技術領域
本發明涉及獸用藥技術領域，具體涉及一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物及其微膠囊劑的制備方法。
背景技術：
麻黃是《中國藥典》收錄的草藥，藥用來源為麻黃科植物草麻黃、中麻黃或木賊麻黃的干燥草質莖。秋季采割綠色的草質莖，曬干。其性溫，味辛、微苦，有發汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的功效，可治療風寒感冒、胸悶喘咳風水浮腫、支氣管哮喘等病癥。貫葉連翹屬于藤黃科金絲桃屬一種植物，為近年來全世界最暢銷的草藥之一，已被收載于美國藥典。我國傳統醫學視貫葉連翹為清煩心明視力、調經絡活氣血、解百毒消炎癥的良藥。現代大量中藥藥理學實驗證明它可以收縮血管進而升高血壓，利膽通便、抗菌消炎等作用，被用來治療黃疸、尿路感染。國際上多來治療多種疾病，如抑郁癥、腫瘤等。貫葉連翹現已被收入美國草藥藥典(AHP)，作為草藥非常難得，通常被用作食品添加劑，貫葉連翹提取物在美國市場份額的占有率逐年提高；在德國，被用作抗抑郁癥藥已超過 100 多年，貫葉連翹浸膏制劑已在德國抗中、輕度抑郁癥藥物市場市場份額中占據近 50%。其有效成分金絲桃素經研究發現是在貫葉連翹提取物中最具活性多樣性的物質，大量實驗證明，金絲桃素可以治療抑郁、抑制腫瘤、抗 DNA 和 RNA 病毒。大青葉有抗菌作用對病毒等也有抑制作用。大青葉還可對抗大腸桿菌內毒素的作用。蓼科及十字花科大青葉煎劑對動物有輕度抗炎作用，降低毛細血管通透性，增加白細胞吞噬作用，蓼藍葉煎劑能抑制離體兔腸，興奮離體豚鼠子宮，對家兔還有解熱作用。靛玉紅有抗癌作用。黃連的功效，清熱燥濕，瀉火解毒。用于濕熱痞滿，嘔吐，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，血熱吐衄，目赤吞酸，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿。酒黃連善清上焦火熱。用于目赤，口瘡。姜黃連清胃和胃止嘔。
微膠囊是指一種具有聚合物壁殼的微型容器或包裝物，具有半透性或密封性的微小粒子，其中被包裹的物質稱為芯材，包裹芯材的物質稱為壁材。微膠囊技術的研究始于20 世紀30 年代，由美國大西洋海岸漁業公司提出的制備魚肝油微膠囊的方法。1954 年美國NCR 公司的Green 采用復凝聚法成功制備出了含油的明膠微膠囊，并用于制備無碳復寫紙。由于具有能夠改變物料的狀態、質量、體積和性能，保護敏感成分，增強穩定性，控制芯材釋放，降低或掩蓋不良味道、降低揮發性，隔離組分等功能，微膠囊技術在食品、醫藥、紡織、涂料、農業、化妝品工業等方面得到廣泛的應用。隨著微膠囊技術的發展，微膠囊技術有了許多新的應用，如相變微膠囊、留香微膠囊、自修復微膠囊、緩釋微膠囊、納米微膠囊等，大大拓展了微膠囊技術的應用范圍。
技術實現要素：
本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物及其微膠囊劑的制備方法。
為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物，是由按照重量份計的以下組分制備得到的：麻黃提取物 0.1-1份、大青葉提取物0.1-1份、貫葉連翹提取物0.1-2份、金銀花提取物0.1-2份、黃連提取物0.1-2份。
進一步的，上述的一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物，是由按照重量份計的以下組分制備得到的：麻黃提取物 0.5份、大青葉提取物0.1份、貫葉連翹提取物1份、金銀花提取物2份、黃連提取物0.1份。
進一步的，上述的一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的劑型為微膠囊劑及常規任意一種劑型。
本發明的第二個目的是提供了上述一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物微膠囊劑的制備方法，按照重量份配比稱取各組分做為芯材，加少量無水乙醇溶解，逐步加到做為壁材的β-環糊精和變性淀粉的混合物中，膠體磨研磨后，于4℃下平衡12 h，回收乙醇，過濾干燥后即得到用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物微膠囊劑。
進一步的，上述的制備方法，所述微膠囊劑中的芯材含量按照重量百分比計為10-60%；所述膠體磨的研磨轉速為1200r/min，研磨溫度為20℃-60℃，膠體磨研磨時間為10-60min；所述β-環糊精和變性淀粉的質量比為（1-6）：（1-6）。
進一步的，上述的制備方法，所述微膠囊劑中的芯材含量按照重量百分比計為30%；所述膠體磨的研磨溫度為30℃，膠體磨研磨時間為30min；所述β-環糊精和變性淀粉的質量比為4：3。
在本發明的實施例試驗部分，將藥物組合物制備成注射劑，事實上，本發明藥物的劑型并不限于中獸藥微膠囊，也可采用常規的輔料將其制成片劑、粉劑等劑型。不同劑型藥物的治療效果相近。
本發明的有益效果為：本發明是將麻黃提取物、大青葉提取物、貫葉連翹提取物、金銀花提取物、黃連提取物進行組方制備中獸藥微膠囊，用于治療雞傳染性支氣管炎，具有非常好的效果，組方由天然產物組成，中獸藥微膠囊有掩味、緩釋作用，且不易出現殘留，具有明顯優勢，通過體外試驗及臨床藥效試驗，確定本發明的中獸藥組合物及劑型的臨床應用效果，為進一步推廣更多復方藥的應用，為相應企業開發高品質的產品提供新途徑，拓展藥物資源應用的新領域，研發抗畜禽病新藥提供良好基礎，具有較明顯的意義。
具體實施方式
實施例1：
本發明所用到的制劑含量及來源如表1所示。
表1
一種用于治療雞傳染性支氣管炎中獸藥微膠囊的制備方法：
中獸藥制劑成分復雜，且多數成分不清楚、作用機制不明確，由于畜禽給藥習慣和采用傳統制劑工藝，致使制劑外觀、粗、大、黑，起效緩慢，質量難以控制等，這不僅使畜牧養殖業抵制中獸藥的意識增強，還直接導致中獸藥在國際上的競爭力缺失，中獸藥治病多用復方，現代藥理學研究證明，其具有多種成分及多個靶點，特征，采用高新科學制藥技術，研究中獸藥效標成分和作用機理并按國際藥品標準進行生產，在尊重中獸藥用藥理論的基礎上，以提高中獸藥制劑臨床療效、降低毒副作用、擴大畜禽給藥途徑和用藥畜禽為目的進行劑型改革與制劑研究，是增強中獸藥國際競爭力，實現中獸藥制劑現代化的關鍵，中獸藥制劑研究是國內許多學者仍在積極探索的問題，如何解決中獸藥復方多種成分的作用及分析，建立優化組方的研究方法。將中獸藥理論與現代配伍組方相銜接，是今后需要面臨的重大研究課題，中獸藥有效成分、單方、復方在體內過程的動態變化，會直接影響中獸藥復方配伍的作用機制。總結出一種既能與國際動物醫藥接軌又不失中獸醫藥學本色的理論，這是中獸醫藥學能否走向世界的瓶頸問題，現代中獸藥研究領域已取得了不少令人矚目的成果，這一領域學者推崇的主要新觀念有分子中獸藥學、分子生藥學、中獸藥化學組學等。許多制藥高新技術在中獸藥制劑制備過程中得以應用，提高了中獸藥制劑質量及生物利用度。
目前，多數中獸藥有效成分都存在著穩定性差、苦味重等問題，而微膠囊化可以很好地保護色素免受光熱等條件氧化、分解及掩味，從而提高其穩定性和禽口服應用。本專利采用研磨法制備復方中獸藥微膠囊的制備方法，并優化其工藝條件，為復方中獸藥的廣泛應用提供一種新制劑。
1 材料與方法：
1.1 材料與試劑：
試劑：工業乙醇（95%）、變性淀粉、β-環糊精等試劑均為國產分析純。
1.2 儀器與設備：
JM-LB型瑞淼不銹鋼立式衛生型膠體磨：瑞淼（上海）不銹鋼設備有限公司；
ABBDHG-9240A 型電熱真空干燥箱：上海精宏試驗設備有限公司；
JA2003 電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；
DK-98-1 型電熱水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；
UV-2450 型紫外-可見分光光度計：日本島津。
1.3 方法：
1.3.1 中藥提取物的組方：
麻黃提取物 1kg，大青葉提取物1kg，貫葉連翹提取物1kg，金銀花提取物1kg，黃連提取物 1kg，將以上提取物在10L不銹鋼桶中，用攪拌棒攪拌30min，待均勻后，備用。
1.3.2復方中獸藥微膠囊的制備：
以膠體磨法制備微膠囊。稱取一定量用少量無水乙醇溶解的復方中獸藥，逐步加到一定濃度20%（W/W）和比例的β-環糊精和變性淀粉中，在膠體磨工作一定時間后，于4℃下平衡12 h，回收乙醇，過濾后，干燥后即得復方中獸藥微膠囊。然后將微膠囊表面的色素溶解后過濾定容，測定吸光度并計算包埋率，衡量微膠囊化程度。
1.3.3 復方中獸藥微膠囊化單因素試驗：
1.3.3.1 芯材與壁材的質量比對復方中獸藥微膠囊的影響：
復方中獸藥芯材的含量（W/W）分別為10%，20%，30%，40%，50%，60%。壁材β-環糊精和變性淀粉的質量比為4︰3，在30℃條件下膠體磨工作30 min，回收溶劑，干燥后得微膠囊，測定包埋率。
1.3.3.2 研磨溫度對復方中獸藥微膠囊穩定性的影響：
膠體磨工作溫度為：20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，芯材與壁材的質量比為3：7，β-環糊精和變性淀粉的質量比為4：3的條件下研磨30 min，制備微膠囊，測定包埋率。
1.3.3.3 膠體磨工作時間對復方中獸藥穩定性的影響：
膠體磨工作時間為：10 min，20 min，30 min，40min，50 min，60 min，芯材與壁材的質量比為3：7，β-環糊精和變性淀粉的質量比為4：3，在溫度為：30 ℃的條件下制備微膠囊，測定包埋率。
1.3.3.4 β-環糊精和變形淀粉的質量比對復方中藥穩定性的影響：
β-環糊精和變性淀粉的質量比分別為（1：6），（2：5），（3：4），（4：3），（5：2），（6：1），芯材與壁材的質量比為4：3，在30 ℃條件下研磨30 min，制備微膠囊，測定包埋率。
1.3.4 復方中獸藥微膠囊微膠囊正交試驗：
在單因素試驗的基礎上選取膠體磨工作溫度，時間，變性淀粉和β-環糊精的質量比3個主要的影響因素，以包埋率為衡量指標，采用正交試驗設計，分別對玉米黃粉色素進行微膠囊試驗。復方中獸藥微膠囊微膠囊正交試驗因素水平如表2所示。
表2
1.3.5 微膠復方中獸藥微膠囊包埋率的計算：
復方中獸藥微膠囊的吸光度和中獸藥濃度成比例關系。因此本試驗先以吸光度作為衡量復方中獸藥含量的指標，通過吸光度計算微膠囊化復方中藥的包埋率。
復方中獸藥包埋率=（1-微膠囊復方中獸藥的濃度/微膠囊色素的總量）×100% （1）。
2 結果與分析：
2.1 復方中獸藥微膠囊單因素試驗結果與分析：
2.1.1 芯材與壁材的配比對微膠囊化的影響：
以上是膠體磨轉速在1200r/min下完成的，由表3可知，隨著芯材含量的逐漸增加，復方中獸藥微膠囊的包埋率逐漸降低，這可能是因為壁材比例越大，形成微膠囊的壁就越厚，囊壁的牢固性就增加，包埋率就增高。但是當色素含量過低時，可能由于壁材量過大，導致微膠囊壁過厚，玉米黃粉色素包埋量過少，且不適合用于實踐生產中，當芯材含量30%時，包埋率在80%以上，所以根據微膠囊化后產品的色價和溶解性，選擇芯材含量為30%作為最佳的用量。芯壁比對復方中獸藥微膠囊化包埋率的影響如表3所示。
表3
2.1.2 研磨溫度對微膠囊化的影響：
由表4結果可知，當研磨溫度在20℃～60℃時，微膠囊化的包埋率隨溫度升高而增高。這是因為當研磨溫度升高時，可以使壁材成膜速度加快，提高包埋效果。但當溫度繼續升高時，導致壁材的成膜性降低，微膠囊化效率降低，影響包埋效果。但是當溫度過高時，由于色素損失包埋率降低，因此當溫度為30℃時微膠囊效果最佳。研磨溫度對復方中獸藥微膠囊化包埋率的影響如表4所示。
表4
2.1.3 研磨時間對微膠囊化的影響：
由表5可見，隨著研磨時間的延長，包埋率提高，但是在30 min以上時，卻出現包埋率下降的情況。這是因為隨著時間的延長，中獸藥提取物分子進入壁材分子內越多，當壁材內和中獸藥提取物充分結合后，增大研磨時間色素會略有損失，包埋率將呈下降趨勢。因此，最適研磨時間為30 min。研磨時間對復方中獸藥微膠囊化包埋率的影響如表5所示。
表5
2.1.4 β-環糊精和變性淀粉質量比對微膠囊化的影響：
由表6可知，壁材比例的不同對微膠囊包埋率產生影響，這可能是因為變性淀粉具有乳化和包埋作用，和環糊精用作微膠囊壁材具有協同作用，促進微膠囊的形成，并和芯材結合比較牢固。結果表明，變性淀粉與環糊精質量比為4︰3時微膠囊效果比較好。β-環糊精和變性淀粉的質量比對復方中獸藥微膠囊化的影響如表6所示。
表6
2.2 微膠囊化復方中獸藥正交試驗結果與分析：
選取研磨溫度，時間，變性淀粉和β-環糊精的質量比3個主要的影響因素，以包埋率為衡量指標進行正交試驗設計，確定復方中獸藥微膠囊化的最佳條件。不同微膠囊試驗條件下所得的包埋率結果見表7。
從表7試驗結果可以看出：極差分析為A＞B＞C，復方中獸藥微膠囊化的最佳條件為A3B2C1，即研磨時間為30 min，研磨溫度為40 ℃，變性淀粉和β-環糊精的質量比為3︰4時，復方中獸藥的包埋率最大為90.5%。
表7
3 結論：
本研究采用研磨法對復方中獸藥的微膠囊化工藝進行探討，得出復方中獸藥微膠囊化的工藝條件是：
采用研磨法對復方中獸藥的微膠囊化工藝進行探討，
芯材含量10-60%（W/W），最佳濃度為30%。
研磨溫度在20 ℃-60 ℃時，最佳溫度為30℃。
膠體磨工作時間為：10 -60 min，最佳時間30 min。
β-環糊精和變性淀粉的質量比分別為：1-6：1-6，最佳質量比為4︰3。
復方中獸藥的包埋率最大為84.5%。
由此可見，經微膠囊化后的復方中獸藥，在壁材變性淀粉和β-環糊精的包埋作用下，復方中獸藥被充分包埋，其穩定性會大大提高，本研究為復方中獸藥的實際應用與開發奠定了基礎。
實施例2：
一種治療雞傳染性支氣管炎中獸藥微膠囊的藥效試驗：
雞呼吸道疾病是由細菌或病毒引起的一種急性接觸性傳染病。傳染性支氣管炎（IB）、傳染性喉氣管炎（ILT）、傳染性鼻炎（IC）、禽霉形體病（CRD）等均表現呼吸道癥狀，主要表現為病雞伸頸搖頭，打噴嚏，呼吸喘急且聲音異常，眼、鼻流液，精神委頓，食欲減退等，剖檢可見呼吸系統呈不同程度出血點或充血，炎癥癥狀明顯，病雞還常伴有消化系統和其他器官如腸道出血、肝腎腫大、心包發炎等綜合性病變，呼吸道疾病一般病程較長，嚴重影響肉雞生長和母雞產蛋性能，給養禽業造成嚴重損失。充分利用我國現有藥物資源，探索研制新藥制劑對禽傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等呼吸道疾病進行治療，對提高禽養殖效益及動物衛生防控效果具有重要意義。
1 材料與方法：
1.1 試驗材料：
1.1.1 本發明提供的一種用于治療雞傳染性支氣管炎的藥物組合物微膠囊劑（以下簡稱本發明微膠囊劑）：中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，其組方分別為：
本發明微膠囊劑1：
麻黃提取物0.01kg，大青葉提取物0.1kg，貫葉連翹提取物0.2kg，金銀花提取物0.1kg，黃連提取物0.2kg。
本發明微膠囊劑2：
麻黃提取物0.05kg，大青葉提取物0.01kg，貫葉連翹提取物0.1kg，金銀花提取物0.2kg，黃連提取物0.01kg。
本發明微膠囊劑3：
麻黃提取物0.1kg，大青葉提取物0.05kg，貫葉連翹提取物0.01kg，金銀花提取物0.01kg，黃連提取物0.1kg。
對照1：三氮唑核苷0.1kg。
1.1.2 試驗雞10 日齡雛雞1000只，購自甘肅華隴雞場，試驗在所里蘭州大哇山動物實驗基地。
1.1.3 菌（毒）株副雞嗜血桿菌N 株、雞傳染性支氣管炎病毒M41 株，源自中國獸醫藥品監察所。
1.2 試驗方法：
1.2.1 原料準備將該藥按照以上方法制備，裝入干凈周轉桶中，密封，轉入待檢室待檢。檢測合格后，置散劑自動分裝機按規定分裝、封口。
1.2.2 細菌培養將副雞嗜血桿菌接種于含2%羊血紅蛋白的雞血清雞肉湯培養基中，37℃培養24 h，按常規方法活菌計數。
1.2.3 M41 毒株EID50測定種毒100 倍稀釋，接種于10 日齡雞胚尿囊腔，每胚0.1 mL，37℃孵化48 h，取尿囊液備用并觀察胚胎病變。
1.2.4 攻毒劑量測定取試驗雞20只，隨機分4 組，分別經鼻、眼滴入IBV 和副雞嗜血桿菌等量混合液0.1、0.2、0.3、0.4 ml，攻毒后觀察雞發病情況。
1.3 本發明微膠囊劑對雞呼吸道疾病治療試驗：
1.3.1 試驗分組與處理10 日齡雞250 只，隨機分成5組，每組50只，分別為本發明微膠囊劑3、2、1組，對照組，每只雞按確定的攻毒劑量經鼻、眼滴入感染染毒。試驗雞于攻毒后24 h，分別按每公斤飼料中加入2mg的本發明微膠囊劑劑量拌飼給藥，連用5d。藥物對照組攻毒后24 h 按每公斤2mg拌飼給藥，方法同上。
1.3.2 療效考核標準試驗期間，每日觀察雞群，一個療程后統計有效率、死亡率及相對增重率。
1.4本發明微膠囊劑與對照治療效果比較試驗：
1.4.1 試驗分組將供試雞分為2組，第1 組為本發明微膠囊劑組（2），300只，按2mg/kg的劑量拌飼給藥，連用5 d；對照組（1），300 只，按2mg/kg的劑量拌飼給藥，連用5 d。
2 結果：
2.1本發明微膠囊劑對雞呼吸道疾病的治療效果2.1.1 攻毒劑量副雞嗜血桿菌37℃培養24 h 后，活菌計數為20×108 CFU/mL。雞傳染性支氣管炎病毒M41 株的ELD50為10-6.5/0.1 mL。雞只在攻毒后48 h 陸續發病，其中0.2-0.4 mL 組全部發病，因此確定0.2 mL/只為攻毒劑量。
2.1.2 攻毒后發病雞癥狀攻毒后34-38 h，陽性對照組陸續發病，表現呼吸困難、流淚、打噴嚏等癥狀，98h 出現死亡。死后剖檢可見雞顏面腫脹，眼結膜炎、水腫，鼻腔有黏液性分泌物，氣管有黏液性滲出物，氣囊渾濁。病死雞病原分離呈陽性。
2.1.3本發明微膠囊劑的療效結果見表8。由表8可以看出，本發明微膠囊劑各試驗組雞存活數、治療有效率均高于對照組，且本發明微膠囊劑2組和本發明微膠囊劑3組均高于本發明微膠囊劑1。本發明微膠囊劑2試驗組相對增重率高于其他組，綜合成本及動物安全因素，選情況本發明微膠囊劑2組為最佳配方。
表8
2.2本發明微膠囊劑3與對照藥治療效果比較：
本發明微膠囊劑2與對照藥治療效果比較結果見表9。由表9 可知，本發明微膠囊劑2組發病雞的治愈率高于對照組，且死亡率顯著對照組組；本發明微膠囊劑2的平均增重與相對增重顯著高于對照組。
表9
3 討論：
3.1目前通過中獸藥現代化研究，研制出新的劑型。從本次試驗結果也看出，本發明微膠囊劑1、2、3組的發病率分別比陽性對照組發病率降低大大降低，治愈率、有效率及增重有所提高。通過大量臨床應用及以上試驗綜合考慮2號組方為最佳組方。
3.2 根據本試驗結果，本發明微膠囊劑臨床推薦用量為2-4 mg/kg拌飼給藥，5d 為一個療程。但在實際生產中，可根據具體病情酌情增加劑量或延長療程。
綜上所述，本發明微膠囊劑對雞慢性呼吸道疾病具有良好的治療效果，治愈率達92.1%，比對照高，應用本發明微膠囊劑相對增重為129，因此，該制劑在臨床上具有廣闊的推廣應用價值。
最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。