視黃醇(Retinol)與聚乙烯亞胺(PEI)偶聯過程圖及Retinol-c-PEI (RcP)結構圖
[0013]圖2是PEI和RcP的傅里葉變換紅外光譜檢測圖譜
[0014]圖3是Rho-ASO/PEI和Rho_AS0/RcP轉染肝星狀細胞(HSC-T6)的情況
[0015]圖4是qPCR測定四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型中對照組、模型組和治療組的I型膠原蛋白mRNA的相對表達量
[0016]圖5是qPCR測定四氯化碳誘導的小鼠肝硬化模型中對照組、模型組和治療組的I型膠原蛋白mRNA的相對表達量
五、【具體實施方式】
[0017]本發明主要涉及肝星狀細胞靶向輸送載體的制備方法及其應用。在具體實施過程中，涉及載體的制備，載體對肝星狀細胞的轉染以及載體用于肝纖維化和肝硬化的治療。
[0018]1.載體的制備
[0019]①視黃醇的活化
[0020]取0.56g N, N-羰基二咪唑(⑶I)溶于20ml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后加入Ig視黃醇，在避光條件下30°C恒溫攪拌24小時，得到活化的視黃醇。
[0021]②聚乙烯亞胺和活化的視黃醇偶聯
[0022]在活化的視黃醇中加入4.32g聚乙烯亞胺(PEI)，繼續攪拌24小時，得到RcP。聚乙烯亞胺分子量如下:線型PEI，分子量為1，300道爾頓，2，500道爾頓，4，000道爾頓，25，000道爾頓，40，000道爾頓，250，000道爾頓；支化PEI，分子量為600道爾頓，I, 200道爾頓，I, 800道爾頓，10，000道爾頓，25，000道爾頓，70，000道爾頓，50，000-100，000道爾頓，800，000道爾頓。
[0023]③透析
[0024]將反應液轉入截留分子量為12000-14000道爾頓的透析袋中，雙蒸水透析4天。
[0025]④凍干
[0026]將透析液放到-80 V超低溫冰箱2-3小時，在冷凍干燥機上冷凍干燥48小時。然后將材料保存于干燥器中備用。
[0027]圖2是PEI和RcP傅里葉變換紅外光譜檢測圖譜，從圖中可以看出，1745.2CHT1處的吸收峰是羧基和氨基反應的信號，而在3284.2CHT1處吸收峰的顯著變化則表明PEI的—NH2基與Retinol連接。在1648.ScnT1和1164.ScnT1處的峰值的變化則表明PEI上伯氨基和叔氨基也已經被修飾。以上說明視黃醇分子被成功的偶聯到聚乙烯亞胺分子上，RcP載體制備成功。
[0028]2.ASO/RcP轉染肝星狀細胞
[0029]①鋪板
[0030]將大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)消化成單細胞懸液，稀釋到I X 105/ml的密度加入24孔板內，每孔0.5ml。放在37 °C培養箱培養24小時。
[0031]②載體-核酸復合物的制備
[0032]配制濃度均為0.25mg/ml的羅丹明修飾I型膠原蛋白的反義核酸(Rho-ASO)，PEI和RcP溶液。將Rho-ASO分別和PEI，RcP等體積混合，漩渦振蕩5分鐘，室溫靜置20分鐘，得到 Rho-ASO/PEI 和 Rho-ASO/RcP 復合物。
[0033]③轉染
[0034]將HSC-T6原培養液換為含有視黃醇結合蛋白(RBP)的opti_MEM培養液，再分別加入Rho-ASO/PEI和Rho-ASO/RcP兩種復合物。放在37°C培養箱培養。
[0035]④熒光顯微鏡觀察
[0036]轉染4-6小時后，將細胞用I XPBS清洗2次一4%多聚甲醛固定15分鐘一I XPBS清洗3次一DAPI染細胞核5分鐘一I XPBS清洗2次。置于熒光顯微鏡下使用56Inm激發光觀察細胞轉染情況。
[0037]結果表明(圖3)，和PEI相比，RcP對肝星狀細胞有較高的轉染效率。
[0038]3.ASO/RcP用于四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型的治療
[0039]配制含25%四氯化碳(CCl4)的橄欖油溶液。將4-6周齡ICR雄性小鼠隨機分為三組，每組6只。模型組按4yl/g體重腹腔注射CCl4溶液，對照組小鼠按體重注射相同體積的橄欖油。每周兩次，持續注射4周。對于治療組小鼠，在造模的同時通過尾靜脈注射ASO/RcP復合物，每周一次，每次100 μ I。
[0040]結果表明(圖4)，和對照組相比，模型組I型膠原蛋白mRNA相對表達量顯著升高(*:Ρ < 0.01)，說明四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型造模成功；和模型組相比，治療組I型膠原蛋白mRNA相對表達量顯著降低(#..Ρ< 0.01)，說明ASO/RcP對肝纖維化有很好的治療效果。
[0041]4.ASO/RcP用于四氯化碳誘導的小鼠肝硬化模型的治療
[0042]配制含25%四氯化碳(CCl4)的橄欖油溶液。將4-6周齡ICR雄性小鼠隨機分為三組，每組6只。模型組按4yl/g體重腹腔注射CCl4溶液，對照組小鼠按體重注射相同體積的橄欖油。每周兩次，持續注射10周。對于治療組小鼠，在造模的同時通過尾靜脈注射ASO/RcP復合物，每周一次，每次100 μ I。
[0043]結果表明(圖5)，和對照組相比，模型組I型膠原蛋白mRNA相對表達量顯著升高(*:Ρ < 0.001)，說明四氯化碳誘導的小鼠肝硬化模型造模成功；和模型組相比，治療組I型膠原蛋白HiRNA相對表達量顯著降低(#..Ρ <0.001)，說明ASO/RcP對肝硬化有很好的治療效果。
【權利要求】
1.一種肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體，其特征是:將肝星狀細胞靶向配體偶聯到陽離子載體上，所述靶向配體是視黃醇(Retinol)分子，所述陽離子載體是聚乙烯亞胺(PEI)。
2.根據權利要求1所述的肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體，其特征在于:聚乙烯亞胺(PEI)是線型的或支化的，是各種分子量的聚乙烯亞胺(PEI):從小于600道爾頓到大于800，000道爾頓。
3.根據權利要求1所述的肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體，其特征在于:視黃醇(Retinol)和聚乙烯亞胺(PEI)的質量比為1:0.5-1:20。
4.根據權利要求1所述的肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體的制備方法，其特征在于由以下步驟構成: (1).取0.56g N，N-羰基二咪唑(⑶I)溶于20ml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后加入Ig視黃醇，在避光條件下30°C恒溫攪拌24小時； (2).再加入4.32g聚乙烯亞胺(PEI)，繼續攪拌24小時； (3).將上述溶液轉入截留分子量為12000-14000的透析袋中，雙蒸水透析4天； (4).將透析液放到_80°C超低溫冰箱2-3小時，在冷凍干燥機上冷凍干燥48小時后得到藥物輸送載體材料。
5.權利要求1所述的肝星狀細胞靶向的基因藥物輸送載體在基因藥物治療肝纖維化或肝硬化中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104174034SQ201410413637
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月20日 優先權日:2014年8月20日
【發明者】張峻峰, 朱倩, 董磊 申請人:南京大學