Klf9基因在抑制肝癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了KLF9基因在抑制肝癌中的應用。具體地，本發明涉及KLF9(Krüppel-like factor9，KLF9)基因、蛋白或其促進劑的用途，用于制備p53的促效劑；和/或用于制備治療肝癌的藥物組合物。此外，本發明還提供了來源于KLF9的ZNF結構域，其作為KLF9蛋白的活性片段，在抑制肝癌中起到重要作用。
【專利說明】KLF9基因在抑制肝癌中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤治療領域。具體地，本發明涉及KLF9基因在促進p53表達和/或 活性，從而抑制肝癌中的應用。

【背景技術】
[0002] 隨著近年來分子生物學技術的發展及人類基因譜的不斷完善，人們對肝癌發病原 因及發病機制又有了新的認識，即肝癌相關的癌基因的激活及抑癌基因的失活與突變是導 致肝細胞癌變的根本原因。細胞內的癌基因與抑癌基因對細胞的增殖與分化起著正負調節 作用。所以說，在分子水平上與肝癌相關癌基因與抑癌基因的變化是肝癌發生的根本原因。
[0003] 與此同時，人們提出了一個全新的概念：基因治療，為癌癥的治療帶來了新的希 望。所謂癌癥的基因治療就是指以遺傳學技術為基礎，將克隆的正?；蛐蛄袑朐摶?缺陷的患者體內，使導入的基因發揮作用而糾正基因缺陷，或設計出已經突變的癌基因的 反義序列導入患者體內，阻止突變的癌基因發揮其效應。癌癥的基因治療最終目的是通過 不同途徑殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長使腫瘤消退。所以，癌癥的基因治療是對腫瘤細胞惡 變過程的逆轉，對正常細胞并沒有影響。
[0004] 目前，抑癌基因的產物主要包括：①轉錄調節因子，如Rb、P53 ;②負調控轉錄因 子，如WT ;③周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI)，如pl5、pl6、p21 ;④信號通路的抑制因 子，如ras GTP酶活化蛋白（NF-1)，磷脂酶（PTEN);⑥DNA修復因子，如BRCAUBRCA2。⑥ 與發育和干細胞增殖相關的信號途徑組分，如：APC、Axin等。
[0005] 此外，隨著越來越多的潛在抑癌基因被發現，在癌癥與抑癌平衡中龐大、復雜的細 胞通路也逐漸暴露。人們甚至發現，在相似的細胞通路中，同一個基因所起到作用也不盡相 同。因此，本領域迫切需要研究對各種腫瘤尤其是肝癌具有特異性的影響基因，并明確其作 用機制，以開發更有效的基因治療藥物。


【發明內容】

[0006] 本發明提供了 KLF9基因及其表達產物在促進p53表達和或活性從而抑制肝癌中 的應用。
[0007] 本發明的第一方面，提供了一種KLF9(Kriippel-like factor9，KLF9)基因、蛋白或 其促進劑的用途，用于制備P53的促效劑；和/或
[0008] 用于制備預防和/或治療肝癌的藥物組合物。
[0009] 在另一優選例中，所述的KLF9基因核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示，其編碼的蛋 白序列如SEQ ID NO. : 2所示。
[0010] 在另一優選例中，所述的KLF9基因來自哺乳動物，較佳地，來自嚙齒動物（大鼠、 小鼠）和靈長動物（例如人），更佳地，來自人。
[0011] 在另一優選例中，所述的促效劑包括P53表達促進劑和/或p53蛋白活性穩定劑。
[0012] 在另一優選例中，所述促效劑用于促進p53的表達和/或促進p53蛋白的穩定。
[0013] 在另一優選例中，所述的KLF9蛋白包括全長KLF9蛋白、成熟的KLF9蛋白、KLF9的 與DNA結合的結構域ZNF、或含所述ZNF結構域的KLF9活性片段。
[0014] 在另一優選例中，所述來源于KLF9的ZNF結構域序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0015] 在另一優選例中，編碼所述來源于KLF9的ZNF結構域的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0016] 在另一優選例中，所述的促進劑包括KLF9基因表達產物、促進型miRNA、促進型轉 錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0017] 在另一優選例中，所述的藥物組合物包括（i)KLF9基因、蛋白或其促進劑；和（ii) 藥學上可接受的載體。
[0018] 本發明第二方面，提供了一種篩選候選化合物的方法，所述化合物可作為KLF9促 進劑，包括步驟：
[0019] (a)在測試組中，向細胞培養體系中加入待測化合物，并測定p53和KLF9的表達和 /或活性；在對照組中，向同樣的培養體系中不加入待測化合物，并測定P53和KLF9的表達 和/或活性；其中所述待測化合物不是KLF9蛋白；
[0020] 其中，如果對照組中p53的表達和/或活性大于對照組，且對照組中KLF9的表達 和/或活性大于對照組，則說明該候選化合物為KLF9促進劑。
[0021] 在另一優選例中，還包括步驟：
[0022] (b)對步驟（a)中獲得的候選化合物進一步測試其抑制肝癌的效果。
[0023] 本發明第三方面，提供了一種KLF9的ZNF結構域的肽序列或核苷酸序列的用途， 其特征在于，用于制備P53的促效劑；和/或
[0024] 用于制備預防和/或治療肝癌的藥物組合物。
[0025] 在另一優選例中，所述ZNF結構域的肽序列如SEQ ID NO. : 3所示；和/或
[0026] 所述ZNF結構域的核苷酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0027] 本發明第四方面，同了一種KLF9基因或其蛋白的用途，用于制備診斷肝癌的試劑 或試劑盒。
[0028] 在另一優選例中，所述的試劑包括KLF9的特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯 片。
[0029] 在另一優選例中，所述的檢測KLF9蛋白或mRNA的檢測試劑包括：
[0030] (a).抗KLF9蛋白的特異性抗體；和/或
[0031] (b) ·特異性擴增KLF9的mRNA或cDNA的特異性引物。
[0032] 在另一優選例中，所述的檢測包括酶聯免疫反應法（ELISA法）檢測或時間分辨免 疫熒光法（TRFIA法）檢測。
[0033] 在另一優選例中，所述的KLF9蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
[0034] 在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組：生色團、化學發光基團、熒光團、同位 素或酶。
[0035] 在另一優選例中，所述KLF9的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0036] 在另一優選例中，所述檢測是測定組織樣品、血液樣品、血清樣品或體液樣品。
[0037] 在另一優選例中，所述的組織樣品包括肝癌組織和癌旁組織。
[0038] 本發明第五方面，提供了一種診斷肝癌的試劑或試劑盒，所述試劑盒包括一容器， 所述容器中含有檢測KLF9蛋白或mRNA的檢測試劑；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書 注明所述試劑盒用于檢測肝癌。
[0039] 在另一優選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內容：
[0040] 當檢測對象的肝癌細胞或組織中KLF9表達量El與正常肝細胞或組織的KLF9表 達量E2之比< 2,則提示該檢測對象肝癌的幾率高于普通人群。
[0041] 在另一優選例中，所述的E2是正常人群的正常肝細胞或組織的KLF9表達量。
[0042] 在另一優選例中，所述的正常肝細胞或組織包括癌旁的肝細胞或組織。
[0043] 在另一優選例中，所述的表達量是相對于對照基因（如β -肌動蛋白）的相對表 達量。
[0044] 本發明第六方面，提供了一種體外非治療性的促進ρ53表達和/或活性；和/或抑 制肝癌的方法，其特征在于，向培養體系中加入KLF9基因、蛋白或其促進劑，從而促進ρ53 表達和/或活性；和/或抑制肝癌。
[0045] 在另一優選例中，所述的促進劑包括KLF9基因表達產物、促進型miRNA、促進型轉 錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0046] 在另一優選例中，所述的KLF9基因核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示，其編碼的蛋 白序列如SEQ ID NO. : 2所示。
[0047] 在另一優選例中，所述的KLF9蛋白為KLF9的ZNF結構域。
[0048] 本發明第七方面，提供了一種治療肝癌的方法，向需要的對象施用安全有效量的 KLF9基因、蛋白或其促進劑。
[0049] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖IA-D分別顯示了 KLFIII家族成員（KLF9, KLF10, KLF11，KLF13)在肝癌及癌旁 組織的表達情況。圖1A，P〈0. 01 ;其余圖1B-D，P〈0. 05。
[0051] 其中，圖IA顯示了 15對樣本中有10對癌組織中KLF9的表達低于其相對應癌旁組 織2倍以上（P〈0. 01)，有4對高于其癌旁組織0. 5至1. 5倍，1對無明顯差異；圖IB顯示了 15對樣本中KLFlO的表達有3對癌組織中高于癌旁組織1. 5至7倍（P〈0. 05)，有4對癌組 織中表達低于癌旁組織0.5倍（P〈0. 05)，另外8個樣本間無明顯差異；圖IC顯示了 KLFll 的表達情況同KLF9有所相似，15對樣本中有12對癌組織低于癌旁組織（P〈0. 05);圖ID顯 示了 KLF13的表達情況同KLFlO相似，15對樣本中有7對癌組織高于癌旁組織（P〈0. 05)。
[0052] 圖2顯示了 qRT-PCR結果，KLF9在人肝癌細胞系及永生化肝細胞系THLE-2中的 表達情況，結果說明KLF9在肝癌細胞系中低表達 ：。
[0053] 圖3顯示了 KLF9過表達抑制人肝腫瘤細胞SK-H印1和H印G2的體外增殖情況，其 中，圖3A和圖3B顯示了 Western blotting檢測顯示Dox誘導后，細胞中KLF9 (帶Flag標 簽）的表達情況；圖3C和圖3D中，MTT結果顯示Dox誘導過表達KLF9的SK-H印1和H印G2 細胞系及對照組（CTL)細胞的生長狀況。
[0054] 圖4顯示了 DOX誘導10天后，克隆形成實驗檢測誘導KLF9過表達組及對照組中 細胞的克隆形成情況。由圖可見，KLF9抑制肝癌細胞SK-H印1和H印G2的克隆形成。
[0055] 圖5顯示了 DOX誘導24小時后，PI染色檢測誘導KLF9過表達組及對照組細胞的 細胞周期的影響。
[0056] 圖6A顯示了在SK-H印1細胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測DOX誘導KLF9表達 組及對照組的細胞凋亡情況；圖6B顯示了在SK-H印1細胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測 DOX誘導KLF9表達組及對照組中的細胞凋亡比率的統計圖；圖6C顯示了在H印G2細胞中， Annexin V/7-AAD染色檢測DOX誘導KLF9表達組及對照組的細胞凋亡情況。圖6D顯示了 在H印G2細胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測DOX誘導KLF9表達組及對照組中的細胞凋亡 比率的統計圖。結果顯示，KLF9過表達誘導人肝腫瘤細胞凋亡。
[0057] 圖 7 顯示了 Sk-H印l-Tet-〇n-KLF9 以及 H印G2-Tet-〇n-KLF9 細胞經 DOX 誘導 KLF9 表達不同時間后，Western blotting檢測p53的表達情況。結果顯示KLF9過表達導致人 肝癌細胞中P53蛋白水平增高。
[0058] 圖 8 顯示了 Sk-H印l-Tet-〇n-KLF9 以及 H印G2-Tet-〇n-KLF9 細胞經 DOX 處理 24 小 時后，再用轉錄抑制劑CHX處理不同時間，Western blotting檢測p53、p21、KLF9 (帶Flag 標簽）的表達情況。結果顯示KLF9穩定了 p53的表達。
[0059] 圖9顯示了通過免疫共沉淀檢測KLF9與p53的相互結合關系。
[0060] 圖10顯示了通過細胞免疫熒光染色檢測KLF9及P53在細胞中的定位情況?？梢?KLF9與p53在細胞核內共表達。
[0061] 圖 11 顯不了 siRNA 干擾 p53 表達后，Western blotting 檢測 p53、p21、KLF9 (帶 Flag)的表達情況?？梢妔iRNA介導的p53表達的抑制
[0062] 圖12 siRNA干擾p53表達后，DOX誘導KLF9表達24小時，qRT-PCR檢測p53及 p21的mRNA的表達情況。
[0063] 圖13顯示了 siRNA干擾p53表達后，DOX誘導KLF9表達24小時，Annexin V/7-AAD 檢測過表達KLF9及對照組的細胞凋亡情況?？梢妏53抑制能夠部分逆轉KLF9過表達誘導 的細胞凋亡。
[0064] 圖14顯示了 DOX誘導KLF9表達不同時間后，Annexin V/7-AAD檢測過表達KLF9 及對照組的H印3B細胞的凋亡情況。可見KLF9過表達未能有效誘導p53缺陷的H印3B細 胞的凋亡。
[0065] 圖15顯示了不同p53基因型的肝癌細胞對KLF9誘導的細胞凋亡具不同反應性： DOX誘導KLF9表達不同時間后，Annexin V/7-AAD檢測過表達KLF9及對照組的各肝癌細胞 的凋亡情況。
[0066] 圖16顯示了 KLF9結構域刪節示意圖。
[0067] 圖17顯示了野生型KLF9及其SID、ZNF突變體的表達驗證：Western blotting檢 測轉有 KLF9-flag wt、KLF9-flag Λ SID、KLF9-flag Λ ZNF 的細胞中各 KLF9 突變體的表達 情況。
[0068] 圖18顯示了 DOX處理10天后，過表達各KLF9突變體的肝癌細胞的細胞克隆形成 情況?？梢奒LF9缺失了 SID結構域仍可抑制細胞增殖，而缺失了 ZNF結構域則失去了抑 制細胞增殖的功能。
[0069] 圖 19Α 顯示了在 SK-H印1 細胞中，DOX 誘導 KLF9wt, KLF9 Λ SID and Λ ZNF 表達后，Annexin V/7-AAD染色檢測各組細胞的凋亡情況；圖19B顯示了 DOX誘導 KLF9wt, KLF9ASID andAZNF 表達不同時間后，Annexin V/7-AAD 染色檢測的各組 SK-Ifepl 細胞的凋亡細胞比率統計圖；圖19C顯示了在H印G2細胞中，DOX誘導KLF9wt，KLF9 Λ SID and Λ ZNF表達后，Annexin V/7-AAD染色檢測各組細胞的凋亡情況；圖19D顯示了 DOX誘 導KLF9wt、KLF9 Λ SID及KLF9 Λ ZNF表達不同時間后，Annexin V/7-AAD染色檢測的各組 !fepG2細胞的凋亡細胞比率統計圖。由此可見，KLF9誘導人肝癌細胞凋亡依賴ZNF功能域。
[0070] 圖20A顯示了在SK-H印1細胞中，DOX誘導表達不同時間后，qRT-PCR檢測Noxa的 mRNA表達情況；圖20B顯示了在SK-H印1細胞中，DOX誘導表達不同時間后，qRT-PCR檢測 Puma的mRNA表達情況；圖20C顯示了在H印G2細胞中，DOX誘導表達不同時間后，qRT-PCR 檢測Noxa的mRNA表達情況；圖20D顯示了在HepG2細胞中，DOX誘導表達不同時間后， qRT-PCR檢測Puma的mRNA表達情況。由此可見，KLF9誘導noxa和puma的表達依賴其ZNF 功能域。
[0071] 圖21顯示了 DOX誘導表達24小時后,Western blotting檢測p53以及p21的表 達情況?？梢姡琄LF9提高p53和p21蛋白水平依賴其ZNF功能域。
[0072] 圖22A顯示了 DOX誘導KLF9及各突變體表達組及對照組的成瘤情況。第一組左側 為CTL，右側為KLF9-WT ;第二組左側為Λ ZNF，右側為Λ SID ;圖22B顯示了 DOX誘導KLF9 及各突變體表達組及對照組所形成的腫瘤大小統計圖。可見，KLF9可抑制人肝癌細胞在體 內的生長。
[0073] 圖23顯示了 Tet-on-control-SK-Hepl及對照細胞皮下荷瘤，當所形成的腫瘤達 至Ij 120-150mm3大小后，分組給DOX誘導KLF9表達或給水作為對照。其中，圖23A顯示了給 DOX或給水后，各組腫瘤的生長狀況統計。圖23B顯示了給DOX或給水18天后，各組小鼠的 成瘤情況。結果表明KLF9過表達抑制已發生腫瘤的生長。

【具體實施方式】
[0074] 本發明人經過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次意外地發現，對于一種在多 種組織中廣泛存在的蛋白即KLF9蛋白，雖然該蛋白在不同組織中呈現了高低不同的表達， 但在肝癌細胞中KLF9卻呈現出肝癌相關的特異性低表達。試驗證明，通過特異性提高KLF9 蛋白的表達或其活性，能夠有效抑制肝癌細胞的生長或誘導肝癌細胞的凋亡。此外，本發明 人還發現，KLF9蛋白可通過提高p53的表達或增強p53蛋白的穩定性，從而達到抑制肝癌 的效果。在此基礎上，完成了本發明。
[0075] KLF9基因和蛋白
[0076] Kriippel-Iike因子（KLFs)是一組與真核細胞轉錄調控密切相關的鋅指蛋白。 KLFs有17個家族成員，其羧基末端高度保守，含有3個串聯的Cys2/His2鋅指狀結構，用 于結合DNA ;其氨基末端在不同的家族成員間存在較大差異，主要是通過結合輔助因子發 揮轉錄調控作用。KLFs不同成員表達具組織分布特異性和分化、發育上的階段性；KLFs調 控多種富含GC或CACCC啟動子的基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡的生理過程，與心血 管疾病、代謝異常疾病、腫瘤等疾病的發生、發展密切相關。
[0077] KLF9是KLFIII類亞家族成員，最初被命名為基本轉錄元件結合蛋白I(BTEBl)，在 不同細胞內對靶基因發揮抑制或激活等不同功能。已有報道表明，KLF9在腫瘤中出現異常 表達，如在腸癌、神經膠質瘤中呈現低表達；但在不同種類的子宮內膜癌中卻呈現高低各不 相同的表達。
[0078] 可用于本發明的KLF9蛋白序列包括各種來源和物種的KLF9,并且包括野生型、突 變型的KLF9,或其活性片段。一種代表性的人KLF9蛋白如SEQ ID NO. : 2所示，編碼該蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。（請給出具體序列或genbank登錄號）
[0079] ZNF結構域
[0080] KLFIII家族成員在結構上具有多個相似的結構域。包括羧基端的鋅指狀結構 (Zinc finger domain, ZNF)，是主要的 DNA 結合結構域（DNA Binding Domain)、還包括氨基 端包含了一個與SIN3A復合體相互作用的結構域（SIN3A Interaction Domain, SID)。
[0081] 本發明通過大量實驗，對KLF9各結構域依次進行缺失，并最終發現了 KLF9的ZNF 結構域對KLF9抑制肝癌細胞生長、誘導肝癌細胞凋亡起到決定性作用，可見ZNF結構域為 KLF9蛋白的抑癌活性片段。
[0082] 本發明中，所述ZNF結構域的蛋白序列如SEQ ID NO. :3所示，編碼該蛋白的核苷 酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0083] ZNF結構域蛋白或其核酸序列的獲得同KLF9基因或其核苷酸的獲得方法。
[0084] p53 基因
[0085] 人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質，命名為P53。p53基 因的失活對腫瘤形成起重要作用。由這種基因編碼的蛋白質（protein)是一種轉錄因子 (transcriptional factor)，其控制著細胞周期的啟動。許多有關細胞健康的信號向p53 蛋白發送。關于是否開始細胞分裂就由這個蛋白決定。如果這個細胞受損，又不能得到修 復，則p53蛋白將參與啟動過程,使這個細胞在細胞凋亡（apoptosis)中死去。
[0086] 人類P53基因定位于17P13. 1，鼠 P53定位于11號染色體，并在14號染色體上發 現無功能的假基因。
[0087] 如本文所用，術語"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來（如果是天然的物 質，原始環境即是天然環境）。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化 的。
[0088] 如本文所用，"分離的KLF9蛋白或多肽"是指KLF9蛋白基本上不含天然與其相關 的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化 KLF9蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。在本發明中， KLF9蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0089] 本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0090] 本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0091] 編碼KLF9的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的 編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及非編 碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0092] 本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或 非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
[0093] 本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個 核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術（如PCR)以確定 和/或分離編碼KLF9蛋白的多核苷酸。
[0094] 本發明的人KLF9核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工 合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序 列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫 作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再 將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0095] 一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。 [0096] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0097] 應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用于獲得本發明的基因。用于PCR的引 物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0098] 通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組 的KLF9蛋白。一般來說有以下步驟：
[0099] (1).用本發明的編碼人KLF9蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0100] (2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；
[0101] (3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0102] 本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人KLF9編碼DNA序列和合適的轉錄 /翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技 術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達 載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0103] 此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
[0104] 包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0105] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞 如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、C0S、或293細胞的動物細胞等。
[0106] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的 方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規機械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0107] 獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用 的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法（如溫度轉換或化學誘導） 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0108] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規的復性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結 合。
[0109] 促進劑和藥物組合物
[0110] 利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與KLF9蛋白發生相互作用的 物質，尤其是促進劑等。
[0111] 本發明KLF9蛋白的促進劑，當在治療上進行施用（給藥）時，可促進KLF9蛋白的 表達和/或活性，進而促進P53的表達和/或活性，從而抑制肝癌。在另一優選例中，所述 的KLF9促進劑包括的KLF9基因表達產物、促進型miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶 向小分子化合物。
[0112] 通常，可將這些促進劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括（但并不限 于）：瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0113] 本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明KLF9蛋白或其促 進劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡 萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制 備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶 液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0114] 篩選藥物的方法
[0115] 本發明KLF9基因或其蛋白在肝癌抑制中對P53的依賴，可被用于篩選藥物。一種 優選的篩選方法是用于篩選KLF9促進劑的候選化合物的方法包括步驟：
[0116] (a)在測試組中，向細胞培養體系中加入待測化合物，并測定p53的表達和/或活 性；在對照組中，向同樣的培養體系中不加入待測化合物，并測定P53的表達和/或活性；
[0117] 其中，如果對照組中p53的表達和/或活性大于對照組，則說明該候選化合物為 KLF9的促進劑。
[0118] 在另一優選例中，所述的方法還包括步驟：
[0119] (b)對步驟（a)中獲得的候選化合物進一步測試其抑制肝癌的效果，若測試化合 物對肝癌有顯著的抑制效果，則說明該化合物為KLF9促進劑。
[0120] 通用方法
[0121] 材料
[0122] 人肝癌細胞株 H印G2、H印3B、PLC/PRF/5、SK-H印 1、SUN387 以及 THLE-2 人正 常肝細胞株（CRL-2706)來自ATCC，人肝癌細胞株HuH-7購自日本Riken，人肝癌細胞 株SMMC-7721購自中科院細胞庫，人肝癌細胞株HCC-LM3、MHC-97H購自中山醫院肝癌研 究所。pTRIPZ Tet-on表達質粒來自Thermo公司。細胞培養液Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、DMEM:F12(l:l)以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)購自 美國 HyClone 公司。噻唑蘭（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT)、7_ 氨基放 線菌素0(7-4111；[1103(31:;[1101115^;[110,7-440)、碘化丙陡（?1'(^1(1;[1111110(11(16，？1)、強力霉素 (doxycycline，Dox)購自美國sigma公司。質粒小抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根 生化科技（北京）公司；LipofetAMINE2000購自美國Invitrogen公司；總RNA提取試劑 TRIzol、限制性內切酶、T4連接酶、高保真酶PrimeStar?、RNA反轉試劑盒PrimeScript? RT Kit 和 SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒購自大連 TaKaRa。APC(allophycocyanin)_Annexin V (細胞凋亡檢測試劑）抗體購于美國BD公司。兔抗人p53單克隆抗體、鼠抗人p21/CDKNlA 單克隆抗體、鼠抗人ct-Tubulin單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體購自美國Epitomics公司；FLAG標簽抗體購于美國 Sigma公司；兔抗人KLF9多克隆抗體購自美國Abcam公司。肝癌組織樣本來源于江蘇省啟 東市肝癌防治研究所，用于RNA的提取以及基因表達檢測。本實驗所用BALB/c雄性裸鼠，6 周齡，體重20g左右，皆購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于華東師范大學動物 房。
[0123] Tet調控KLF9及其突變體表達的載體構建
[0124] KLF9全長cDNA通過以下引物PCR得到：
[0125] Forword:gacgatgacaagatgtccgcggccgcctac(SEQ ID NO. :5)
[0126] Reverse:tcacaaagcgttggccagcgcctttttc(SEQ ID NO. :6)
[0127] 在進一步的PCR中，將Flag序列引入KLF9編碼序列的N短，再將帶有Flag標簽 的KLF9全長cDNA以及兩個不同結構域缺失的KLF9突變體cDNA克隆入Tet調控的載體 pTRIPZ-puro中。所用引物分別如下所示：
[0128] pTRIPZ-KLF9-flag-wt
[0129] Forword(AgeI-Flag):
[0130] ataccggtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaag(SEQ ID NO. :7)
[0131] Reverse (EcoRI):gcgaattctcacaaagcgttggccagcgc(SEQ ID NO. :8)
[0132] pTRIPZ-KLF9-flag-SID deletion ：
[0133] Forward (AgeI) :tacaaggacgacgatgacaagatggagcggctgcgactacctg(SEQ ID NO. :9)
[0134] Reverse (EcoRI):gcgaattctcacaaagcgttggccagcgc(SEQ ID NO. :10)
[0135] pTRIPZ-KLF9-flag-ZNF deletion ：
[0136] Forword (AgeI) :ataccggtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaag(SEQ ID NO. :11)
[0137] Reverse (EcoRI);gcgaattctcacctcttttcggaggcgtg(SEQ ID NO. :12)
[0138] MTT法檢測細胞增殖
[0139] 按常規MTT法檢測細胞增殖情況，利用分光光度計于540nm波長處測定吸光度（D) 值。
[0140] 細胞凋亡檢測
[0141] 按照Annexin V染色試劑盒（BD Biosciences)的說明書進行細胞收集及染色，然 后上流式細胞儀（FACSCalibur?流式細胞儀，Becton Dickinson)檢測細胞凋亡。
[0142] 細胞周期檢測
[0143] 按照常規的PI染色檢測細胞周期的方法處理細胞及PI染色，然后上流式細胞儀 檢測細胞檢測周期。
[0144] qRT-PCR檢測目的基因 mRNA的表達
[0145] 利用TRIzol試劑提取目的細胞或組織樣本總RNA，逆轉錄mRNA得到cDNA。所用 引物如下表（引物均由上海英駿生物技術有限公司合成）：

【權利要求】
1. 一種Kriippel樣因子9 (Kriippel-likefactor9，KLF9)基因、蛋白或其促進劑的用 途，其特征在于，用于制備P53的促效劑；和/或 用于制備預防和/或治療肝癌的藥物組合物。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促效劑包括p53表達促進劑；和/或 p53蛋白活性穩定劑。
3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的KLF9蛋白包括全長KLF9蛋白、成熟 的KLF9蛋白、KLF9的與DNA結合的結構域ZNF、或含所述ZNF結構域的KLF9活性片段。
4. 如權利要求1所述用途，其特征在于，所述的促進劑包括KLF9基因表達產物、促進型 miRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
5. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括（i)KLF9基因、蛋白 或其促進劑；和（ii)藥學上可接受的載體。
6. -種篩選候選化合物的方法，所述化合物可作為KLF9促進劑，其特征在于，包括步 驟： (a) 在測試組中，向細胞培養體系中加入待測化合物，并測定p53和KLF9的表達和/或 活性；在對照組中，向同樣的培養體系中不加入待測化合物，并測定P53和KLF9的表達和/ 或活性；其中所述待測化合物不是KLF9蛋白； 其中，如果對照組中p53的表達和/或活性大于對照組，且對照組中KLF9的表達和/ 或活性大于對照組，則說明該候選化合物為KLF9促進劑。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，還包括步驟： (b) 對步驟（a)中獲得的候選化合物進一步測試其抑制肝癌的效果。
8. -種KLF9的ZNF結構域的肽序列或核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制備p53 的促效劑；和/或 用于制備預防和/或治療肝癌的藥物組合物。
9. 一種KLF9基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制備診斷肝癌的試劑或試劑盒。
10. -種診斷肝癌的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一容器，所述容器中 含有檢測KLF9蛋白或mRNA的檢測試劑；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試 劑盒用于檢測肝癌。
11. 一種體外非治療性的促進P53表達和/或活性；和/或抑制肝癌的方法，其特征在 于，向培養體系中加入KLF9基因、蛋白或其促進劑，從而促進p53表達和/或活性；和/或 抑制肝癌。
【文檔編號】A61K48/00GK104511028SQ201310465246
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年10月8日 優先權日:2013年10月8日
【發明者】劉永忠, 楊兆娟, 王博石, 劉昀, 孫佳彬 申請人:上海市腫瘤研究所