在生理pH緩沖液中具有增強的溶解性和穩定性的胰高血糖素類似物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了具有改善的溶解性和/或半衰期而仍然保持胰高血糖素激動劑活性的修飾的胰高血糖素肽。通過將原始氨基酸替換為帶電的氨基酸和/或向肽的羧基末端添加帶電的氨基酸對胰高血糖素肽進行修飾。可以通過聚乙二醇化或通過添加選自SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23的羧基末端肽或通過這二者對修飾的胰高血糖素激動劑進行進一步修飾，以進一步增強胰高血糖素激動劑類似物的溶解性。
【專利說明】在生理pH緩沖液中具有增強的溶解性和穩定性的膜高血 糖轟類似物
[0001] 本申請是申請日為2009年6月16日、發明名稱為"在生理抑緩沖液中具有增強 的溶解性和穩定性的膜高血糖素類似物"、申請號為200980127066. 4的發明專利申請的分 案申請。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求下列優先權；2008年6月17日提交的美國臨時專利申請號 61/073, 193, 2008年7月3日提交的美國臨時專利申請號61/078, 165和2008年8月20日 提交的美國臨時專利申請號61/090, 415。每個申請的公開內容均明確地通過引用的方式全 文并入本文。

【技術領域】
[0004] 本發明涉及在生理抑緩沖液中具有增強的溶解性和穩定性的膜高血糖素類似 物。

【背景技術】
[0005] 前膜高血糖素原（pre-proglucagon)是158個氨基酸的前體多膚，其在不同組 織中被處理W形成多個不同的膜高血糖素原衍生的膚，包括膜高血糖素、膜高血糖素樣 膚-l(GLP-l)、膜高血糖素樣膚-2(GLP-1)和胃泌酸調節素（0XM)，它們參與眾多生理學功 能，包括葡萄糖體內平衡、膜島素分泌、胃排空和腸生長，W及食物攝入的調節。膜高血糖素 是29個氨基酸的膚，其對應于前膜高血糖素原的氨基酸33至61，而GLP-1作為37個氨基 酸的膚產生，其對應于前膜高血糖素原的氨基酸72至108。
[0006] 當血糖水平降得太低W致于不能為身體活動提供足夠能量時，發生低血糖癥。在 成人或10歲W上的兒童中，低血糖癥較不常見，除非是作為糖尿病治療的副作用，但是它 可W來源于其它藥物治療或疾病、激素或酶缺乏、或腫瘤。當血糖開始下降時，由膜腺產生 的激素膜高血糖素向肝臟發出信號，使肝臟分解肝糖原并釋放葡萄糖，使血糖水平朝著正 常水平升高。因此，普遍認為膜高血糖素在葡萄糖調節中的作用是抵消膜島素的作用并維 持血糖水平。但是對于糖尿病而言，該種針對低血糖癥的膜高血糖素響應可能被破壞，使葡 萄糖水平難W恢復至正常范圍。
[0007] 低血糖癥是威脅生命的事件，其需要立即進行醫療關注。給予膜高血糖素是已經 建立起來的治療急性低血糖癥的藥物治療，它可W在給藥數分鐘內恢復葡萄糖的正常水 平。當膜高血糖素用于低血糖癥的急性醫療處理時，將晶體形式的膜高血糖素溶解于弱酸 緩沖液，并通過肌肉內注射該溶液。雖然該治療是有效的，但方法很麻煩，且對于某些半昏 迷狀態的人員有危險。因此，需要該樣一種膜高血糖素類似物，其保持母體分子的生物學表 現但在相關的生理條件下具有足夠的溶解性和穩定性，從而其可W預先配制為即用型注射 溶液。
[0008] 另外，鼓勵糖尿病患者維持接近正常的血糖水平W延遲或預防微血管并發癥。該 目標的實現通常需要強化膜島素治療。在努力達到該目標的過程中，醫生曾遇到過他們的 糖尿病患者中的低血糖癥的頻率和嚴重性顯著升高的問題。因此，需要改善的藥物和方法 來治療糖尿病，所述藥物和方法相對于目前的膜島素治療而言，較不容易誘導低血糖癥。
[0009] 如本文所述，提供了高效力的膜高血糖素激動劑，其在適合商用的藥物組合物中 在生理pH時具有升高的生物物理穩定性和水溶性。原始膜高血糖素在生理pH范圍內既不 可溶也不穩定，因此，其必須作為干燥產品生產，需要復原和立即使用。本文描述的膜高血 糖素類似物具有增強的物理性質，該使其特別適合用于目前應用原始激素的目前的醫療環 境中。根據一個實施方式，該些化合物可W用于制備用于治療低血糖癥的預先配制的即用 型注射溶液。或者，膜高血糖素激動劑可W與膜島素一起給藥W緩沖膜島素的效應，W便允 許更穩定地維持血糖水平。另外，下文詳細描述了包含本文公開的修飾的膜高血糖素膚的 組合物的其它有益用途。


【發明內容】

[0010] 本發明的一個實施方式提供了膜高血糖素膚，其保持膜高血糖素受體的活性并相 對于原始膜高血糖素膚（SEQ ID NO: 1)表現出改善的溶解性。原始膜高血糖素在水溶液中， 特別是在生理抑時溶解性差，傾向于隨時間發生聚集和沉淀。相反，相對于原始膜高血糖 素，本發明的一個實施方式的膜高血糖素膚在25°C在6-8的抑，或6-9的抑，例如在抑為 7時，在24小時后表現出至少2倍、5倍或更高的溶解性。
[0011] 在一個實施方式中，膜高血糖素膚保持原始膜高血糖素的至少10 %、20 %、30 %、 40 %、50 %、60 %、70 %、75 %的活性、80 %的活性、85 %的活性、或90 %的活性（按照膜高血 糖素膚的EC50相對于膜高血糖素的EC50的反比計算，例如使用大體上如實施例13中描述 的測定法通過cAMP的產生來測定）。在一個實施方式中，本發明的膜高血糖素膚具有等于 或大于膜高血糖素的活性（與本文的"效力"一詞同義使用）。在一些實施方式中，膜高血 糖素膚保持多達約100 %、1000 %、10, 000%、100, 000 %或1，000, 000 %的原始膜高血糖素 活性。
[0012] 膜高血糖素通常具有大約1 %的原始GLP-1在GLP-1受體上的活性。GLP-1 (7-36) 醜胺（SEQ ID N0:57)或GLP-U7-37)酸（SEQ ID N0:58)是化P-1的生物學有效形式，它 們在GLP-1受體上具有基本上相同的活性。相對于GLP-1受體，膜高血糖素對于膜高血糖 素受體也具有10至20倍高的選擇性（選擇性按照膜高血糖素對于膜高血糖素受體的EC50 相對于膜高血糖素對于GLP-1受體的EC50的反比計算）。例如，在某測定中，膜高血糖素對 于膜高血糖素受體的EC50是0. 22nM并且膜高血糖素對于化P-1受體的EC50是3. 85nM，貝。 計算的選擇性是17. 5倍。可W通過例如使用大體上如實施例13描述的測定法通過cAMP 的產生來測定活性。在一些實施方式中，本發明的膜高血糖素膚表現出小于大約5%、4%、 3%、2%或1%的原始化P-1在化P-1受體上的活性，和/或相對于化P-1受體而言，其對 于膜高血糖素受體的選擇性是大于約5倍、10倍、或15倍。例如，在一些實施方式中，本發 明的膜高血糖素膚表現出小于5%的原始GLP-1在GLP-1受體上的活性，并且相對于GLP-1 受體而言，其表現出對于膜高血糖素受體的大于5倍的選擇性。
[0013] 本發明的任何膜高血糖素膚還可能另外表現出改善的穩定性和/或減少的降解， 例如，在25°C在24小時后保持至少95%的初始膚。在一些實施方式中，本發明的膜高血糖 素膚表現出改善的穩定性，從而在至少2(TC (例如2rc、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、至 少27. 5°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少50°C ) W及小于l〇〇°C、小于85°C、小于 75°C，小于或70°C的溫度，在溶液中1周或更長時間（例如，2周、4周、1個月、2個月、4個 月、6個月、8個月、10個月、12個月）之后，通過紫外線扣V)檢測器在280nm可W檢測到 至少75 % (例如至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、大于95 %，直至100 % )濃度 的膚，或者小于大約25% (例如，小于20%、小于15%、小于10%，小于5%、4%、3%、2%、 1%、直至0% )的降解的膚。
[0014] 根據一個實施方式，提供了具有改善的溶解性的膜高血糖素膚，其中通過氨基酸 替換和/或添加對所述膚進行修飾，所述氨基酸替換和/或添加向所述膚的C-末端部分引 入帶電的氨基酸，在一個實施方式中，是在SEQ ID NO: 1的位置27的C-末端的位置。任選 地，可W在C-末端部分引入1個、2個或3個帶電的氨基酸，在一個實施方式中，是在（相對 于）位置27的C-末端。根據一個實施方式，位置28和/或29的原始氨基酸被替換為帶 電的氨基酸，和/或1至3個帶電的氨基酸被添加到膚的C-末端，在位置29之后。在示例 性實施方式中，所述帶電的氨基酸中的1個、2個或全部是帶負電的。可W對膜高血糖素膚 進行另外的仍允許它保留膜高血糖素活性的修飾，例如保守性替換。
[0015] 根據一個示例性實施方式，膜高血糖素膚包含SEQ ID N0:11的氨基酸序列，或其 類似物，所述類似物相對于原始膜高血糖素含有1至3個另外的氨基酸修飾，或它的膜高血 糖素膚激動劑類似物。SEQ ID NO: 11代表修飾的膜高血糖素膚，其中原始蛋白的位置28 的天冬醜胺殘基替換為天冬氨酸。在另一個示例性實施方式中，膜高血糖素膚包含SEQ ID N0:38的氨基酸序列，其中原始蛋白的位置28的天冬醜胺殘基替換為谷氨酸。其它示例性 實施方式包括SEQ ID側:24、25、26、33、35、36和37的膜高血糖素膚。
[0016] 根據另一個實施方式，提供了在膜高血糖素受體上具有增強的效力的膜高血糖素 膚，其中所述膚包含在原始膜高血糖素（SEQ ID NO: 1)位置16上的氨基酸修飾。通過非限 制性舉例方式，該樣的增強的效力可W通過W下列氨基酸替換位置16的天然存在的絲氨 酸來提供：谷氨酸或其它帶負電的具有4個原子長度的側鏈的氨基酸，或谷氨醜胺、高谷氨 酸或高半脫氨酸中的任一個，或具有包含至少一個雜原子（例如N、0、S、巧的側鏈和具有 大約4個（或3-5個）原子長度的側鏈的帶電的氨基酸。W谷氨酸替換位置16的絲氨酸 使膜高血糖素在膜高血糖素受體上的活性增強至少2倍、4倍、5倍、直至大于10倍。在一 些實施方式中，相對于GLP-1受體，膜高血糖素膚保持對于膜高血糖素受體的選擇性，例如 至少5倍、10倍、或15倍的選擇性。
[0017] 可W通過向膚連接親水性部分進一步改善前述任意化合物的溶解性。引入該樣的 基團還會延長作用時間，例如，按照循環中的延長的半衰期來度量。在一個實施方式中，親 水性部分是聚己二醇（陽G)鏈或其它水溶性聚合物，其共價連接至所述膜高血糖素膚的位 置16、17、21、24、29、40上的一個或多個氨基酸殘基、C-末端延伸內的氨基酸殘基或C-末 端氨基酸的側鏈。在一些實施方式中，在該位置的原始氨基酸替換為具有適合與親水性部 分交聯的側鏈的氨基酸，W促進親水性部分與膚的連接。示例性的氨基酸包括切S、Lys、 化n、高半脫氨酸或己醜基苯丙氨酸（Ac-Phe)。在其它實施方式中，在C-末端向膚添加經 修飾為包含親水性基團的氨基酸。根據一個實施方式的聚己二醇鏈的分子量介于大約500 至大約40, 000道爾頓的范圍。在一個實施方式中，聚己二醇鏈的分子量介于大約500至大 約5, 000道爾頓的范圍。在一個另實施方式中，聚己二醇鏈的分子量介于大約10, 000至大 約20, 000道爾頓。在其它示例性實施方式中，聚己二醇鏈的分子量介于大約20, 000至大 約40, 000道爾頓。
[0018] 根據一些實施方式，本文公開的膜高血糖素膚被修飾為包含醜基或焼基，例如對 于天然存在的氨基酸而言不是原始的（non-native)醜基或焼基。醜基化或焼基化可W增 加循環中的膜高血糖素膚的半衰期，可W有利地延遲在膜高血糖素和/或GLP-1受體上的 作用起始和/或延長作用的持續時間，和/或提高對諸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。醜基化 或焼基化還可W增強膚在中性抑的溶解性。如本文所示，醜基化之后，維持了（如果沒增 強）膜高血糖素膚在膜高血糖素受體和GLP-1受體上的活性。
[0019] 在一些方面，膜高血糖素膚通過間隔子共價連接到醜基或焼基，所述間隔子是例 如氨基酸、二膚、H膚、親水性雙官能間隔子或疏水性雙官能間隔子。在一些方面，在通過間 隔子使膚醜基化之后，觀察到在GLP-1和膜高血糖素受體上的活性增強。在選擇的方面，諸 女口，例如，當膚缺少分子內橋（例如，共價分子內橋）的時候，相對于那些其中醜基不通過間 隔子連接到膚上的醜基化的膚而言，在通過間隔子使膚醜基化之后，觀察到在GLP-1和膜 高血糖素受體上的活性的進一步增強。根據一些實施方式，間隔子是氨基酸或具有長度為 3至10個原子（例如6至10個原子）的氨基酸或膚骨架結構的二膚。根據一些具體實施 方式，間隔子和醜基或焼基的總長度是14至28個原子，例如17至28個，19至26個原子， 19至21個原子。用于增強膜高血糖素活性目的的合適的間隔子在本文中另有詳細描述。 在一些實施方式中，本文描述的的醜基化或焼基化的膚還包含選擇性地降低在GLP-1受體 上的活性的修飾，例如位置7的Thr的修飾，例如W缺少輕基的氨基酸如氨基下酸（Abu)或 lie替換位置7的化r ;刪除在位置27或28的氨基酸的C-末端的（一個或多個）氨基酸 (例如刪除位置28和29的氨基酸中的一個或兩個），從而產生長度為27或28個氨基酸的 膚。
[0020] 可W在親水性部分連接的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置進行膜高血糖 素膚的醜基化或焼基化。
[0021] 在一些實施方式中，本發明提供了修飾為包含共價連接至膜高血糖素膚的位置10 的氨基酸的醜基或焼基的膜高血糖素膚。膜高血糖素膚還可W在膜高血糖素膚的位置10 的氨基酸和醜基或焼基之間包含間隔子。在一些實施方式中，所述醜基是脂肪酸或膽汁酸 或其鹽，例如C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、膽酸、C4至C30焼基、C8至C24焼基、或 包含膽汁酸的留（steroid)部分的焼基。間隔子是具有結合醜基或焼基的適當的反應性基 團的任意部分。在示例性的實施方式中，間隔子包含氨基酸、二膚、H膚、親水性雙官能間隔 子例如氨基聚（焼氧基）駿酸基團（amino poly (alkylo巧)carbo巧late),或疏水性雙官 能間隔子。在一些實施方式中，間隔子選自Trp、Glu、Asp、切S和包含NH2(CH2CH2〇)n(CH2) mCOOH的間隔子，其中m是1至6的任意整數，n是2至12的任意整數。該樣的醜基化或焼 基化的膜高血糖素膚還可W包含親水性部分，任選為聚己二醇。前述任意膜高血糖素膚可 W包含兩個醜基或兩個焼基，或其組合。
[0022] 本發明還包括所述膜高血糖素激動劑的藥學上可接受的鹽。
[0023] 在其它示例性實施方式中，可W通過向膜高血糖素膚的駿基末端添加第二個膚而 對任意前述化合物進行進一步修飾W改變其藥學特性。在一個實施方式中，膜高血糖素膚 通過膚鍵共價結合至第二個膚，其中所述第二個膚包含選自SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和SEQ ID NO:22的序列。
[0024] 在一些實施方式中，位置1或2的修飾可W增加膚對二膚基膚酶IV值PP IV)切割 的抗性。例如，位置2的氨基酸可W替換為D-絲氨酸、D-丙氨酸、額氨酸、甘氨酸、N-甲基 絲氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基異下酸。或者或另外，位置1的氨基酸可W替換為D-組氨酸 值-His)、去氨基組氨酸（desaminohistidine)、輕基-組氨酸、己醜基-組氨酸、高組氨酸、 N-甲基組氨酸、a -甲基組氨酸、咪哇己酸、或a，a -二甲基咪哇己酸值MIA)。
[0025] 觀察到位置2的修飾（例如位置2的AIB) W及在一些情況下位置1的修飾（例 如位置1的DMIA)可降低膜高血糖素活性，有時顯著降低；令人驚奇的是，膜高血糖素活性 的該種降低可W通過膜高血糖素的C-末端部分（大約是氨基酸12-29)中的a-螺旋結 構的穩定化得W恢復。在一些實施方式中，穩定化是通過位置"i"和"i+4"的氨基酸之間 的共價鍵實現的，其中i是12至25的任意整數。在一些【具體實施方式】中，"i"和"i+4"是 12和16,16和20,或，20和24,或，24和28。在一些實施方式中，該共價鍵是位置16的谷 氨酸和位置20的賴氨酸之間的內醜胺橋。在示例性實施方式中，橋或接頭的長度是大約8 個（或大約7-9個）原子。在其它實施方式中，穩定化是通過位置"j"和"j+3"的氨基酸 之間的共價鍵實現的，其中j是12至27的任意整數。在示例性實施方式中，橋或接頭的長 度是大約6個（或大約5-7個）原子。在其它實施方式中，穩定化是通過位置"k"和"k+7" 的氨基酸之間的共價鍵實現的，其中k是12至22的任意整數。在一些實施方式中，該共價 鍵是分子內橋而非內醜胺橋。例如，合適的形成共價鍵的方法（即形成共價分子內橋的方 法）包括下列的任一個或多個；帰姪復分解（olefin metathesis)、基于羊毛硫氨酸的環化、 二硫橋或修飾的含硫橋的形成、使用a, 二氨基焼姪系繩（diaminoa化ane tethers)、 金屬-原子橋的形成和其它的膚環化方式。
[0026] 在其它實施方式中，通過非共價鍵（即非共價的分子內橋）使螺旋穩定化，包括但 不限于氨鍵、離子相互作用和鹽橋。
[0027] 在本發明的其它實施方式中，膜高血糖素膚的C-末端部分（大約是氨基酸 12-29)中的a-螺旋結構的穩定化通過在保持想要的活性的位置上故意引入一個或多個 a, a-雙取代氨基酸來實現。在一些實施方式中，膜高血糖素膚的位置16、17、18、19、20、 21、24或29中的1個、2個、3個、4個或更多個被a, a-雙取代氨基酸替換。例如，W氨基 異下酸（AIB)替換膜高血糖素膚的位置16提供了不存在鹽橋或內醜胺時的穩定的a-螺 旋。該樣的膚在本文中被認為是不含分子內橋的膚。在具體的方面，通過引入一個或多個 a，a-雙取代氨基酸而不引入共價的分子內橋例如內醜胺橋、二硫橋來實現a-螺旋的穩 定化。該樣的膚在本文中被認為是不含共價的分子內橋的膚。在一些實施方式中，位置16、 20、21或24中的1個、2個、3個、或更多個被AIB替換。
[0028] 因此，在一些實施方式中，本發明提供了具有膜高血糖素激動劑活性的膜高血糖 素膚，其包含W下氨基酸序列：
[0029] Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Tii)-Leu-Met-Z(SEQ ID N0:39)，其中具有 1 至 3 個氨基酸修 飾，
[0030] 其中XI和/或X2是非原始氨基酸，該非原始氨基酸降低膜高血糖素膚對二膚基 膚酶IV值PP-IV)切割的敏感性（或增加對其的抗性），
[0031] 其中Z選自-C00H(天然存在的C-末端駿酸基團）、-Asn-C00H、Asn-Thr-C00H和 Y-C00H，其中Y是1至2個氨基酸，并且，
[0032] 其中分子內橋，優選共價鍵，將位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的側鏈連接起 來，其中i是12、16、20或24。
[003引在一些實施方式中，分子內橋是內醜胺橋。在一些實施方式中，SEQ ID N0:39的 位置i和i+4的氨基酸是Lys和Glu，例如Glul6和Lys20。在一些實施方式中，XI選自 D-His、N-甲基-His、a -甲基-His、咪哇己酸、去氨基-His、輕基-His、己醜基-His、高組 氨酸和a, a-二甲基咪哇己酸值MIA)。在其它實施方式中，X2選自D-Ser、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、Val和a氨基異了酸（AIB)。在一些實施方式中，膜高血糖素膚在氨基酸位 置16、17、20、21、24、29、40中的任意位置、C-末端延伸內或C-末端氨基酸共價連接至親水 性部分。在示例性實施方式中，該親水性部分共價連接至該些位置中的任意位置上的Lys、 切S、化n、高半脫氨酸或己醜基苯丙氨酸殘基。示例性的親水性部分包括聚己二醇（PEG)，例 女口，分子量為大約1，000道爾頓至大約40, 000道爾頓，或大約20, 000道爾頓至大約40, 000 道爾頓。
[0034] 在其它實施方式中，本發明提供了具有膜高血糖素激動劑活性的膜高血糖素膚， 其包含W下氨基酸序列：
[0035] Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-hp-Leu-Met-ZGEQ ID N0:39),
[0036] 其中XI和/或X2是非原始氨基酸，該非原始氨基酸降低膜高血糖素膚對二膚基 膚酶IV值PP-IV)切割的敏感性（或增加對其的抗性），
[0037] 其中膜高血糖素膚的位置16、20、21和24中的1個、2個、3個、4個或更多個被 a，a-雙取代氨基酸替換，并且
[0038] 其中Z選自-C00H(天然存在的C-末端駿酸基團）、-Asn-C00H、Asn-Thr-C00H和 Y-C00H，其中Y是1至2個氨基酸。
[0039] 前述膜高血糖素膚或類似物的示例性的另外的氨基酸修飾包括：位置7的T虹替 換為缺少輕基的氨基酸例如Abu或lie,任選地，所述替換與包含共價連接至（任選地，通過 間隔子）醜基或焼基（其中所述醜基或焼基對于天然存在的氨基酸而言不是原始的）的側 鏈的氨基酸的替換或添加相聯合，位置12的Lys被Arg替換；位置15的Asp被Glu替換； 位置16的Ser被T虹或AIB替換；位置20的Gin被Ser、化r、Ala或AIB替換；位置21的 Asp被Glu替換；位置24的Gin被Ser、!'虹、Ala或AIB替換；位置27的Met被Leu或Nle 替換；位置28的Asn被帶電的氨基酸替換；位置28的Asn被選自Lys、Arg、化s、Asp、Glu、 半脫氨酸和高半脫氨酸的帶電的氨基酸替換；位置28被Asn、Asp或Glu替換；位置28被 Asp替換；位置28被Glu替換；位置29的T虹被帶電的氨基酸替換；位置29的T虹被選自 Lys、Arg、化3、439、6111、半脫氨酸和高半脫氨酸的帶電的氨基酸替換；位置29被439、6111或 Lys替換；位置29被Glu替換；在位置29之后插入1-3個帶電的氨基酸；在位置30 (即在 位置29之后）插入Glu或Lys ;任選地在位置31插入Lys ;向C-末端添加SEQ ID NO: 20， 任選地，其中位置29的氨基酸是T虹或Gly ;替換為或添加共價連接至親水性部分的氨基 酸；或其組合。
[0040] 在另一個示例性實施方式中，可W通過修飾SEQ ID NO: 1的位置15的氨基酸對前 述任意的膚進行進一步修飾W改善穩定性，W便減少該膚隨時間的降解，特別是在酸性或 堿性緩沖劑中的降解。在示例性的實施方式中，位置15的Asp替換為谷氨酸、高谷氨酸、半 脫氨酸或高半脫氨酸。
[0041] 或者，可W通過修飾SEQ ID NO: 1的位置16的氨基酸對本文描述的任意膜高血糖 素膚進行進一步修飾W改善穩定性。在示例性的實施方式中，位置16的Ser替換為T虹或 AIB，或者上文描述的增強在膜高血糖素受體上的效力的任意氨基酸替換。該樣的修飾減少 Aspl5-Serl6之間的膚鍵的切割。
[0042] 在膜高血糖素受體上的維持的或增強的活性可W通過W谷氨醜胺類似物修飾位 置3的Gin來實現。例如，在位置3包含谷氨醜胺類似物的膜高血糖素膚可W顯示出原始 膜高血糖素（例如SEQ ID NO: 1)在膜高血糖素受體上的大約5%、大約10%、大約20%、大 約50 %或大約85 %或更高的活性。在一些實施方式中，在位置3包含谷氨醜胺類似物的膜 高血糖素膚可W顯示出相應的膜高血糖素膚（其與包含谷氨醜胺類似物的膚具有相同的 氨基酸序列，除了位置3的修飾的氨基酸之外）（例如SEQ ID N0:69或SEQ ID N0:70)在 膜高血糖素受體上的大約20 %、大約50 %、大約75 %、大約100 %、大約200 %或大約500 % 或更高的活性。在一些實施方式中，在位置3包含谷氨醜胺類似物的膜高血糖素膚表現出 在膜高血糖素受體上的增強的活性，但該增強的活性不超過原始膜高血糖素或相應的膜高 血糖素膚（其與包含谷氨醜胺類似物的膚具有相同的氨基酸序列，除了位置3的修飾的氨 基酸之外）的活性的 1000%、10, 000%、100, 000%或 1，000, 000%。
[0043] 在一些實施方式中，所述谷氨醜胺類似物是天然存在的或非天然存在的包含結構 I、II或III的側鏈的氨基酸：
[0044]

【權利要求】
1. 一種肽，其包括： (i)氨基酸序列 HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE (SEQ IDNO: 76)或（ii) 具有1個、2個或3個修飾的EQ ID NO: 76， 其中所述肽包括在位置16的AIB、在位置28的Asp和在位置29的Glu且所述肽展示 胰高血糖素激動劑活性。
2. 權利要求1的肽，其中所述肽的位置1的氨基酸是D-組氨酸（D-His)、去氨基組氨 酸、羥基-組氨酸、乙酰基-組氨酸、高組氨酸、N-甲基組氨酸、a -甲基組氨酸、咪唑乙酸或 a，a -二甲基咪唑乙酸（DMIA)。
3. 權利要求1的肽，其中所述肽的位置2的氨基酸是D-絲氨酸、D-丙氨酸、纈氨酸、甘 氨酸、N-甲基絲氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基異丁酸（AIB)。
4. 權利要求3的肽，其中位置2的氨基酸是D-絲氨酸或AIB。
5. 權利要求1的肽，其中位置20的氨基酸是是Ala、Ser或Thr。
6. 權利要求1的肽，其中位置24的氨基酸是Ala、Ser或Thr。
7. 權利要求1的肽，其包括氨基酸序列SEQ ID NO: 68。
8. 包含通過接頭連接的兩個肽的二聚體，其中所述兩個肽中至少一個是權利要求1-7 中任一項的肽。
9. 權利要求8的二聚體，其中所述二聚體是同型二聚體。
10. -種綴合物，其包含綴合部分和權利要求1-7中任一項的肽，任選地，其中所述綴 合部分是多肽、祀向試劑、診斷標記、聚合物或糖。
11. 權利要求10的綴合物，其中所述綴合部分是多肽且所述多肽是異源肽、免疫球蛋 白或其部分。
12. -種融合肽，其由融合至包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20的肽的權利要求1或7中 任一項的肽組成。
13. -種藥物組合物，其包含權利要求1-7中任一項的肽和藥學上可接受的載體。
14. 一種藥物組合物，其包含權利要求8的二聚體和藥學上可接受的載體。
15. -種藥物組合物，其包含權利要求10的綴合物和藥學上可接受的載體。
16. -種藥物組合物，其包含權利要求12的融合肽和藥學上可接受的載體。
17. -種用于向有需要的患者給予胰高血糖素激動劑的藥盒，所述藥盒包括權利要求 13的藥物組合物和用于給予患者所述藥物組合物的裝置。
18. 權利要求17的藥盒，其中所述裝置包括注射器和針，其中所述藥物組合物預先包 裝在所述注射器內。
19. 權利要求1-7中任一項的肽或包含所述肽的二聚體、綴合物、融合肽或其組合在制 備用于在有需要的患者中引起腸道的暫時性麻痹、在有需要的患者中減少體重增加或引起 體重下降、在有需要的患者中治療或預防低血糖癥或在有需要的患者中穩定血糖水平的藥 物中的用途。
20. 權利要求19的用途，其中所述藥物用于穩定血糖水平并與胰島素聯用。
【文檔編號】A61P3/10GK104447980SQ201410562514
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2009年6月16日 優先權日:2008年6月17日
【發明者】R.D.迪馬基, D.L.斯米利, M.迪馬基, J.沙貝內, J.戴 申請人:印第安納大學研究及科技有限公司