miR-1914*和miR-1915的用途
【專利摘要】本發明涉及miR-1914*和/或miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物的應用，以及其在制備具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋亡、增值功能的藥物中的應用。本發明中的miR-1914*和miR-1915是存在于血漿中，可以檢測，并且它們在大腸癌耐藥患者血漿中成下調趨勢，其具有相對的組織特異性，既與大腸癌一線化療耐藥有關，同時還影響患者預后。miR-1914*和miR-1915單獨使用或聯合使用在大腸癌一線化療耐藥中起較為重要的作用，尤其是聯合使用效果更好。
【專利說明】miR-1914* 和 miR-1915 的用途

【技術領域】
[0001] 本發明設計涉及一種microRNA的用途，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 大腸癌（colorectal cancer, CRC)為結腸癌和直腸癌的總稱，大腸癌是指大腸粘 膜上皮在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的惡性病變，預后不良，死亡率較高。全世 界范圍內大腸癌的發病率男性處于惡性腫瘤的第三位。據國際癌癥研究組織（IARc)提供 的數據顯示，亞洲地區，東亞死亡率為120. 1/100, 000。我國隨著生活水平提高，飲食習慣改 變，總體發病率也呈現上升趨勢。上海地區近年來大腸癌發生率每年上升4. 2%，由原來占惡 性腫瘤的第7位上升至第3位。研究表明，腫瘤的發展程度是影響生存期的重要因素，隨著 腫瘤分期的不斷進展，患者的5年生存率大幅的下降。然而，在我國僅有10%的患者初診時 處于Tl期，大部分患者就診時已經處于進展期，故其5年生存率徘徊在20%-50%之間。目 前在我國臨床大腸癌患者T3、T4晚期期患者較多，預后更差，因此尤其需要引起我國臨床 腫瘤醫生的注意。
[0003] 大腸癌治療主要為以手術+化療為主的綜合性治療。而手術患者中約50%的患者 在術后5年內出現復發或轉移。術前新輔助化療可降低大腸癌分期、改善術式選擇、提高近 期療效；術后化療可抑制大腸癌復發、治療腫瘤轉移。結直腸癌輔助化療始于20世紀50年 代，經歷探索、爭論近30年，直至1988年Buyse等發表了第一個結直腸癌輔助化療有效的 薈萃（meta)分析報告，大家對結直腸癌輔助化療的有效性才達成共識。10多年來，眾多學 者致力于結直腸癌輔助化療的新藥開發和新方案設計，其中較為常用的一線化療為XELOX ，F0LF0X方案。可望降低分期，創造手術機會，提高術后生存率。化療療效取決于腫瘤對化 療藥物的敏感程度，這由腫瘤自身的生物學特性決定。究其原因可能是由于腫瘤的多藥耐 藥。隨著近年來對結直腸癌多藥耐藥研究，給我們展示了結直腸癌治療的新突破點，對于結 直腸癌多藥耐藥逆轉劑的開發應用，將使結直腸癌的治療出現質的飛躍。
[0004] 腫瘤的發生發展與細胞的分子網絡異常有密切的關系，細胞從癌變到腫瘤的快速 生長、侵襲和轉移是一個多因素作用、多基因參與，經過多階段變化累積起來的、極其復雜 的病變過程。通過研究基因的改變以尋找腫瘤的發病原因和診斷及其預后方法是研究腫瘤 的重要途徑，而最近幾年，作為非編碼的microRNA對癌癥的研究已成為焦點。
[0005] microRNAs在1993年首次被發現，長度18 - 25nt，具有較好的穩定性和易于檢 測的特點。microRNA在發育，細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞徑中都起了重要的調節作 用。據推測microRNA可能調控至少30%的基因的表達況。microRNA在進化上高度保守，它 們廣泛存在于植物、線蟲以及人類的細胞中它們能有效地抑制相關蛋白質的合成，導致靶 mRNA的降解，或者以其他形式調節機制來抑制靶基因的表達，產生基因沉默。microRNA主 要通過和靶基因 mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。microRNA 組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性。最近的研究發現，microRNA表達 與多癌癥相關，大約50%得到注解的microRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性點 (fragile site)，這說明microRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用，這些microRNAs 所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。目前在許多腫瘤中已經發現了比較特異性的 microRNAs。正因為這些microRNA和臨床結果、癌癥預后密切相關，它們有望成為腫瘤診 斷、靶向治療及預后預測的新的生物標記物。
[0006] 目前microRNA在腫瘤發生和發展過程中的生物學作用的研究已取得長足進步， 但是還有許多問題有待于進一步解決，許多研究目前尚處于初步階段。當前microRNAs已 成為腫瘤研究中的又一個熱點吸引了眾多學者的關注。既往對microRNAs的研究主要集 中于它們在細胞內的活動。2008年，Mitchell等通過分離健康人血漿中的18?24個 核苷酸的RNA，并發現microRNAs能以一種非常穩定的形式存在于人體血楽中，以保護其 免受內源性RNase的降解。當前種種研究表明microRNA，瘤細胞基因表達模式與正常組織 有明顯的不同，可以通過檢測腫瘤病人循環RNA中的腫瘤特異的mRNA來進行腫瘤的診 斷。


【發明內容】

[0007] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種大腸癌化療藥物的耐藥性標示物。
[0008] 本發明為解決第一個技術問題提出的一種技術方案是:miR-1914*和/或 miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物的應用。
[0009] 本發明要解決的第二個技術問題是提供一種具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋亡、增 值功能的藥物。
[0010] 本發明為解決第二個技術問題提出的一種技術方案是:miR-1914*和/或 miR-1915、含有miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組載體、含有 miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組病毒或含有miR-1914*的編碼基 因和/或miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋亡、增 值功能的藥物中的應用。
[0011] 本發明要解決的第三個技術問題是提供一種新的大腸癌耐藥蛋白。
[0012] 本發明為解決第二個技術問題提出的一種技術方案是：NFIX作為大腸癌耐藥蛋 白的應用。
[0013] 本發明具有積極的效果： (1)本發明使用基因芯片技術篩選出miR-1914*和miR-1915兩個microRNA。經過多 組大量的驗證，表明miR-1914*和miR-1915是存在于血漿中，可以檢測，并且它們在大腸癌 耐藥患者血漿中成下調趨勢，從而可以作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物，可以制成試 劑盒，用于區分耐藥大腸癌與化療敏感大腸癌。
[0014] (2)本發明證實了 miR-1914*和miR-1915能夠影響耐藥大腸癌細胞的耐藥性， 使其對化療藥物敏感。且miR-1914*和miR-1915共同作用于耐藥大腸癌細胞要強于單個 microRNA對耐藥大腸癌細胞的影響。
[0015] (3)本發明證實了 miR-1914*和miR-1915在體內也能影響耐藥大腸癌的耐藥性， 且對大腸癌細胞的轉移，侵襲，凋亡，增值產生影響。從而miR-1914*和/或miR-1915,或者 含有miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組載體、重組病毒、重組病毒 載體可以制備具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋亡、增值功能的藥物。
[0016] (4)本發明證實了 miR-1914*和miR-1915具有相對的組織特異性，既與大腸癌一 線化療耐藥有關，同時還影響患者預后。miR-1914*和miR-1915單獨使用或聯合使用在大 腸癌一線化療耐藥中起較為重要的作用，尤其是聯合使用效果更好。
[0017] (5)本發明證實了 miR-1914*和miR-1915的共同靶基因為NFIX，miR-1914*和 miR-1915主要通過NFIX影響耐藥大腸癌中的耐藥蛋白，NFIX是新的大腸癌耐藥蛋白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是實施例1中的某個樣本取RNA水溶液行1%的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2是實施例1中血漿miR-1914*在四期大腸癌一線化療有效組、四期大腸癌一線化 療耐藥組中表達的散點圖； 圖3是實施例1中血漿miR-1915在四期大腸癌一線化療有效組、四期大腸癌一線化療 耐藥組中表達的散點圖； 圖4是實施例2中對質粒表達載體（pcDNA-copGFP vector)進行酶切線性化處理的原 理示意圖； 圖5是實施例2中對質粒表達載體（pGL3_promoter vector, E1761, Promega)進行 酶切線性化處理的原理示意圖； 圖6是實施例2中轉染miR-1914*和miR-1915后對耐藥細胞凋亡的各組比較圖表； 圖7是實施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在五組細胞組中的表達水平電 泳圖； 圖8是實施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在九組細胞組中的表達水平電 泳圖； 圖9是實施例3中各組瘤體的照片； 圖10是實施例3中各組裸鼠成瘤，注射藥物后腫瘤比較抑制率分析圖表； 圖11是實施例3中裸鼠瘤體內的NFIX、CyclinDl、VEGFC，P53、Survivin蛋白的改變 影響電泳圖。

【具體實施方式】
[0019] 下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可 以根據上述本
【發明內容】
對本發明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆 實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的 所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似 或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。統計結果中的表示P < 〇. 05, "**"表示 p < 0. 01。一個RNA前體的雙臂分別加工產生miRNA，則根據克隆實驗，在表達水平較低的 miRNA命名時在末尾加"
[0020] 實施例1 (人結直腸癌化療耐藥與敏感血漿microRNA的差異表達） 一、實驗準備。
[0021] I、研究對象。
[0022] 選取復旦大學附屬腫瘤醫院大腸外科進行原發病灶切除術IV期大腸癌患者，患者 術前未進行放化療，術后進行了規范標準的一線XELOX方案化療。結直腸癌組織參照全國 結直腸癌協作組結直腸癌診治規范以及AJCC/nCC的--!分期標準行診斷、分級和分 期。研究對象共100例，共分為2組：四期大腸癌耐藥組（n=57)、四期大腸癌有效組（n=43)， 具體情況如表1所示。
[0023] 表1大腸癌患者臨床資料

【權利要求】
1. miR-1914*作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物的應用。 2. miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物的應用。 3. miR-1914*和miR-1915聯合使用作為大腸癌化療藥物的耐藥性標示物的應用。 4. miR-1914*、含有miR-1914*的編碼基因的重組載體、含有miR-1914*的編碼基因 的重組病毒或含有miR-1914*的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉移、侵 襲、凋亡、增值功能的藥物中的應用。 5. miR-1915、含有miR-1915的編碼基因的重組載體、含有miR-1915的編碼基因的重 組病毒或含有miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋 亡、增值功能的藥物中的應用。 6. miR-1914*和miR-1915、含有miR-1914*的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重 組載體、含有miR-1914*的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重組病毒或含有miR-1914* 的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉移、侵襲、凋 亡、增值功能的藥物中的應用。 7. NFIX作為大腸癌耐藥蛋白的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104388541SQ201410562511
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】胡勁松, 蔡三軍 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院