本發(fā)明涉及黃芪甲苷的新應(yīng)用，更具體的說，涉及黃芪甲苷在制備預(yù)防和治療2型糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的重要并發(fā)癥，并逐漸成為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的主要致病因素。Akt及其相關(guān)信號通路(mTOR,NFκB和Erk1/2)的功能紊亂在DN的進(jìn)展中起到重要作用。

黃芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)是從中藥黃芪提取出來的有效單體化合物，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體的抗病能力。中國CN 1569884A號發(fā)明專利公開了一種黃芪甲苷的制法及在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用，通過腹腔注射高劑量鏈脲霉素(STZ)的方式構(gòu)造1型糖尿病腎病大鼠模型，并通過灌胃給藥黃芪甲苷的治療實驗，證明黃芪甲苷對1型DN具有一定的保護(hù)作用，然而，對于2型DN尚未有研究報道。1型糖尿病腎病為胰島素依賴性糖尿病，2型糖尿病腎病為非胰島素依賴性糖尿病，二者在發(fā)病機(jī)制、診斷及治療策略上有本質(zhì)的不同。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于黃芪甲苷對于2型DN的研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對2型DN具有較強(qiáng)的防治作用，本發(fā)明的目的在于提供一種黃芪甲苷在制備預(yù)防和治療2型糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明為了達(dá)到上述目的，提供如下技術(shù)方案：

1、研究AS-IV治療對db/db小鼠尿白蛋白排泄率的影響；

2、研究AS-IV治療對db/db小鼠生理及代謝指標(biāo)的影響；

3、研究AS-IV治療對db/db小鼠改善腎小球損傷的影響；

4、研究AS-IV治療對db/db小鼠改善腎小管損傷的影響；

5、研究AS-IV治療對db/db小鼠Akt及其相關(guān)信號通路的影響；

6、研究AS-IV治療對db/db小鼠肝功能的影響；

實施本發(fā)明，具有如下有益效果：本發(fā)明旨在探討黃芪甲苷對2型DN的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，結(jié)果顯示：黃芪甲苷可減少2型糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白排泄率，改善腎小球及腎小管病理損傷，減少尿液NAG,NGAL和TGF-β1的排泄，黃芪甲苷亦能抑制Akt/mTOR、NFκB、Erk1/2信號通路的活化，并沒有表現(xiàn)明顯的肝毒性。根據(jù)上述研究可以得出結(jié)論：黃芪甲苷對2型DN具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制Akt/mTOR、NFκB、Erk1/2信號通路有關(guān)。使用現(xiàn)有的制備工藝將黃芪甲苷制成口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或者經(jīng)皮給藥劑型的藥物，或者片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、貼劑或者凝膠劑的藥物，可以用于預(yù)防和治療2型糖尿病腎病。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：

圖1為黃芪甲苷對小鼠的尿白蛋白排泄率的影響結(jié)果，圖1(a)為黃芪甲苷對小鼠的尿白蛋白排泄率的影響結(jié)果，圖1(b)為黃芪甲苷對小鼠肌酐清除率的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，*P<0.05，***P<0.001；與db/db組比較，^﹟P<0.05，^﹟﹟﹟P<0.001；

圖2為黃芪甲苷對小鼠代謝指標(biāo)的影響結(jié)果，圖2(a)為黃芪甲苷對小鼠血糖的影響結(jié)果，圖2(b)為黃芪甲苷對小鼠糖化血紅蛋白的影響結(jié)果，圖2(c)為黃芪甲苷對小鼠尿糖的影響結(jié)果，圖2(d)為黃芪甲苷對小鼠血清胰島素的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，**P<0.01，***P<0.001；

圖3為黃芪甲苷對小鼠生理指標(biāo)的影響結(jié)果，圖3(a)為黃芪甲苷對小鼠體重的影響結(jié)果，圖3(b)為黃芪甲苷對小鼠腎重的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，***P<0.001；

圖4為黃芪甲苷對小鼠腎小球損傷的影響結(jié)果，圖4(a)為黃芪甲苷對小鼠腎小球血管襻面積的影響結(jié)果，圖4(b)為黃芪甲苷對小鼠腎小球血管襻體積的影響結(jié)果，圖4(c)為黃芪甲苷對小鼠腎小球基底膜厚度的影響結(jié)果，圖4(d)為黃芪甲苷對小鼠足突寬度的影響結(jié)果，圖4(e)為PAS染色及電鏡顯示黃芪甲苷對小鼠腎小球的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，**P<0.01，***P<0.001；與db/db組比較，^﹟P<0.05，^﹟﹟﹟P<0.001；

圖5為黃芪甲苷對小鼠腎小球系膜基質(zhì)比例及纖維連結(jié)蛋白含量的影響結(jié)果，圖5(a)為黃芪甲苷對小鼠腎小球系膜基質(zhì)比例的影響結(jié)果，圖5(b)為黃芪甲苷對小鼠纖維連接蛋白(fibronectin)水平的影響結(jié)果，圖5(c)為免疫印跡實驗顯示黃芪甲苷對小鼠腎組織纖維連接蛋白的影響結(jié)果，圖5(d)為免疫組織化學(xué)染色顯示黃芪甲苷對小鼠纖維連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，*P<0.05，***P<0.001；

圖6為黃芪甲苷對小鼠腎小管損傷的影響結(jié)果，圖6(a)為黃芪甲苷對小鼠尿液NAG的影響結(jié)果，圖6(b)為黃芪甲苷對小鼠尿液NGAL的影響結(jié)果，圖6(c)為黃芪甲苷對小鼠尿液TGF-β1的影響結(jié)果，圖6(d)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管面積的影響結(jié)果，圖6(e)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管管腔面積的影響結(jié)果，圖6(f)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管管壁面積的影響結(jié)果，圖6(g)為黃芪甲苷對小鼠腎小管基底膜厚度的影響結(jié)果，圖6(h)為PAS染色及電鏡顯示黃芪甲苷對小鼠腎小管的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，**P<0.01，***P<0.001；與db/db組比較，^﹟P<0.05，^﹟﹟P<0.01；

圖7為黃芪甲苷對小鼠腎組織Akt及其相關(guān)信號通路的影響結(jié)果，圖7(a)為免疫印跡實驗顯示黃芪甲苷對Akt及其相關(guān)信號通路蛋白的影響結(jié)果，圖7(b)為黃芪甲苷對小鼠p-Akt的影響結(jié)果，圖7(c)為黃芪甲苷對小鼠p-mTOR的影響結(jié)果，圖7(d)為黃芪甲苷對小鼠p-NF-κB p65的影響結(jié)果，圖7(e)為黃芪甲苷對小鼠p-Erk1/2的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與db/db組比較，^﹟P<0.05，^﹟﹟P<0.01；

圖8為黃芪甲苷對小鼠肝功能的影響結(jié)果，圖8(a)為黃芪甲苷對血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的影響結(jié)果，圖8(b)為黃芪甲苷對小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的影響結(jié)果；其中，與wild type組比較，**P<0.01。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進(jìn)行具體描述。

早期DN主要表現(xiàn)為腎小球高濾過和微量白蛋白尿，其病理變化主要為腎小球、腎小管基底膜增厚及系膜擴(kuò)張。DN發(fā)病尚不明確，治療手段匱乏。Akt及其相關(guān)信號通路(mTOR,NFκB和Erk1/2)在細(xì)胞的生長和增殖中起到重要作用，Akt信號通路失調(diào)在人類癌癥、糖尿病、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也起到重要作用。最近研究顯示Akt過度激活與DN進(jìn)展密切相關(guān)，斯達(dá)汀、曲格列酮、雷帕霉素或者西羅莫司可通過抑制Akt及其相關(guān)信號通路過度激活起到對DN的腎臟保護(hù)作用。黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分，屬于皂甙類化合物，分子量為784.97kDa，具有抗炎、抗病毒、抗癌等作用。AS-IV主要用于心臟、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)，其作用機(jī)制與抑制Akt及其相關(guān)信號通路有關(guān)。現(xiàn)有的研究表明AS-IV對1型DN小鼠具有一定的腎臟保護(hù)作用，然而對于2型DN尚未有研究報道，其所應(yīng)用的1型DN動物模型與本發(fā)明中使用的2型DN模型在發(fā)病機(jī)制上有本質(zhì)的區(qū)別。

本發(fā)明旨在觀察AS-IV對2型DN腎病的保護(hù)作用及其對Akt相關(guān)信號通路的影響。

一、實驗方法

1、動物模型：八周齡雄性野生型小鼠(wild type)和db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/JNju)，購買于南京大學(xué)模式動物研究中心。動物研究實驗嚴(yán)格按照廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理相關(guān)準(zhǔn)則和條例進(jìn)行。實驗動物受控在恒定室溫20±1℃，12小時光照和12小時黑暗循環(huán)的條件下，同時自由攝食和飲水。實驗小鼠隨機(jī)分配到以下幾組(每組8-10只)：正常對照小鼠喂養(yǎng)常規(guī)食物(野生型小鼠作為正常組，即本發(fā)明圖表中wild type組)、db/db小鼠喂養(yǎng)常規(guī)食物(db/db組)、db/db小鼠喂養(yǎng)添加AS-IV的食物(db/db+AS-IV組)。AS-IV購買于成都ConBon生物科技有限公司(中國)，以1g/kg標(biāo)準(zhǔn)比例添加到小鼠的食物中。以上實驗處理持續(xù)12周。

2、生理和代謝參數(shù)：每兩周稱量小鼠體重，采用血糖儀(羅氏公司，巴塞爾，瑞士)測量各組小鼠的血糖，并用代謝籠(泰尼百斯，意大利)收集尿液。通過12周處理后，處死小鼠，并采集血樣和腎臟組織樣本。使用Ultra2糖化血紅蛋白分析儀測量糖化血紅蛋白(HbA_1C)的含量。采用羅氏全自動生化分析儀測量尿液和血液的生化指標(biāo)，包括尿肌酐、葡萄糖、NAG(尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶)，血肌酐、ALT、AST。肌酐清除率(Ccr)是通過尿肌酐×尿液體積×1000/血肌酐/1440計算得出，并用微升/每分鐘表示。

3、組織準(zhǔn)備：處死小鼠后，立即取出腎臟，稱重，在磷酸鹽緩沖液中沖洗，沿縱切面切取一定量腎臟組織用10％福爾馬林固定，并按照組織病理學(xué)和免疫組化的方法進(jìn)行研究。取1立方毫米的腎皮質(zhì)組織固定在2.5％戊二醛溶液中，隨后采用1％鋨酸處理，在電子顯微鏡下進(jìn)行分析。剩余的腎臟組織立即在液氮中冷凍并儲存在-80℃用于后續(xù)實驗研究。

4、光鏡：石蠟切片(4微米厚)采用PAS染色法用來評價腎小球和腎小管的病理損傷情況。使用4.10版本的NIS-Elements圖像處理軟件(尼康公司，日本東京)進(jìn)行圖片處理分析，每個切片測量40-50腎小球血管襻面積(glomerular tuft area，GTA)，20-30腎小球系膜基質(zhì)面積，80-100腎小管和腎小管管腔面積(長短軸比小于1.5)。通過威貝爾(Weibel)發(fā)明的方法測量腎小球血管襻體積(glomerular tuft volume，GTV)，這種測量方法僅需腎小球的隨機(jī)橫截面積的平均值并按照以下的公式計算：V_G＝Area^1.5×β/K，其中V_G是指腎小球體積，β＝1.38，和K(分配系數(shù))設(shè)定為1.10。腎小管管壁面積等于腎小管面積減去腎小管管腔面積。

5、免疫組化：腎組織石蠟切片(4微米厚)，脫蠟，水化，將切片放入煮沸的10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 6)中20分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)，后冷卻至常溫。通過3％過氧化氫處理10分鐘后，用山羊血清對切片進(jìn)行封閉處理30分鐘，隨后加入纖維連接蛋白一抗在4℃孵育過夜(ab2413，1：200，Abcam公司，英國劍橋)。緩沖液沖洗切片后，再加入HRP-聚合物偶聯(lián)的抗鼠/兔的lgG二抗(中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)在室溫孵育15分鐘，使用二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液作為顯示試劑，測定過氧化物酶活力。

6、ELISA：按照廠家說明書進(jìn)行ELISA實驗，檢測血清胰島素(德國默克公司)、尿白蛋白(美國Bethyl公司)、尿TGF-β1(達(dá)科為，中國深圳)和尿NGAL(美國R&Dsystem公司)的含量。

7、免疫印跡實驗(Western blot)：將冷凍的腎皮質(zhì)組織在裂解緩沖液中勻漿，平衡總蛋白濃度后通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將PVDF膜放入用含0.5g/l脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫反應(yīng)1小時，封閉膜上的非特異性位點，然后加入一抗，在4℃搖晃孵育過夜。洗滌后，采用ChemiDoc^TMMP成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)對蛋白條帶進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果使用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行比較。p-Akt(#4060)抗體,p-mTOR(#5536)抗體,p-NF-κB p65(#3033)抗體和p-Erk1/2(#4370)抗體均購于美國CST公司；β-actin抗體(A2228)購于美國西格瑪公司；纖維連接蛋白抗體(ab2413)購于英國Abcam公司。

8、統(tǒng)計分析

計量資料使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組樣本間的統(tǒng)計差異采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析，多組樣本之間的比較使用單因素方差分析，統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。P<0.05時視為在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

二、結(jié)果

1、AS-IV可減少db/db小鼠白蛋白尿的排泄率，對腎小球高濾過沒有改善作用

圖1為黃芪甲苷對小鼠的尿白蛋白排泄率的影響結(jié)果，圖1(a)為黃芪甲苷對小鼠的尿白蛋白排泄率的影響結(jié)果，圖1(b)為黃芪甲苷對小鼠肌酐清除率的影響結(jié)果；與wild type組小鼠比較，db/db組小鼠尿白蛋白明顯升高并逐漸增加，12周時，db/db小鼠腎小球濾過率明顯升高。AS-IV干預(yù)8周后，db/db+AS-IV組小鼠白蛋白排泄率明顯降低，該效果維持至12周。但是，經(jīng)過12周干預(yù)后，腎小球濾過率并沒有明顯下降。

2、生理及代謝指標(biāo)變化

表1示出了各組小鼠的新陳代謝特征，如表1所示，與wild type組小鼠相比，db/db組小鼠8周時顯示多飲多尿多便癥狀，AS-IV干預(yù)后這些癥狀明顯改善；圖2為黃芪甲苷對小鼠代謝指標(biāo)的影響結(jié)果，圖2(a)為黃芪甲苷對小鼠血糖的影響結(jié)果，圖2(b)為黃芪甲苷對小鼠糖化血紅蛋白的影響結(jié)果，圖2(c)為黃芪甲苷對小鼠尿糖的影響結(jié)果，圖2(d)為黃芪甲苷對小鼠血清胰島素的影響結(jié)果；0,2,4,6,8,10,12周時db/db小鼠血糖明顯升高，12周時糖化血紅蛋白也明顯升高。尿糖、血清胰島素水平12周時也明顯升高。AS-IV治療對血糖、糖化血紅蛋白、尿糖、血清胰島素?zé)o明顯影響。

表1新陳代謝特征(n＝8每組)

與wild type組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與db/db組比較，^﹟P<0.05,^﹟﹟P<0.01。

圖3為黃芪甲苷對小鼠生理指標(biāo)的影響結(jié)果，圖3(a)為黃芪甲苷對小鼠體重的影響結(jié)果，圖3(b)為黃芪甲苷對小鼠腎重的影響結(jié)果；與wild type組小鼠相比，db/db組小鼠體重和腎重明顯增大，AS-IV治療可以減輕體重和腎重，但并未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異。

3、AS-IV可改善腎小球損傷

圖4為黃芪甲苷對小鼠腎小球損傷的影響結(jié)果，圖4(a)為黃芪甲苷對小鼠腎小球血管襻面積的影響結(jié)果，圖4(b)為黃芪甲苷對小鼠腎小球血管襻體積的影響結(jié)果，圖4(c)為黃芪甲苷對小鼠腎小球基底膜厚度的影響結(jié)果，圖4(d)為黃芪甲苷對小鼠足突寬度的影響結(jié)果，圖4(e)為PAS染色及電鏡顯示黃芪甲苷對小鼠腎小球的影響結(jié)果；12周時，db/db小鼠腎小球血管襻面積和體積增大，腎小球基底膜增厚，足突變寬。AS-IV干預(yù)可改善這些變化。PAS染色及電鏡顯示各組變化特點。

圖5為黃芪甲苷對小鼠腎小球系膜基質(zhì)比例及纖維連結(jié)蛋白含量的影響結(jié)果，圖5(a)為黃芪甲苷對小鼠腎小球系膜基質(zhì)比例的影響結(jié)果，圖5(b)為黃芪甲苷對小鼠腎組織纖維連接蛋白水平的影響結(jié)果，圖5(c)為免疫印跡實驗顯示黃芪甲苷對小鼠腎組織纖維連接蛋白的影響結(jié)果，圖5(d)為免疫組織化學(xué)染色顯示黃芪甲苷對小鼠纖維連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果；與wild type組比較，db/db組腎小球系膜基質(zhì)比例及纖維連接蛋白表達(dá)均明顯增多，AS-IV干預(yù)可減少這些改變，但并未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異。

4、AS-IV改善腎小管損傷

圖6為黃芪甲苷對小鼠腎小管損傷的影響結(jié)果，圖6(a)為黃芪甲苷對小鼠尿液NAG的影響結(jié)果，圖6(b)為黃芪甲苷對小鼠尿液NGAL的影響結(jié)果，圖6(c)為黃芪甲苷對小鼠尿液TGF-β1的影響結(jié)果，圖6(d)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管面積的影響結(jié)果，圖6(e)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管管腔面積的影響結(jié)果，圖6(f)為黃芪甲苷對小鼠近端腎小管管壁面積的影響結(jié)果，圖6(g)為黃芪甲苷對小鼠腎小管基底膜厚度的影響結(jié)果，圖6(h)為PAS染色及電鏡顯示黃芪甲苷對小鼠腎小管的影響結(jié)果；12周時，與wild type組比較，db/db組NAG、NGAL、TGF-β1排泄均明顯增高，近端腎小管、管腔及管壁面積增大，腎小管基底膜明顯增厚。AS-IV治療可明顯減少NAG、NGAL、TGF-β1排泄，減小腎小管、管腔及管壁面積，減小基底膜厚度。

5、AS-IV抑制p-Akt(Ser473),p-mTOR(Ser2448),p-NF-κB p65(Ser536)和p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)的活化

圖7為黃芪甲苷對小鼠腎組織Akt及其相關(guān)信號通路的影響結(jié)果，圖7(a)為免疫印跡實驗顯示黃芪甲苷對Akt及其相關(guān)信號通路蛋白的影響結(jié)果，圖7(b)為黃芪甲苷對小鼠p-Akt的影響結(jié)果，圖7(c)為黃芪甲苷對小鼠p-mTOR的影響結(jié)果，圖7(d)為黃芪甲苷對小鼠p-NF-κB p65的影響結(jié)果，圖7(e)為黃芪甲苷對小鼠p-Erk1/2的影響結(jié)果；12周時，db/db小鼠腎皮質(zhì)p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、p-NF-κB p65(Ser536)和p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)含量明顯增加，AS-IV干預(yù)可明顯減少這些蛋白水平。

6、AS-IV干預(yù)12周后未顯示明顯肝毒性

圖8為黃芪甲苷對小鼠肝功能的影響結(jié)果，圖8(a)為黃芪甲苷對ALT的影響結(jié)果，圖8(b)為黃芪甲苷對小鼠AST的影響結(jié)果；12周時，db/db小鼠血生化顯示ALT、AST明顯升高，db/db+AS-IV組與db/db組無明顯差別。

上述實驗結(jié)果表明，黃芪甲苷作為中藥黃芪的主要活性成分，可減少2型糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白排泄率，改善腎小球及腎小管病理損傷，減少尿液NAG、NGAL和TGF-β1的排泄。黃芪甲苷亦能抑制Akt/mTOR、NFκB和Erk1/2信號通路的活化，并沒有表現(xiàn)明顯的肝毒性。綜上，黃芪甲苷對2型DN具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制Akt及其相關(guān)信號通路有關(guān)。

上面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式，上述的具體實施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。