本發明涉及管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物的新用途。

背景技術：

血管生成(angiogenesis)是指在原有微血管的基礎上，通過內皮細胞遷移、增殖、分化及細胞外基質的降解，并在相關信號通路的調控下，以芽生、橋聯、或者套疊方式形成新生血管的調控過程，分為生理性血管生成和病理性血管生成。生理性血管生成是一個有序的調控過程，只發生在機體胚胎發育、組織損傷修復等特定的時期和部位。病理性血管生成則與腫瘤、糖尿病視網膜病、類風濕性關節炎、前列腺增生和銀屑病等一系列血管生成依賴性疾病相關。

例如，腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管生成。在前血管期，腫瘤主要依靠彌散的方式獲得營養和排泄廢物，當其生長到一定體積時，彌散方式不能滿足其生長所需，腫瘤細胞會通過分泌多種促血管生成因子，促進內皮細胞增殖、遷移，以形成新生血管為其提供營養和排除代謝產物。同時，內皮細胞也能通過旁分泌的方式直接促進腫瘤細胞的生長。因此，血管生成抑制劑是除細胞毒藥物之外，抗腫瘤藥物研究的重要領域。

根據腫瘤血管生成抑制劑的作用機制和靶點不同，可分為間接血管生成抑制劑和直接血管生成抑制劑。間接血管生成抑制劑主要通過選擇性地抑制一種或幾種促血管生成因子，或通過阻斷促血管生成因子的下游信號通路而發揮作用。直接血管生成抑制劑則通過作用于腫瘤血管內皮細胞，抑制其增殖、遷移和形成新生血管。由于這類藥物直接作用于基因遺傳穩定的內皮細胞而非腫瘤細胞，其產生耐藥性的可能性也較小。

因此，探索可以作為血管生成抑制劑類的藥物，具有重要的現實意義。

技術實現要素：

本發明提供了管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物在制備血管生成抑制劑類藥物中的用途。

進一步地，所述的藥物是治療腫瘤、糖尿病視網膜病、類風濕性關節炎、前列腺增生或銀屑病的藥物。

進一步地，所述提取物中，松果菊苷和麥角甾苷的質量分數之和不低于75％；優選不低于79％。

進一步地，所述提取物中，松果菊苷的質量分數不低于63％，麥角甾苷的質量分數不低于12％；優選的，松果菊苷的質量分數不低于66％，麥角甾苷的質量分數不低于13％。

本發明還提供了一種血管生成抑制劑，它是以管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物，或其藥學上可接受的鹽為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。

進一步地，所述制劑是注射制劑或口服制劑。

進一步地，所述血管生成抑制劑是治療腫瘤、糖尿病視網膜病、類風濕性關節炎、前列腺增生或銀屑病的藥物。

進一步地，所述提取物中，松果菊苷和麥角甾苷的質量分數之和不低于75％；優選不低于79％。

進一步地，所述提取物中，松果菊苷的質量分數不低于63％，麥角甾苷的質量分數不低于12％；優選的，松果菊苷的質量分數不低于66％，麥角甾苷的質量分數不低于13％。

經試驗證明，管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物可以有效抑制血管內皮細胞的增殖，可以作為血管生成抑制劑，用于治療腫瘤、糖尿病視網膜病、類風濕性關節炎、前列腺增生或銀屑病等血管生成依賴性疾病，具有廣闊的市場前景。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1：Hoechst33342染色法檢測凋亡細胞的形態(200×)。

圖2：Annexin V-FITC/PI雙染法檢測EA.hy926細胞凋亡率。

具體實施方式

實施例1管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物對血管內皮細胞EA.hy926的增殖抑制和凋亡誘導作用

1儀器與試藥

多功能酶標儀(Synergy HT公司)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；FACScalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司)。RPMI 1640培養基(Gibco公司)；胎牛血清(MDgenics公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；Hoechst33342染色液、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(碧云天公司)。

2方法與結果

2.1藥物制備

參考文獻方法(王毓杰.管花肉蓯蓉中苯乙醇苷的提取和大孔樹脂純化工藝研究[J].中草藥,2014,45(16):2344-2348):管花肉蓯蓉藥材加12倍量50％乙醇，70℃溫浸2次，溫浸時間1h，濾過，合并濾液，回收溶劑，加水調整為含生藥0.2g/mL的上樣溶液，上樣量為0.8倍柱體積(BV)，大孔樹脂柱的徑高比為1∶9，先用3BV的水除雜，再用4BV的30％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮至干，即得肉蓯蓉苯乙醇苷純化物，該純化物中2種苯乙醇苷質量分數＞75％。精密稱取肉蓯蓉苯乙醇苷提取物適量，加DMSO和PBS的混合溶劑(1:7)溶解，過濾除菌，實驗前用10％培基稀釋成濃度為2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含藥培養基。

2.2細胞培養

人臍靜脈內皮細胞EA.hy926來源于ATCC。細胞接種于含完全培養基的培養瓶中，37℃，5％CO₂培養箱中培養，每2天換液，至視野下細胞密度70～80％時，以1:6傳代。

2.3CCK-8法測定細胞增殖抑制率

取對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后計數，調整細胞濃度為4×10⁴個/mL，接種于96孔培養板，每孔100μL。細胞接種24h后，吸棄培養基，對照組加入不含藥物的培養基，而藥物組分別加濃度為2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含藥培養基，設不加細胞只加培養液的空白對照孔與實驗孔平行，細胞繼續培養24h后，吸棄上清液，并用PBS洗滌兩次。每孔分別加入含有CCK-8的培養基100μL(CCK-8試劑加培養基稀釋成10％濃度)，37℃培養2h，在450nm測定吸光度(A)。細胞生長抑制率(％)＝(A_對照-A_藥物)/(A_對照-A_空白)×100％，以Bliss法計算半數抑制濃度(IC₅₀)。如表1所示，與對照組相比，11.5、23和46μg·mL^-1提取物能顯著抑制細胞增殖(P<0.01)，呈現一定的量效關系。提取物作用24h的IC₅₀值為30.61μg·mL^-1。

表1肉蓯蓉苯乙醇苷提取物對EA.hy926細胞增殖的抑制作用

注：與對照組比較：^*P<0.05^**P<0.01

2.4 Hoechst33342法檢測細胞凋亡形態

EA.hy926細胞以2×10⁴個/孔接種于48孔板，24h貼壁后，分別加濃度為2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含藥培養基繼續培養48h，加PBS洗滌兩次，每次5min；4％多聚甲醛室溫固定15min后，再加PBS洗滌兩次，每次5min；加10μg·mL^-1的Hoechst33342染核，室溫避光處理5min；再用PBS洗滌兩次，每次5min；置倒置熒光顯微鏡下觀察，將亮藍色，細胞核固縮的細胞判斷為Hoechst33342陽性細胞。如圖1所示，對照組無明顯凋亡細胞，藥物組細胞呈現細胞核濃染和固縮現象，形成新月形細胞核，且隨著提取物濃度的增加，細胞核皺縮更明顯。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

EA.hy926細胞接種于6孔板，貼壁24h后，加不同濃度藥物作用48h，收集上清，加胰酶消化細胞，加入原上清終止消化，輕輕吹打混勻細胞，2000r·min^-1離心5min，棄上清，加PBS重懸，2000r·min^-1離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加5μL Annexin V-FITC混勻，避光孵育10min，再次2000r·min^-1離心5min，加190μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，測定前加10μLPI，混勻后于0.5h內測定。同時分別以只加Annexin V-FITC或PI作為單標對照，只加PBS作為空白對照。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡和壞死細胞。本文件中，將右下象限和右上象限之和作為總的細胞凋亡率。如圖2所示，對照組細胞凋亡率為5.46％，經苯乙醇苷提取物作用48h后，不同濃度藥物組的細胞凋亡率逐漸增加，分別為8.52％、11.39％、14.20％和14.38％，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，呈現一定的量效關系。

2.6統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件處理實驗數據。數據以均數±標準差(x±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)。P<0.05表示有統計學意義。

試驗顯示，肉蓯蓉苯乙醇苷提取物能夠抑制血管內皮細胞增殖，其作用24h的IC₅₀值為30.61μg·mL^-1。Hoechst33342染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法結果顯示，藥物組細胞呈現核固縮和濃染等凋亡特征，細胞凋亡率隨著提取物濃度的增加逐漸增加，提示苯乙醇苷提取物對內皮細胞的增殖抑制與其促凋亡作用有關。

綜上所述，管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物可以有效抑制血管內皮細胞的增殖，可以作為血管生成抑制劑，用于治療腫瘤、糖尿病視網膜病、類風濕性關節炎、前列腺增生或銀屑病等血管生成依賴性疾病，具有廣闊的市場前景。