本發明生物醫藥技術領域，涉及羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應用。

背景技術：

阿爾茨海默病作為老年癡呆癥的主要類型，是老年人口中發病率最高的神經退行性疾病。其發病過程緩慢，隨著時間不斷惡化成持續性神經功能障礙，引起諸多并發癥，確診后平均生命時間為三到九年，患者逐漸喪失身體機能，最終導致死亡。

目前，阿爾茨海默病的具體發病機制尚不明確，因此，新的治療阿爾茨海默病的方法是目前研究者努力研究的方向。腦內線粒體氧化應激出現在在阿爾茨海默病早期，并貫穿整個阿爾茨海默病病理過程。阿爾茨海默病病理進程產生淀粉樣蛋白Aβ入侵線粒體，促使線粒體產生超氧自由基，進而將其轉化為過氧化氫，導致氧化應激產生，激活JNK/MAPK信號通路，進一步引起NFkB釋放炎癥相關的白介素和細胞因子。

不健康的飲食結構和營養搭配影響阿爾茨海默病發病進程，因此，從營養干預角度出發減輕阿爾茨海默病并發癥并減緩阿爾茨海默病發病進程急需重視。以橄欖為食材制造食品是地中海飲食的標志，有助于降低認知損傷及阿爾茨海默病。前期研究發現具有抗氧化功能的多酚類化合物羥基酪醇作為橄欖類制品的重要生物活性成分，在多種疾病模型例如肥胖、糖尿病、肌肉萎縮、產前應激中顯著調控氧化應激、線粒體功能障礙、及神經毒性損傷。

技術實現要素：

本發明解決的問題在于提供一種羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應用，穿越血腦屏障的羥基酪醇分子靶向腦內線粒體，修復線粒體功能，以JNK/MAPK為靶點改善神經炎癥，從而達到改善阿爾茨海默病的目的。

本發明是通過以下技術方案來實現：

羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應用。

所述的藥物是口服藥物，該藥物能夠穿越血腦屏障，提高腦組織中羥基酪醇含量。

所述的藥物是改善神經功能、改善學習認知能力的藥物。

所述的藥物是改善神經細胞線粒體功能的藥物。

所述的藥物是不影響Aβ的積累加工，逆轉腦組織的線粒體功能障礙、恢復線粒體蛋白羰基化異常的藥物。

所述的藥物是提高抗氧化損傷能力，提高SOD-2蛋白表達的藥物。

所述的藥物是改善腦內炎性損傷的藥物。

所述的藥物是通過調控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經炎癥信號，修復神經功能損傷的藥物。

羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的保健品、功能性食品或飲料中的應用。

羥基酪醇在制備靶向JNK/MAPK信號通路以改善腦內炎性損傷的藥物、保健品、功能性食品或飲料中的應用。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

羥基酪醇源于天然營養素，安全性高，對人體無毒副作用。地中海飲食相同日攝取劑量的羥基酪醇可穿越血腦屏障改善阿爾茨海默病小鼠神經功能；羥基酪醇顯著改善由Aβ所引起的線粒體氧化應激，修復阿爾茨海默病小鼠腦內線粒體功能；通過調控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經炎癥信號，從而達到修復阿爾茨海默病的神經功能損傷的作用，達到改善阿爾茨海默病的目的，在防治阿爾茨海默病相關的保健食品及藥物的應用中具有良好的前景。

附圖說明

圖1A～圖1D表示羥基酪醇穿越血腦屏障改善阿爾茲海病小鼠神經功能。

圖2A～圖2D表示羥基酪醇不影響Aβ加工。

圖2E是Aβ降解酶IDE的mRNA表達檢測結果。

圖3A～圖3G表示羥基酪醇顯著改善線粒體功能障礙。

圖4A～圖4E表示羥基酪醇作用JNK/MAPK信號通路顯著修復阿爾茨海默小鼠腦內炎性損傷。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。

本發明發現在給予羥基酪醇之后，羥基酪醇可穿越血腦屏障提高腦組織的羥基酪醇含量，顯著改善阿爾茨海默病小鼠腦神經功能及學習記憶能力。而且，羥基酪醇還可以逆轉阿爾茨海默小鼠腦內的線粒體功能障礙及線粒體蛋白羰基化異常，提高SOD-2蛋白表達，進而改善二項酶系統穩態。更為重要的是，由于阿爾茨海默病腦內存在長期炎癥損傷，在羥基酪醇的干預下，以JNK/MAPK為靶點，阿爾茨海默病小鼠腦內炎性損傷顯著得到改善，達到預防和治療阿爾茨海默病發生與發展的作用。下面基于動物實驗模型來對本發明進行詳細的說明。

1、動物飼養及藥物處理

實驗組APP/PS1轉基因雌性小鼠、對照野生型C57雌性小鼠購自國家遺傳工程小鼠資源庫。小鼠飼養在可控溫度(23度到25度)和濕度(60％)的房間內，房間的燈光維持在12小時白天、12小時黑夜的循環中，在實驗進行中小鼠能夠自由進食和進水。

APP/PS1是家族性阿爾茨海默病轉基因小鼠模型，通過在C57BL/6J小鼠中同時表達人早老素PS1基因和嵌合淀粉樣前提蛋白APPswe基因繁殖篩選而成。從3月齡(Aβ沉積起始月齡)起至9月齡結束(小鼠出現顯著阿爾 茨海默病癥狀)，對APP/PS1轉基因阿爾茨海默病模型小鼠進行6個月的羥基酪醇灌胃處理，羥基酪醇劑量為5mg/kg小鼠/天，該劑量根據地中海飲食中每天羥基酪醇的攝取量換算而來。

實驗小鼠分為三組：1.野生型C57BL/6J小鼠；2.AD模型APP/PS1小鼠，灌胃等體積生理鹽水；3.APP/PS1小鼠，灌胃等體積羥基酪醇5mg/kg小鼠/天。飼喂結束后，通過腦電學檢測方法檢測小鼠神經功能，Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力，免疫熒光染色、蛋白印記、RT-PCR、及ELISA等生物化學及分子生物學方法檢測Aβ前體蛋白加工過程、線粒體功能、炎癥信號。

2、腦內羥基酪醇濃度檢測

小鼠腦內羥基酪醇濃度采用液相色譜-質譜/質譜聯用方法(AgilentTechnologies,Waldbronn,Germany)，檢測方式為多重反應監測方法，用于定量分析的離子反應為：m/z 153.1→m/z 123.1。

圖1A為腦組織中羥基酪醇含量的檢測結果，橫坐標為各處理組：AD表示阿爾茨海默病小鼠、HT表示羥基酪醇，縱坐標為羥基酪醇的含量；結果顯示阿爾茨海默病小鼠灌胃羥基酪醇后，每克腦組織中羥基酪醇含量可達8.19±3.77ng/mL，而未飼喂羥基酪醇的阿爾茨海默病小鼠每克腦組織中羥基酪醇含量僅為2.14±0.34ng/mL(羥基酪醇為腦內多巴胺代謝物之一，因此未經飼喂的小鼠腦內仍可檢測出少量羥基酪醇)。

圖1B為模型小鼠的頻率檢測結果，橫坐標為頻率，縱坐標為不同頻率下的功率譜；結果顯示阿爾茨海默病小鼠Delta波段功率譜較高，Theta，Alpha，Beta波段功率譜降低，與阿爾茨海默病患者腦內結果一致，羥基酪醇改善不同波段功率譜。

3、神經功能及學習記憶能力測試

學習記憶能力的下降是AD病人的臨床特征，為了檢測HT是否具有減 緩AD神經損傷的作用，以進行了神經功能及學習記憶能力測試。

神經功能通過腦電描記法進行檢測，記錄特定頻率范圍為2.8-4Hz(Delta),4-5.5Hz(Theta 1),5.5-8Hz(Theta 2),8-30Hz(Alpha and Beta)的功率譜。學習記憶能力通過Morris水迷宮方法進行檢測，連續6天記錄小鼠從不同象限放入迷宮后游向固定象限水下平臺的時間和路程，后對其進行統計學分析。

圖1C為水迷宮實驗中，小鼠在訓練的六天內游向平臺的路程的檢測結果，其中橫坐標為訓練天數，縱坐標為游泳距離。圖1D為圖1C的統計圖，經過圖1C計算曲線下面積所得。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為曲線下面積。結果顯示，在給予羥基酪醇灌胃處理之后模型小鼠的在水迷宮實驗中的路程顯著增強，其學習能力得到了提高。

結果顯示，APP/PS1是小鼠模型較好的模擬了阿爾茨海默病，而在飼喂羥基酪醇之后，羥基酪醇能夠穿越血腦屏障從而增加腦組織中羥基酪醇含量，而訓練結果表明羥基酪醇的增加能夠改善小鼠模型的學習能力，能夠改善阿爾茨海默病小鼠的神經功能。

4、Aβ檢測

研究發現，Aβ斑塊是AD的經典病理特征，為了檢測HT是否影響A否積累加工，下面進行Aβ檢測。

免疫熒光染色石蠟固定的腦組織切片，激光共聚焦顯微鏡分析皮層及海馬部位Aβ形態學沉積。Aβ沉積數量通過ELISA試劑盒(Invitrogen,Camarillo,CA,USA)進行檢測量化。Aβ前體蛋白AβPP及加工產物BACE通過免疫印跡檢測并量化，Aβ降解酶NEP和IDE分別通過免疫印跡和實時定量PCR檢測并量化。

圖2A為免疫熒光染色石蠟固定的腦組織切片，結果顯示在正常C57小鼠腦海馬和皮層部位均無Aβ斑塊，阿爾茨海默病小鼠和灌胃羥基酪醇的阿 爾茨海默病小鼠腦海馬和皮層部位有Aβ斑塊，但無組間差異。

圖2B為ELISA檢測Aβ斑塊數量的結果圖，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標Aβ40、Aβ42分別為Aβ的兩種亞型；結果顯示經ELISA檢測Aβ斑塊數量在灌胃羥基酪醇和生理鹽水兩組對比中無顯著差異。

圖2C為蛋白免疫印跡法檢測的AβPP、BACE、NEP的蛋白表達結構，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為蛋白名稱，AβPP是Aβ前體蛋白，BACE是AβPP加工成Aβ的中間產物；NEP是Aβ降解酶。圖2D是圖2C的統計學結果。

圖2E是Aβ降解酶IDE的mRNA表達檢測結果。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為IDE的mRNA水平。結果顯示IDE的mRNA表達并沒有顯著的變化，

結果表明，APP/PS1小鼠模型在飼喂羥基酪醇之后，羥基酪醇不影響Aβ積累加工，包括其前體、降解酶都沒有特別的差異。

5、線粒體功能檢測

研究發現Aβ能夠引起氧化壓力，因此，下面檢測了蛋白、脂質氧化水平，以進一步檢測AβPP引起的氧化壓力是否涉及到線粒體功能的損傷，我們進行了線粒體復合物表達和活性的檢測。

線粒體氧化損傷通過蛋白羰基化試劑盒記性檢測(Cell Biolabs,SanDiego,CA,USA)；圖3A中橫坐標為各處理組，縱坐標為線粒體蛋白羰基化水平。結果顯示線粒體蛋白羰基化水平在阿爾茨海默病小鼠中較高，給予羥基酪醇處理后可將羰基化蛋白水平恢復至與正常小鼠相當。圖3B是圖3A的統計圖。

抗氧化活力通過ELISA檢測4-羥基壬稀酸(4-HNE，RD systems,Minneapolis,MN,USA)、谷胱甘肽(GSH，Beyotime,Jiangsu,China)、氧化型谷胱甘肽(GSSG，Beyotime,Jiangsu,China)。

圖3C顯示4-HNE水平在阿爾茨海默病小鼠腦組織中較高，羥基酪醇處理可將4-HNE水平恢復至與正常小鼠相當。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為4-HNE的量。

圖3D顯示羥基酪醇處理顯著提高GSH水平，降低氧化型GSSG，同時GSH和GSSG的比值也顯著升高。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標分別為GSH、GSSG含量及二者的比值。

圖3E顯示免疫印跡法檢測的線粒體相關蛋白表達，阿爾茨海默病小鼠腦內SOD-2表達水平較低，HO-1表達水平較高，羥基酪醇處理后將蛋白表達量恢復至正常小鼠腦內水平。圖3F是圖3E的統計圖，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為蛋白名稱。

線粒體復合物活性通過分光光度法檢測。

圖3G顯示線粒體復合物I，II，III，IV活力變化，阿爾茨海默病小鼠復合物I活力較高，復合物II，III，IV活力較低，羥基酪醇處理后，復合物I，II，III，IV活力都得到顯著恢復。其中，橫坐標分別表示復合物I，II，III，IV，縱坐標表示復合物活力值相對于正常組的活力變化。

6、神經炎癥分子檢測

NFκB是AD炎癥激活的關鍵分子，JNK/MAPK是NFκB的上游信號分子，為了檢測HT是否能夠減緩AD炎癥信號，下面進行NFκB，JNK/MAPK信號分子的檢測。采用蛋白免疫印跡法檢測JNK/MAPK信號通路分子p-JNK、p-ERK、p-p38、NFkB，以及炎性小體Caspase 1、Cleaved caspase 1，IL-18，以管家基因Actin作為參照；實時定量PCR檢測白介素和細胞因子：IL-6、COXII。

圖4A顯示免疫印跡法檢測的JNK/MAPK信號通路標志蛋白表達水平，JNK，ERK，p38，NFkB磷酸化水平在阿爾茨海默病小鼠中顯著升高，而羥基酪醇處理降低以上蛋白的磷酸化水平。圖4B是圖4A的統計圖。其中，橫 坐標是各處理組，縱坐標是蛋白名稱。

圖4C顯示炎性小體蛋白免疫印跡表達，阿爾茨海默病小鼠中Caspase-1和IL-18表達水平顯著升高，羥基酪醇飼喂后，Caspase-1，Cleaved caspase-1，IL-18表達水平顯著降低。圖4D是圖4C的統計圖。其中，橫坐標是各處理組，縱坐標是蛋白表達含量相對于正常組的百分比。

圖4E顯示炎性相關白介素和細胞因子IL-6，COXII的mRNA水平，阿爾茨海默病小鼠炎性反應明顯，有較高的IL-6和COXII水平，羥基酪醇灌胃后IL-6和COXII水平恢復至正常小鼠水平。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為白介素和細胞因子名稱。

結果表明羥基酪醇作用JNK/MAPK信號通路顯著修復阿爾茨海默小鼠腦內炎性損傷。

7、統計學分析

以上所有統計學結果采用均值±平均數標準誤差，組間差異分析方法采用單因素方差分析或雙因素方差分析，統計學分析顯著性標準定為p<0.05。

通過以上試驗結果證明羥基酪醇能有效穿越血腦屏障，在不影響Aβ加工的條件下，通過調控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經炎癥信號，從而達到修復阿爾茨海默病的神經功能損傷的作用。為制備阿爾茨海默病相關保健食品及藥物提供科學依據。羥基酪醇作為食物中的功能分子，其有效作用濃度低，長期服用無毒副作用，應用前景廣闊。

以上給出的實施例是實現本發明較優的例子，本發明不限于上述實施例。本領域的技術人員根據本發明技術方案的技術特征所做出的任何非本質的添加、替換，均屬于本發明的保護范圍。