本申請涉及一種促進神經修復的植入式電極材料，特別涉及一種能利用外源電刺激促進神經干細胞定向分化的高效神經修復材料。

背景技術：

隨著生物材料學的發展，神經電極的各種性能在不斷提高，但是其生物相容性問題嚴重地阻礙了植入式神經電極的發展。為了增強植入式電極的組織相容性，減輕炎癥反應，研究者研究了很多新的電極材料和電極界面的修飾技術。目前，尚未見報道采用氧化銥作為導電涂層，利用聚多巴胺作為黏性因子，將細胞粘附蛋白（laminin）固定到氧化銥表面制備神經電極的方法。

氧化銥具有良好的抗腐蝕性能和生物相容性，它的可逆電化學反應特性可提供高安全注入電荷量和低電極阻抗。多巴胺在堿性水溶液條件下能發生氧化自聚合反應，在聚合物、金屬、陶瓷、玻璃等一系列固體材料表面能形成一層薄的、強黏性的聚多巴胺包覆層。聚多巴胺層富含的官能團還能與含有氨基（-NH2）、巰基（-SH）等基團的生物活性分子發生邁克爾加成反應或希夫堿反應，有利于生物活性分子的固定，使材料表面進一步功能化。尤其是將生物活性分子細胞粘附蛋白（laminin）連接在聚多巴胺層后，可使材料表面獲得促細胞粘附的能力，并且能誘導促進神經細胞的繁殖及神經細胞軸突的生長，可用于神經組織修復。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用于促神經修復的植入式神經電極的制備方法。 本發明的制備方法包括如下步驟：

（1）采用射頻磁控濺射在導電玻璃（ITO）基底材料上制備銥薄膜：將經過丙酮，無水乙醇，去離子水分別超聲清洗8 ~ 20 min之后的導電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空。通入氬氣，輸入功率使氬氣電離、起輝，調節適當的壓力，開始銥薄膜的濺射。制備所得銥電極。

（2）利用循環伏安掃描活化得到氧化銥涂層：將步驟（1）中所得的銥電極清洗干燥后，放于電解槽的活化溶液中。通過參比電極與輔助電極以及待活化銥電極構成的回路，施加極化?時間三角波形進行活化處理。活化所得即為氧化銥電極。

（3）通過多巴胺的氧化自聚合在氧化銥表面形成納米級聚多巴胺包覆層：將步驟（2）中所得的氧化銥電極清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中（pH = 8 ~ 9），室溫放置，經過特定時間的氧化聚合反應，得到的即為表面包覆聚多巴胺的氧化銥復合電極。

（4）配制1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合溶液：分別將EDC和NHS溶于pH為7 ~ 8的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下混合均勻，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。

（5）配制細胞粘附蛋白（laminin）溶液：將laminin溶于上述步驟（5）中所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下混合均勻，得到一定濃度的laminin溶液。

（6）連接細胞粘附蛋白于表面包覆聚多巴胺的氧化銥復合電極上：將所制備的氧化銥復合電極清洗干燥后，室溫浸泡于上述步驟（5）中所配制的細胞粘附蛋白（laminin）溶液中，經過特定時間的二次功能化反應，得到的即為具有生物活性的氧化銥復合電極。

本發明使具有良好的抗腐蝕性能和生物相容性的氧化銥材料和具有超強黏附性能的多巴胺，以及細胞粘附蛋白laminin復合在一起，形成了表面均勻且具有良好生物活性的復合電極，極大程度上實現了性能互補，成為了一種很有應用價值的新型生物醫用材料，尤其可應用于利用外源電刺激調控神經干細胞（NSCs）的定向分化。

附圖說明

圖1為實施例二的以導電玻璃為基底，以氧化銥為導電涂層，以聚多巴胺為介質連接有濃度為20 μg/mL 的細胞粘附蛋白（laminin）的電極的場發射掃描電鏡圖。

圖2分別為實施例一、例二、例三的以導電玻璃為基底，以氧化銥為導電涂層，以聚多巴胺為介質連接有濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的細胞粘附蛋白（laminin）的氧化銥復合電極上神經元細胞貼附圖片。由圖可見，隨著細胞粘附蛋白（laminin）的濃度的增大，細胞貼附的數目逐漸增多，且細胞狀態逐漸舒展。說明所制備的電極材料的促細胞貼附性能較好。

圖3為實施例二的以導電玻璃為基底，以氧化銥為導電涂層，以聚多巴胺為介質連接有濃度為20 μg/mL的細胞粘附蛋白（laminin）的氧化銥復合電極上神經元細胞活死染色圖片。通過陰性對照、陽性對照以及實驗組材料的細胞毒性結果的對比，由圖可見，種植在所制備的電極材料的表面的細胞在分別增殖至24 h，48 h時，生長狀態良好。說明所制備的電極材料具有相當好的生物相容性。

具體實施方式下面結合實例和附圖對本發明作進一步的描述。

實施例一

將經過丙酮，無水乙醇，去離子水分別超聲清洗15 min之后的導電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在50 sccm，調節壓力至3.2×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射15 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置18 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為30 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下搖晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下搖晃后，得到10 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中18 h。用去離子水輕輕沖洗樣品1 min，隨后用氮氣吹干。得到具有生物活性的復合電極材料。

將神經元細胞種植在所制備的復合電極材料表面，培養后觀察細胞貼附情況。

實施例二

將經過丙酮，無水乙醇，去離子水分別超聲清洗10 min之后的導電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在40 sccm，調節壓力至3×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射10 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置24 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為37 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下搖晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下搖晃后，得到20 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中24 h。用去離子水輕輕沖洗樣品2 min，隨后用氮氣吹干。得到具有生物活性的復合電極材料。

將神經元細胞種植在所制備的復合電極材料表面，培養后觀察細胞貼附情況以及細胞毒性檢測。

實施例三

將經過丙酮，無水乙醇，去離子水分別超聲清洗20 min之后的導電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在50 sccm，調節壓力至3.2×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射20 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置24 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為37 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下搖晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下搖晃后，得到40 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中24 h。用去離子水輕輕沖洗樣品3 min，隨后用氮氣吹干。得到具有生物活性的復合電極材料。

將神經元細胞種植在所制備的復合電極材料表面，培養后觀察細胞貼附情況。