一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑的制作方法
【專利說明】一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑 【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種以促卵泡素為主要藥效成分的緩釋藥物制劑，屬于藥物學、分子 醫學和疾病防治領域。 【【背景技術】】
[0002] 促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)是一種由動物腦垂體前葉分泌 的糖蛋白類促性腺激素。具有調節機體的生長、性成熟和繁殖等作用。
[0003] FSH在雌性動物可促進子宮內膜生長、排卵、刺激多卵泡發育等。靶細胞上存在著 FSH的特異性受體，FSH與細胞膜上的卵泡刺激素受體結合后，通過G蛋白偶聯機制激活腺苷 酸環化酶，使細胞內cAMP增加或引起鈣離子內流，從而對細胞的代謝或功能活動產生影響。 FSH與受體結合后產生兩種作用。一方面活化芳香化酶，另一方面誘導LH受體形成。內膜細 胞在LH的作用下提供19碳底物-雄烯二酮或睪酮這些底物通過基底膜進入顆粒細胞，活化 的芳香化酶把它們轉變為17-β雌二醇(E2)，而卵泡內膜本身只能產生很少量的雌激素。雌 激素協同FSH使顆粒細胞增生，內膜細胞分化，卵泡液形成卵泡腔擴大，從而使卵泡生長和 發育。
[0004] 繁殖是影響畜牧業整體效益的一個關鍵因素。如何提高動物繁殖率一直都是畜牧 領域攻關的一個重點。在現代農業中，種畜的人工授精已經非常普遍，特別是在奶牛(所有 受精類型的75%)及豬(所有受精類型的85%)上的應用。胚胎移植技術是家畜繁殖領域中 的一次重大革命，它能夠提高優秀種畜的繁殖率，充分利用優質遺傳基因，對家畜的育種、 保種、引種及經濟效益的提高都具有非常重要的意義。然而，通過各種手段進行家畜擴繁的 前提條件是動物的適時發情和大量優質卵子來源。給種畜注射適量的動物激素則可以滿足 這些前提條件：目前國際上通用的同類產品有Ovagen(促卵泡素源于羊垂體提取物，新西蘭 產）和F 〇lltr〇pin-V(促卵泡素源于豬垂體提取物，加拿大產），可用于超數排卵（即增加成 熟卵泡數目，每次排卵數目可達10個以上)和配合同期發情(人工授精、胚胎移植之前的關 鍵技術）。為了能夠達到超數排卵，Ovagen和Folltropin-V均需注射八次。國內近年由浙江 寧波第二激素廠生產以及杭州動物藥品廠生產的注射用垂體促卵泡素，每療程注射2-5次， 能促進卵巢卵泡生長發育和雌激素的分泌，引起動物正常發情，但尚不推薦用于超數排卵。 目前的各種同類產品，均需多次注射，不僅人工成本高，更因多次驚擾動物而影響效果。多 年來，行業內紛紛研究長效促卵泡素，包括基因重組、緩釋制劑、改變給藥途徑等不同方法， 試圖減少注射次數，但至今尚未有獸用長效促卵泡素的產品面市。 【
【發明內容】
】
[0005] 本發明要解決的技術問題，在于提供一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，可應用 于動物的超數排卵和誘導發情。
[0006] 本發明是這樣實現的：
[0007] -種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如下:促卵泡素、枸 櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。
[0008] 進一步地，所述促卵泡素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素。
[0009] 進一步地，所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。
[0010] 進一步地，所述緩釋藥物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。
[0011] 進一步地，所述緩釋藥物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每 Iml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~ I .Omg，肝素2~10mg，魚精蛋白2~10mg。
[0012]進一步地，所述肝素與魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。
[0013]進一步地，所述緩釋藥物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每 Iml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~ 1.0 mg，甘露醇50~500mg，肝素4~40mg，魚精蛋白4~40mg。
[0014]進一步地，所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
[0015] 本發明具有如下優點：
[0016] 本發明長效促卵泡素緩釋藥物制劑中含有具有緩控釋作用的低分子肝素(分子量 5000)和魚精蛋白，通過調整低分子肝素和魚精蛋白比例，可以調節藥物釋放速率。本發明 藥物可應用于畜牧業的超數排卵和誘導發情。 【【附圖說明】】
[0017] 下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0018] 圖1是本發明實施例垂體促卵泡素長效注射劑A1-3的體外溶出實驗結果曲線圖。
[0019] 圖2是本發明實施例垂體促卵泡素長效注射劑B1-3的體外溶出實驗結果曲線圖。 【【具體實施方式】】
[0020] 請參閱圖1和圖2所示，對本發明的實施例進行詳細的說明。
[0021] 本發明所涉及的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如 下：促卵泡素、枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。所述促卵泡素為垂體促卵泡 素，或基因重組促卵泡素。所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。所述緩釋藥物制劑 中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。
[0022] 所述緩釋藥物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每1ml生理鹽水 或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，肝素2~ 10mg，魚精蛋白2~10mg。所述肝素與魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。
[0023] 所述緩釋藥物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每1ml生理鹽 水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，甘露 醇50~500mg，肝素4~40mg，魚精蛋白4~40mg。
[0024]所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
[0025]以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0026] 實施例1
[0027]基因重組促卵泡素的制備：
[0028] 將穩定高表達FSH的CHO細胞接入搖瓶，逐步擴增，至密度I X IO6Ail，記為培養第1 天。連續14天后，取細胞培養液，用于純化表達產物。
[0029]將CHO細胞培養液離心，轉速9000g，4°C低溫離心20min，收集培養上清。采用截留 分子量為IOkDa膜超濾，收集超濾濃縮液。用Protein A親和層析柱，對濃縮液純化，得到高 純度FSH蛋白，純度約98%，比活性為WOOOIU/mg。〗~8°C儲存備用。
[0030] 實施例2
[0031 ]垂體促卵泡素長效注射劑的制備：
[0032]取垂體促卵泡素(購自寧波第二激素廠HOOOOOIU，溶于200ml枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩 沖液(PH6.8-7.2)中。每1毫升枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液(pH6.8-7.2)含枸櫞酸鈉30mg，枸櫞 酸0.6mg。取濃度為10mg/ml的低分子肝素(分子量5000)溶液(200、或400、或600ml)，與上述 垂體促卵泡素溶液混合。再取濃度為I 〇mg/ml的魚精蛋白溶液(600、或400、或200ml )，與上 述垂體促卵泡素與低分子肝素的溶液混合。補充枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液至1000ml。所有配 制過程需在百級無菌區內進行。所有溶液均經無菌過濾后使用。在攪拌下，將所得到的溶液 分裝至西林瓶中，每瓶IOml，得到垂體促卵泡素長效注射劑。
[0033] 根據所加入低分子肝素與魚精蛋白的體積，將所得到的制劑命名為垂體促卵泡素 長效注射劑Al，A2和A3。2~8°C儲存備用。制劑中各組分濃度如下表1所示：
[0034] 表1垂體促卵泡素長效注射劑A1-3的制備
[0036] 實施例3 [0037] 體外溶出實驗：
[0038] 取實施例2得到的制劑A1-3,分別置IOml離心管中，置37°C恒溫培養箱內放置，于 第6，12，24，36，48，72，96小時離心（3000rpm)，取上清200微升，ELISA方法測定FSH濃度。在 每次取樣后，離心管內補充200微升枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液(pH6.8-7.2)。根據測定結果， 得到溶出曲線，如圖1所示。由圖1可知，制劑A2(肝素與魚精蛋白用量比例為1:1)的溶出速 率明顯慢于另外兩種，且更接近零級釋放速率。
[0039] 實施例4
[0040] 低分子肝素與魚精蛋白用量對溶出速率的影響：
[0041] 按照實施例2方法制備垂體促卵泡素長效注射劑B1-3A1-3采用低分子肝素與魚 精蛋白用量比例固定為1:1，所不同的是終濃度，具體見表2。
[0042]表2垂體促卵泡素長效注射劑B1-3的制備
[0044] 按照實施例3方法進行體外溶出實驗，結果見圖2。由圖2可知，溶出速率與肝素與 魚精蛋白的用量呈線性關系，可見隨著低分子肝素與魚精蛋白用量的增加，溶出速率逐漸 減小。說明可以通過調整低分子肝素與魚精蛋白用量，調節溶出速率。
[0045] 實施例5
[0046] 重組促卵泡素長效注射劑的制備：
[0047] 取重組促卵泡素1百萬IU，溶于200ml枸橡酸鈉-枸橡酸緩沖液(pH6.8-7.2)中。每1 毫升枸櫞酸鈉 -枸櫞酸緩沖液(PH6.8-7.2)含枸櫞酸鈉30mg，枸櫞酸0.6mg。取濃度為IOmg/ ml的低分子肝素（分子量5000)溶液400ml，與上述垂體促卵泡素溶液混合。再取濃度為 10mg/ml的魚精蛋白溶液400ml，與上述垂體促卵泡素與低分子肝素的溶液混合。補充枸櫞 酸鈉-枸櫞酸緩沖液至1000、4000、10000!111。所有配制過程需在百級無菌區內進行。所有溶 液均經無菌過濾后使用。在攪拌下，將所得到的溶液分裝至西林瓶中，每瓶lml，得到重組促 卵泡素長效注射劑。
[0048] 根據最終溶液的體積，將所得到的制劑命名為重組促卵泡素長效注射劑C1-3,如 下表3所示。2 - 8°C儲存備用。
[0049] 表3重組促卵泡素長效注射劑的制備
[0051] 按照實施例3方法進行體外溶出實驗，結果與圖1-2中肝素與魚精蛋白用量比例為 1:1的A2及B2的結果類似。說明溶出曲線取決于肝素與魚精蛋白用量與比例，而與FSH種類 及終濃度無關。
[0052] 實施例6
[0053] 注射用長效重組垂體促卵泡素的制備：
[0054] 按照第Cl 一 3號制劑處方配制重組促卵泡素注射劑，在處方中另外加入甘露醇，每 制劑單位（即每支注射液）中含甘露醇100、250、500mg。按照常規凍干工藝冷凍干燥，得到凍 干粉針DI-3。室溫條件保存。
[0055]取凍干粉針D1-3,溶于IOml枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液。按照實施例3方法進行體外 溶出實驗。結果與圖1-2中肝素與魚精蛋白用量比例為1:1的A2及B2的結果類似。說明溶出 曲線取決于肝素與魚精蛋白用量與比例，而與FSH劑型無關。
[0056] 實施例7 [0057]體內活性實驗
[0058]參照《中華人民共和國藥典》2010版二部，附錄"卵泡刺激素生物測定法"，測定所 制備FSH制劑的生物學活性。
[0059] (1)實驗動物:未成熟Sprague Dawley雌性大鼠，40 ± 2g，19-22日齡，每組8只；
[0060] (2)稀釋溶液：以lmg/ml BSA溶液溶解中人絨毛膜促性腺激素(hCG)，配制成20IU/ ml hCG溶液，混勻備用；
[0061] (3)標準品溶液:試驗當日，取190IU/瓶FSH標準品1支，用上面稀釋溶液配制成高 中低三個濃度，分別為：lOIU/ml、5IU/ml、2.5IU/ml;
[0062] (4)供試品溶液:試驗當日，用上述溶劑上面稀釋溶液按標示效價將供試品配制成 高中低三個濃度，分別為:30IU/ml、15IU/ml、7.5IU/ml;
[0063] (5)測定法:在每日大致相同時間，分別給每組大鼠皮下注射相應藥物，標準品溶 液或供試品溶液〇.5ml。標準品溶液連續注射三天，每天一次。供試品僅于試驗第一天注射 一次，后兩天注射稀釋溶液。于最后一次注入24h后，處死大鼠，摘出卵巢，剝離附著組織，去 除輸卵管稱重。按照藥典（附錄XIV)生物檢定統計法中量反應測定法計算供試品長效FSH 生物活性。
[0064] 所測試制劑為4232丄2、02，結果說明所有測試的四種制劑，注射一次的體內生物 學活性，與連續注射3次的相同劑量的標準品一致。說明這四種制劑均可以發揮FSH緩釋作 用，可作為長效FSH使用。
[0065] 本發明長效促卵泡素緩釋藥物制劑中含有具有緩控釋作用的低分子肝素(分子量 5000)和魚精蛋白，通過調整低分子肝素和魚精蛋白比例，可以調節藥物釋放速率。本發明 藥物可應用于畜牧業的超數排卵和誘導發情。
[0066] 雖然以上描述了本發明的【具體實施方式】，但是熟悉本技術領域的技術人員應當理 解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用于對本發明的范圍的限定，熟悉本 領域的技術人員在依照本發明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應當涵蓋在本發明的 權利要求所保護的范圍內。
【主權項】
1. 一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥物制劑的組分如下:促 卵泡素、枸橡酸鈉-枸橡酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。2. 根據權利要求1所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述促卵泡 素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素。3. 根據權利要求1所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。4. 根據權利要求3所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。5. 根據權利要求4所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每lml生理鹽水或注射用水中加入促 卵泡素100~1000IU，枸橡酸鈉10~50mg，枸橡酸0· 1~1 .Omg，肝素2~10mg，魚精蛋白2~ 10mg〇6. 根據權利要求5所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述肝素與 魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。7. 根據權利要求4所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每lml生理鹽水或注射用水中加入 促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，甘露醇50~500mg，肝素4~ 40mg，魚精蛋白4~40mg。8. 根據權利要求1~7任一項所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于： 所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
【專利摘要】本發明提供一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如下：促卵泡素、枸櫞酸鈉?枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白；所述促卵泡素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素，所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針，所述緩釋藥物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10，每1ml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100～1000IU，枸櫞酸鈉10～50mg，枸櫞酸0.1～1.0mg，肝素2～10mg，魚精蛋白2～10mg。本發明可應用于動物的超數排卵和誘導發情。
【IPC分類】A61P15/08, A61K38/24, A61K47/42, A61K47/36
【公開號】CN105709214
【申請號】CN201610074872
【發明人】刁勇
【申請人】華僑大學