一種抗j亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，提供了一種抗J亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗，該疫苗采用原核表達(dá)后篩選純化的高活性的重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑制備而得，其中編碼重組蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用該表位疫苗免疫7日齡種禽雛雞可以產(chǎn)生1:128000的中和抗體，體外病毒中和實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該表位疫苗可中和不同ALV-J分離毒株，有效保護(hù)雞群抵抗ALV-J毒株感染，該表位疫苗基于env來(lái)源的多表位抗原基因序列，克服了ALV-J的病毒變異，開(kāi)辟了ALV-J疫苗新時(shí)代，提供了抗ALV-J感染的新手段，為ALV-J的防控提供了技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】一種抗J亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制備方法 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體提供了一種抗J亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗 及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J)引起的一種腫瘤性傳染病，臨 床上主要以髓細(xì)胞性白血病多見(jiàn)，多以免疫抑制、生長(zhǎng)抑制和多器官組織出現(xiàn)腫瘤等為其 主要特征。我國(guó)J亞群禽白血病的發(fā)生已相當(dāng)普遍，臨床病例從最初的商品肉雞群發(fā)展到 商品蛋雞、地方種雞群及其他家禽,并伴隨著致瘤性增強(qiáng)及腫瘤多樣性的發(fā)生。研究顯示， 我國(guó)的J亞群禽白血病毒呈現(xiàn)高感染率、高發(fā)病率，早期感染普遍、發(fā)病日齡明顯提前，混 合感染多發(fā)/頻發(fā)，宿主范圍擴(kuò)展、腫瘤譜擴(kuò)大，病理變化復(fù)雜化等特點(diǎn)，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè) 造成了巨大的損失。基于J亞群禽白血病毒囊膜蛋白的超變特性，加之自身的免疫逃避能 力及宿主的免疫選擇壓力，使得禽白血病病毒的抗原變動(dòng)性極大，成為其傳統(tǒng)滅活疫苗、弱 毒疫苗研制無(wú)法逾越的瓶頸。目前，臨床上尚無(wú)相關(guān)藥物及疫苗用于J亞群禽白血病的防 控。國(guó)外通過(guò)凈化控制本病的發(fā)生，由于凈化周期長(zhǎng)、成本高，在我國(guó)目前還未能有效實(shí)施， 只能通過(guò)淘汰感染雞只進(jìn)行大群凈化，無(wú)法控制ALV-J的感染，不斷出現(xiàn)ALV-J大范圍密集 感染的報(bào)道，我國(guó)的J亞群禽白血病防控形勢(shì)嚴(yán)峻。國(guó)內(nèi)外均有過(guò)對(duì)于J亞群禽白血病的 疫苗研發(fā)方法的報(bào)道，主要為傳統(tǒng)的甲醛滅活疫苗、弱毒疫苗，基于SU的亞單位疫苗、核酸 疫苗，這些疫苗在一定程度上可以對(duì)機(jī)體提供保護(hù)，但都會(huì)造成毒力恢復(fù)以及散毒的可能， 免疫效果不穩(wěn)定無(wú)法臨床應(yīng)用。基于以上現(xiàn)狀，研制安全高效的表位疫苗對(duì)于J亞群禽白 血病病毒的防控具有重大現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 表位疫苗是近年發(fā)展起來(lái)成熟的新型疫苗，在人源病毒中研究深入。表位疫苗是 利用基因工程手段，體外表達(dá)或人工合成病原微生物的表位，繼而開(kāi)發(fā)出預(yù)防性或治療性 疫苗。表位疫苗相對(duì)傳統(tǒng)疫苗擁有較多優(yōu)勢(shì),表位肽短小,免疫原性強(qiáng),可以克服主要組織 相容性復(fù)合體（MHC)分子的遺傳限制，本身安全、無(wú)毒、穩(wěn)定，可以直接刺激機(jī)體產(chǎn)生特異 性免疫反應(yīng)，其最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以克服傳統(tǒng)疫苗造成的毒力恢復(fù)或散毒的可能，有著非 常廣闊的發(fā)展前景。目前，已開(kāi)發(fā)出有效的艾滋病病毒、乙肝病毒、人類皰疹病毒等表位 疫苗。ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。病毒囊膜蛋白（env)可分為由gp85基因編碼的表面蛋白 (surface protein, SU)和 gp37 基因編碼的跨膜蛋白（transmembrane protein，TM),二者 在一起形成二聚體，病毒囊膜蛋白決定亞群的特異性。gp85是病毒囊膜蛋白表面的主要成 分，在ALV感染吸附宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體中具有重要作用，含有眾多的抗 原表位，負(fù)責(zé)識(shí)別靶細(xì)胞膜上的特異性受體，TM主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合過(guò)程。基 于ALV-J的病毒特性，表位疫苗的研究成果為對(duì)抗ALV-J的超變特性，成功研制ALV-J疫苗 提供了科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的相關(guān)情況，發(fā)明人考慮將表位疫苗應(yīng)用于抗禽J亞群禽白血病 病毒感染疫苗，進(jìn)而經(jīng)研究實(shí)驗(yàn)后提供了一種抗J亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗，該 疫苗采用原核表達(dá)后篩選純化的高活性的重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑制備而得，其 中編碼重組蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1所示，利用該表位疫苗免疫7日齡 種禽雛雞可以產(chǎn)生1:128000的中和抗體，體外病毒中和實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該表位疫苗可 中和不同ALV-J分離毒株，有效保護(hù)雞群抵抗ALV-J毒株感染，該表位疫苗基于env來(lái)源的 多表位抗原基因序列，克服了 ALV-J的病毒變異，開(kāi)辟了 ALV-J疫苗新時(shí)代，提供了抗ALV-J 感染的新手段，為ALV-J的防控提供了技術(shù)支撐。
[0005] 發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)ALV-J在整個(gè)env都存在不同的抗原表位，通過(guò)篩選env上的 抗原表位可以開(kāi)發(fā)有效的多表位疫苗。通過(guò)發(fā)明人前期對(duì)ALV-J的致病性進(jìn)行了系統(tǒng)深入 的研究，在系統(tǒng)解析其免疫抑制機(jī)制、跨種傳播機(jī)制和免疫逃避機(jī)制的基礎(chǔ)上，結(jié)合多表位 可以傳遞廣譜表位信息這一理念，最終制備了抗禽J亞群禽白血病病毒感染疫苗，可以避 免由于病毒變異而造成的免疫失敗，有利于提供更完全和更有針對(duì)性的免疫保護(hù)，表位疫 苗的研究成果為的研制開(kāi)辟了新的方向和重要的技術(shù)支撐。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0007] 通過(guò)分析獲得NCBI上發(fā)表的ALV-J囊膜上的抗原表位，篩選出代表流行毒株的抗 原表位基因序列，通過(guò)采用編碼甘氨酸、絲氨酸的密碼子進(jìn)行串聯(lián)，最終確定人工合成基因 片段998bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，原核表達(dá)出重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，聯(lián)合弗氏佐劑制備表位疫苗，所獲得的表位疫苗可以實(shí)現(xiàn)保護(hù)機(jī)體抵抗J亞 群禽白血病感染。
[0008] 其具體過(guò)程如下：
[0009] 查找NCBI上發(fā)表的ALV-J囊膜基因序列，結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)ALV-J抗原表位及免疫逃 避機(jī)制的研究進(jìn)展，運(yùn)用DNAman軟件分析獲得來(lái)源于囊膜基因的22段抗原表位，篩選出代 表流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用編碼甘氨酸、絲氨酸的密碼子進(jìn)行串聯(lián)，獲得重組 囊膜基因序列998bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述基因序列5'端含Nco I酶 切位點(diǎn)，3 '端含Xho I酶切位點(diǎn)。
[0010] 上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成產(chǎn)物CENV連接至PUC57載 體。
[0011] 合成產(chǎn)物測(cè)序，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0012] 將該基因片段連接至pET30a載體，得到了重組載體pET30a_cENV，使用 1-1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到帶有HIS標(biāo)簽的重組蛋白His-cENV，進(jìn)而利用該蛋白聯(lián)合 弗氏佐劑制備表位疫苗。
[0013] 本發(fā)明的這種表位疫苗安全高效，成本低易于大規(guī)模批量生產(chǎn)，可抵抗45% ALV-J毒株的感染，二免后抗體維持時(shí)間達(dá)到11周，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)種雞開(kāi)產(chǎn)前的保護(hù)，從而切 斷病毒的垂直傳播途徑，對(duì)于我國(guó)J亞群禽白血病的防控凈化具有重要意義，且特異性強(qiáng) 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)禽J亞群禽白血病的保護(hù)；同時(shí)由于其含有廣譜的表位信息，可以避免由于病 毒變異而造成的免疫失敗，為J亞群禽白血病的防治提供更完全和更有針對(duì)性、更為高效 安全的疫苗保護(hù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果電泳圖，
[0015] 圖中M為DLlOOOOMarker，1為使用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I雙酶切pUC57-cENV 后獲得的基因片段；
[0016] 圖2為重組表達(dá)菌表達(dá)結(jié)果及蛋白純化前后SDS-PAGE分析結(jié)果，
[0017] 圖中M為170KD Protein Ladder ;1為誘導(dǎo)表達(dá)菌液沉淀，2為上清，3為大量表達(dá) 蛋白沉淀，4為大量表達(dá)蛋白純化后結(jié)果；
[0018] 圖3為Western Blot法檢測(cè)重組蛋白，
[0019] 圖中A使用HRl多抗，B使用HR2多抗，C使用His標(biāo)簽抗體，D使用雞抗SU多抗， E使用鼠抗gp85多抗，驗(yàn)證結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 本實(shí)施例中所采用的具體試劑和儀器為：
[0021] (1)主要試劑
[0022] HRP酶標(biāo)二抗為博奧森生物有限公司產(chǎn)品；
[0023] TMB單組份底物顯色溶液，DAB顯色試劑盒，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒為天根公司產(chǎn) 品；
[0024] 蛋白預(yù)染Marker, Taq聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I為Thermo公司產(chǎn)品；
[0025] T4連接酶、pMD18-T載體、DNA Marker為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；
[0026] 質(zhì)粒抽提試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；
[0027] His標(biāo)簽抗體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；
[0028] 胰蛋白胨（Tryptone)及酵母抽提物（Yeast Extract)為Oxiod公司產(chǎn)品；
[0029] 其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0030] (2)主要儀器
[0031] 移液器、分光光度計(jì)為Eppendorf公司產(chǎn)品；
[0032] 低溫高速離心機(jī)為湖北湘儀公司產(chǎn)品；
[0033] 凝膠成像系統(tǒng)為北京君意公司產(chǎn)品；
[0034] 酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品；
[0035] 恒溫?fù)u床為上海申能博彩公司產(chǎn)品；
[0036] 恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)為上海博迅公司產(chǎn)品；
[0037] 電泳儀、SDS-PAGE電泳槽、Western-blot膜轉(zhuǎn)印裝置為北京六一公司產(chǎn)品；
[0038] 細(xì)胞超聲波粉碎機(jī)為寧波新芝生物有限公司產(chǎn)品。
[0039] 除上述列出內(nèi)容外，本發(fā)明未提及的部分均采用現(xiàn)有技術(shù)。
[0040] 實(shí)施例IALV-J多表位基因的篩選合成
[0041] 查找NCBI上發(fā)表的ALV-J囊膜基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析獲得囊膜抗原 表位22段，篩選出代表近幾年中國(guó)流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用編碼甘氨酸、絲 氨酸密碼子進(jìn)行串聯(lián)，獲得重組囊膜基因序列998bp，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。所 述基因序列5'端含Nco I酶切位點(diǎn)，3'端含Xho I酶切位點(diǎn)。
[0042] 上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，并由其進(jìn)一步將合成產(chǎn)物cENV 利用常規(guī)工藝連接至PUC57載體。
[0043] 合成產(chǎn)物測(cè)序，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0044] 將pET30a和上述連接了目的基因的pUC-57克隆載體分別用限制性內(nèi)切酶Nco I 和Xho I在37°C水浴條件下進(jìn)行雙酶切60min，用1 %瓊脂糖凝膠電泳后按照膠回收試劑 盒說(shuō)明書的要求分別回收大片段和目的基因片段；
[0045] 雙酶切結(jié)果如圖1，
[0046] 將上述獲得的目標(biāo)物22 °C過(guò)夜連接，其中連接體系為：pET30a載體0.5 μ 1， cENV 基因片段 1 μ 1，ddH2020 μ 1，T4DNA 連接酶 1 μ 1，IOXGreen Buffer2. 5 μ 1，總體積共 25 μ 1，獲得連接產(chǎn)物pET30a-cENV重組質(zhì)粒。
[0047] 將連接產(chǎn)物pET30a_cENV重組質(zhì)粒按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)入0· 1 % CaC12制備的感受態(tài) 細(xì)菌BL21中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，搖菌，提 取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后送去測(cè)序，確認(rèn)其中具有如SEQ ID NO. 1所示的序列，可見(jiàn)獲得的 重組囊膜基因998bp的片段已經(jīng)成功克隆入pET30a-cENV重組質(zhì)粒中。
[0048] 實(shí)施例2重組囊膜蛋白的表達(dá)和純化
[0049] 將測(cè)序后含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性BL21菌接種于含卡那霉素（終濃度為10 μ g/ml) 的LB液體培養(yǎng)基中（市購(gòu)常規(guī)培養(yǎng)基，其中含有1% (w/v)Tryptone，0. 5% (w/v)Yeast Extract，l% (w/v)NaCl，0.1mg/ml KanamycirOdT11C振蕩（200rpm)，培養(yǎng)至 0D600 = 1.0， 加入濃度為500mMol的IPTG至整個(gè)培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為lmmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h， 同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌作為對(duì)照。
[0050] 經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，檢測(cè)步驟如下：收集培養(yǎng)的工程菌菌液，5000rpm，離心 5min，棄上清，沉淀利用標(biāo)準(zhǔn)的PBS重懸獲得重懸液；按照IOOml初始培養(yǎng)基加入標(biāo)準(zhǔn) PBS3ml的比例，向沉淀中加入標(biāo)準(zhǔn)的PBS獲得重懸液。重懸后分裝與5ml離心管中每管 3ml。將離心管置于冰水混合物的燒杯內(nèi)，用超聲破碎儀超聲破菌，120W，工作ls，間歇2s， 超聲90個(gè)循環(huán)，重復(fù)一次；將超聲破菌液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，配平，放入高速冷卻離心機(jī) 中，8000rpm，4°C，離心lOmin，然后用SDS-PAGE電泳檢測(cè)；結(jié)果上清中無(wú)蛋白（未顯示），蛋 白存在于沉淀中，說(shuō)明重組蛋白His-cENV以包涵體形式表達(dá)，如圖2所示，目的蛋白大小約 為 33KD。
[0051] 重組蛋白的純化步驟如下：
[0052] 將上述離心獲得的沉淀用9倍體積的洗滌液I重懸沉淀，靜置5min后，8000rpm， 4°C，15min，棄上清。用9倍體積的洗滌液II重懸沉淀，靜置5min后，8000rpm，4°C，15min 棄上清，保留沉淀。用9倍體積的洗滌液III重懸沉淀，靜置5min后，8000rpm，4°C，15min， 棄上清，保留沉淀。按IOOml菌液加4-10ml溶解液，4°C過(guò)夜。8000rpm，4°C，15min。取上 清，即為純化蛋白。
[0053] 包涵體純化所述試劑配制方法：
[0054] (1)細(xì)菌重懸液（250ml) : PBS (NaC12g, KC10. 05g, Na2HPO4O. 36gKH2P040 . 06g)，Immo 1/L EDTA.
[0055] (3)溶液 I(500ml) :500mmol/L Tris-Cl(pH = 6. 0)，50mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA
[0056] (3)溶液 II (250ml):溶液 I，IM 尿素
[0057] (4)溶液 III(25Oml):溶液 I，2M 尿素
[0058] (5)包涵體溶解液（250ml):溶液I，8M尿素
[0059] SDS-PAGE法與Western Blot法檢測(cè)純化后的蛋白（圖2和3所示）。得到的蛋 白經(jīng)過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白含量，2ml離心管分裝-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060] 上述使用的SDS-PAGE法為常規(guī)方法，未提及的試劑為常規(guī)方法規(guī)定使用的試劑， 其具體操作步驟如下：
[0061] 1)將玻璃板洗干凈，用夾子固定，垂直放置，配置12%分離膠，快速注入到兩玻璃 板之間，膠上部加蒸餾水封口，以保持膠面平整。待分離膠凝固后，倒去分離膠表面的蒸餾 水，用濾紙吸去殘留水。注入濃縮膠，快速插入梳子，并注意防止氣泡的產(chǎn)生。
[0062] 2)取純化后的重組蛋白加入15-20 μ 14X SDS上樣buffer，煮沸l(wèi)Omin。
[0063] 3)往電泳槽加入I XTris-甘氨酸緩沖液，待濃縮膠凝固，小心拔掉梳子，用緩沖 液沖洗加樣孔，用微量進(jìn)樣器上樣，20 μ 1/孔，正確連接電泳槽正負(fù)極，打開(kāi)電源。120V電 壓電泳，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底部時(shí)停止電泳。
[0064] 4)染色：取下凝膠，用蒸餾水沖洗，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色4h以上。
[0065] 5)脫色：將凝膠放入脫色液中，置于搖床上脫色，期間更換3次以上脫色液，待凝 膠藍(lán)色背景全部脫去停止，將凝膠放入蒸餾水中終止脫色。拍照保存，如圖2所示，出現(xiàn)了 大小約為33KD的目的重組蛋白條帶。
[0066] 6)剪一張與Western Blot凝膠大小相同的NC膜，用去離子水浸透，同時(shí)將與凝膠 大小相同的兩張濾紙及纖維墊用轉(zhuǎn)印緩沖液浸透。
[0067] 7)按三明治法安裝轉(zhuǎn)印裝置，即負(fù)極夾-纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖 維墊-正極夾，使NC膜位于轉(zhuǎn)印的正極面，凝膠位于負(fù)極面，其間無(wú)任何氣泡間隙。將轉(zhuǎn)印 裝置放入轉(zhuǎn)移電泳儀中，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，140mA電泳2h。
[0068] 8)轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移后的NC膜用去離子水漂洗一遍，將NC膜浸泡于封閉液中， 4°C封閉過(guò)夜。
[0069] 9)用PBST洗滌NC膜三遍，每次lOmin。
[0070] 10)使用His標(biāo)簽抗體為一抗，NC膜與一抗37°C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，IOmin/ 次。
[0071] 11) NC膜置于HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG中，37 °C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，IOmin/ 次。
[0072] 12)使用DAB顯色試劑盒避光顯色；此時(shí)應(yīng)密切觀察顯色過(guò)程，并在較淺本底且達(dá) 到適當(dāng)顯色強(qiáng)度時(shí)流水終止顯色。拍照保存，如圖3所示，出現(xiàn)了大小約為33KD的目的重 組蛋白條帶。
[0073] 實(shí)施例3重組蛋白的活性檢測(cè)
[0074] 使用上述純化得到的His-cENV蛋白包被ELISA板，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)該 蛋白的生物學(xué)活性。以gp85蛋白免疫鼠陽(yáng)性血清、HRl多肽、HR2多肽免疫雞陽(yáng)性血清以及 IDEXX檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的雞血清為陽(yáng)性對(duì)照，健康SPF雞血清為陰性對(duì)照，HRP標(biāo)記 羊抗鼠 IgG、羊抗雞IgG酶標(biāo)二抗按說(shuō)明書使用。結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的OD值比 值大于2. 1，說(shuō)明該蛋白有良好的生物學(xué)活性和抗原性。
[0075] ELISA具體步驟如下：
[0076] 1)包被：取純化的重組蛋白，以生理鹽水稀釋至最佳濃度，包被反應(yīng)板，100 μ 1/ 孔，4°C過(guò)夜。
[0077] 2)洗滌：甩去酶標(biāo)板中的包被液，用PBST (PBS，0. 05% Tween-20)加滿各孔，搖床 震蕩3min，棄去PBST，洗滌3次，3min/次，拍干。
[0078] 3)封閉：各孔加入封閉液（3%脫脂乳），35(^1/孔，置371：培養(yǎng)箱孵育0.511，洗 漆3次，3min/次，拍干。
[0079] 4)加樣：將待待檢血清按梯度稀釋后加入包被板，100 μ 1/孔，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性血 清對(duì)照。置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干。
[0080] 5)用封閉液將HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG、羊抗雞IgG酶標(biāo)二抗按1:5000稀釋，100 μ 1/ 孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干。
[0081] 6)顯色：使用TMB單組份顯色試劑盒（TIANGEN公司產(chǎn)品）按100 μ 1/孔加入包 被板，37°C條件下避光顯色20min加終止液，2Μ H2S04終止顯色。
[0082] 7)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)其在波長(zhǎng)450nm檢測(cè)各個(gè)孔的OD值，陰性對(duì)照0D450值為 N，陽(yáng)性對(duì)照0D450值為P。若P/N>2. 1判為陽(yáng)性。
[0083] 實(shí)施例4抗J亞群禽白血病病毒感染表位疫苗的制備
[0084] 1)從東岳種禽有限公司購(gòu)買1日齡海蘭褐雛雞50只，隔離罩條件下分組飼養(yǎng)，分 別采集血清及棉拭子，使用IDEXX試劑盒檢測(cè)ALV-J抗體和ALV抗原均為陰性；
[0085] 其中所述的分組為空白對(duì)照組一0組10只，免疫His-cENV組一 1組20只，免疫 His-cENV+弗氏佐劑組一 2組20只。
[0086] 2)將上述獲得的純化蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，當(dāng)測(cè)定濃度達(dá)到7. 6mg/ml后，即可使用 PBS將其稀釋至lmg/ml，將稀釋后的蛋白溶液與弗氏佐劑按照體積比1:1的比例配制，在振 蕩器上混勻后用Iml的注射器分裝，每管0. 2ml ;
[0087] 其中所述的lmg/ml的重組蛋白溶液用pH為7. 4,1 XPBS緩沖液稀釋獲得的；
[0088] 7日齡通過(guò)肌肉注射的方式對(duì)腿肌進(jìn)行多點(diǎn)免疫，免疫組每只雞免疫蛋白0. lg， 對(duì)照組注射相同劑量滅菌PBS，兩周后加強(qiáng)免疫一次。
[0089] 3)抗體消長(zhǎng)規(guī)律監(jiān)測(cè)，首次免疫后10天、二免10天后每周采集血清測(cè)定抗體效 價(jià)；
[0090] 其中所述的抗體效價(jià)測(cè)定，主要將待檢血清以10倍倍比稀釋，其他操作步驟同 ELISA檢測(cè)重組蛋白活性過(guò)程。
[0091] 實(shí)施例5體外病毒中和效果檢測(cè)
[0092] 病毒中和試驗(yàn)例1
[0093] 發(fā)明人采用加強(qiáng)免疫制備的高效價(jià)血清進(jìn)行病毒中和實(shí)驗(yàn)；
[0094] ALV-J NX0101毒株是2001年從我國(guó)寧夏地區(qū)肉雞中分離到的一株純的J亞群禽 白血病毒株，背景清晰；
[0095] 實(shí)驗(yàn)前將血清樣品56°C，30min滅活，除去非特異性物質(zhì)，將ALV-J NX0101病 毒液用無(wú)菌的 DMEM 培養(yǎng)液稀釋至 1TCID50/0. Iml、10TCID50/0. Iml、100TCID50/0. Iml， 取250 μ 1稀釋的病毒液與等量的滅活血清充分混勻后37°C孵育1小時(shí)，接種于長(zhǎng)滿單 層DF-I細(xì)胞的24孔板中，每孔200 μ 1，并設(shè)立只加病毒液和只加血清的對(duì)照，接種1小 時(shí)后換含I %肽牛血清的DMEN培養(yǎng)液維持7天，取細(xì)胞上清用ALV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 上清中病毒含量，結(jié)果顯示100TCID50/0. Iml組、病毒液對(duì)照組為陽(yáng)性，其余為陰性，并且 100TCID50/0. Iml組陽(yáng)性值明顯低于病毒液對(duì)照組，說(shuō)明重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑 制備的表位疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體能夠在體外條件下與ALV-JNX0101毒株發(fā)生中和反 應(yīng)，且效果顯著，證明本發(fā)明所提供的表位疫苗能夠保護(hù)雞群抵抗J亞群禽白血病的感染。
[0096] 病毒中和試驗(yàn)例2
[0097] ALV-J WS0705毒株是2007年從山東蛋雞分離到的一株純的J亞群禽白血病毒株， 背景清晰；
[0098] 發(fā)明人采用試驗(yàn)例1相同方法進(jìn)行病毒中和實(shí)驗(yàn)，操作過(guò)程一致，結(jié)果顯示 100TCID50/0. Iml組、病毒液對(duì)照組為陽(yáng)性，其余為陰性，并且100TCID50/0. Iml組陽(yáng)性值 明顯低于病毒液對(duì)照組，說(shuō)明明重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑制備的表位疫苗誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生的抗體能夠在體外條件下與ALV-J WS0705毒株發(fā)生中和反應(yīng)，且效果顯著，證明本 發(fā)明所提供的表位疫苗能夠保護(hù)雞群抵抗J亞群禽白血病的感染。
[0099] 病毒中和試驗(yàn)例3
[0100] ALV-J DZ1022毒株是2011年從山東蛋雞分離到的一株純的J亞群禽白血病毒株， 背景清晰；
[0101] 發(fā)明人采用試驗(yàn)例1相同方法進(jìn)行病毒中和實(shí)驗(yàn)，操作過(guò)程一致，結(jié)果顯示 100TCID50/0. Iml組、病毒液對(duì)照組為陽(yáng)性，其余為陰性，并且100TCID50/0. Iml組陽(yáng)性值 明顯低于病毒液對(duì)照組，說(shuō)明明重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑制備的表位疫苗誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生的抗體能夠在體外條件下與ALV-J DZ1022毒株發(fā)生中和反應(yīng)，且效果顯著，證明本 發(fā)明所提供的表位疫苗能夠保護(hù)雞群抵抗J亞群禽白血病的感染。
[0102] 實(shí)施例6體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)
[0103] 重組蛋白聯(lián)合弗氏佐劑免疫7日齡種禽雛雞，19日齡加強(qiáng)免疫一次，10天后進(jìn)行 攻毒觀察免疫保護(hù)效果，同時(shí)設(shè)ALV-J感染陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組。
[0104] 飼養(yǎng)至14周齡，全部剖殺，期間每周進(jìn)行血液學(xué)、組織病理學(xué)觀察以及病原學(xué)檢 測(cè)抗病毒效果；
[0105] 結(jié)果顯示免疫保護(hù)組雞群生長(zhǎng)良好，血液各項(xiàng)指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化，ALV抗原檢測(cè)陰 性，無(wú)排毒現(xiàn)象，病理組織學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)組織損傷及炎癥反應(yīng)。而ALV-J陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重 的病毒血癥，肝臟及腎臟等重要臟器出現(xiàn)明顯的損傷和炎癥。實(shí)驗(yàn)證明該表位疫苗可以保 護(hù)雞群抵抗ALV-J的感染。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗J亞群禽白血病病毒感染的表位疫苗，其特征在于：該疫苗米用原核表達(dá) 后篩選純化的高活性的重組蛋白His-cENV聯(lián)合弗氏佐劑制備而得，其中編碼重組蛋白 His-cENV的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，原核表達(dá)出重組蛋白，其氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的表位疫苗作為ALV-J疫苗的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104306995SQ201410593612
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】成子強(qiáng), 侯敏博, 張利 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)