本發明涉及醫學微生物學領域，具體涉及以淋病奈瑟菌PorB基因疫苗-沙門菌菌影疫苗為基礎的雙效免疫增強疫苗的制備及應用。

背景技術：

淋病是一種由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖系統黏膜的急性或慢性化膿性炎癥，居我國性傳播疾病首位。目前，全球每年約新增加10600萬的淋病患者，危害十分嚴重。隨著淋病奈瑟菌耐藥菌株不斷出現，抗生素治療越來越困難，但由于對淋病奈瑟菌誘導免疫應答機制缺乏認識，目前仍沒有有效的淋病疫苗面世。淋病疫苗的研制仍是淋病防治的重要策略。

淋病奈瑟菌孔蛋白B(PorB)是抗原高度保守的外膜蛋白，具有較強的免疫原性，是淋病疫苗理想的候選抗原。淋病奈瑟菌PorB通過受體TLR2和髓樣分化因子88(MyD88)誘導抗原提呈細胞B細胞的增殖及樹突細胞的成熟活化，細胞表面高水平表達MHCⅡ和CD86，使孔蛋白PorB成為理想的佐劑。利用淋病奈瑟菌PorB核酸疫苗采用肌肉注射方式接種BALB/c小鼠后，在小鼠血清中能檢測到PorB特異性抗體的產生，但抗體水平不高(Zhu W,Thomas C E,Sparling P F.DNA Immunization of mice with a plasmid encoding Neisseria gonorrhea PorB protein by intramuscular injection and epidermal particle bombardment.[J]vaccine,2004,22:660-669)。目前，旨在提高淋病奈瑟菌PorB基因疫苗免疫效果的方法較少，主要以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位作為佐劑，誘導體液免疫應答和黏膜免疫應答，但免疫應答強度增加不明顯(戴志兵等.抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯合應用增強免疫應答的研究.分子與細胞免疫學.中國免疫學雜志.2010(26):1059-1068)。

沙門菌屬于革蘭陰性細菌，能感染人和多種動物，常引起胃腸炎和菌血癥，是重要的人畜共患病原體。沙門菌能穿過小腸黏膜層侵入上皮細胞，靶向腸道黏膜的M細胞，通過M細胞的攝取和轉運到達黏膜下淋巴組織，誘導機體產生黏膜和系統性免疫應答。在控制沙門菌感染上，盡管傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗一直在使用，但是免疫效果不理想，也存在一些副作用；減毒苗的使用類似自然感染過程，在機體內可復制增殖，卻存在毒力回復和潛在的污染的可能(B.R.Singh.Salmonella vaccines for animals and birds and their future perspective.The Open Vaccine Journal,2009,2:100-112)。目前，研究和開發新的疫苗仍是預防和控制沙門菌感染的重要措施。

細菌菌影是革蘭陰性菌通過噬菌體裂解基因的誘導形成不含核酸等胞質內容物的細菌空殼，它保留了天然細菌完整的外膜結構，不僅可作為疫苗誘導相關免疫應答，也可作為DNA、抗原和藥物等的遞送載體。盡管沙門菌菌影免疫已經在雞等動物模型中取得了一定的免疫保護效果，但免疫保護效力仍需進一步提高(Nandre RM et al.Enhanced protective immune responses against Salmonella Enteritidis infection by Salmonella secreting an Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases,2013,36:537-548)。因此，如何提高沙門菌菌影疫苗的免疫應答水平和免疫保護效果仍需進一步研究。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗及其制備方法。該淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗具有良好的安全性、能同時誘導機體產生和提高針對淋病奈瑟菌和沙門菌的特異性體液免疫應答、黏膜免疫應答，且具有較高的抗體水平。本發明的基本設計理念為：通過借助沙門菌菌影遞送載體負載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗；負載菌影疫苗性質穩定，不僅能同時誘導產生針對淋病奈瑟菌和沙門菌的免疫應答，而且顯示了互為佐劑的雙效免疫增強作用，為今后淋病奈瑟菌和沙門菌的感染機制、疫苗效果的研究奠定了基礎；同時，該負載疫苗的研制進一步拓寬了新型疫苗的研究領域，因而具有廣闊的市場前景。

本發明的目的還在于提供上述淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗、及其制備方法的應用。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗，其特征在于，包括淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗和沙門菌菌影，其中，沙門菌菌影作為遞送載體負載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗。

本發明提供了上述淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以淋病奈瑟菌基因組為模板，使用上游引物(P1)和下游引物(P2)，克隆孔蛋白B基因并構建PorB DNA疫苗：PCR擴增淋病奈瑟菌PorB基因，并將其重組到真核表達載體pVAX1中獲得PorB DNA疫苗pVAX1-PorB；大量提取質粒，PBS稀釋后凍存備用；其中，PCR擴增引物的核苷酸序列分別如下：

上游引物(P1)：CGGGGATCCATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG

下游引物(P2)：CCCCTGCAGTTAGAATTTGTGGCGCAGAACGAC；

(2)構建溫控表達載體pB-E，并將其轉化到沙門菌感受態中獲得重組菌SE(pB-E)，經溫度誘導制得沙門菌菌影疫苗，經真空冷凍干燥制備成菌影凍干粉：可選地，其具體步驟為： 構建出含有噬菌體PhiX174裂解基因E的溫控表達載體pB-E，并將其電擊轉化到沙門菌感受態中獲得重組菌SE(pB-E)；重組菌SE(pB-E)經28℃振蕩培養后轉接于新鮮含Kan抗性LB液體培養基繼續培養，待細菌OD₆₀₀數值約0.3～0.4時，迅速升溫至42℃誘導以制備沙門菌菌影SE-ghost，裂解完成后，4500rpm，15min離心菌液收集菌影，用冷凍干燥儀進行凍干，獲得SE-ghost凍干粉備用；

(3)負載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的沙門菌菌影雙效疫苗的制備：將淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗與凍干的沙門菌菌影孵育，加入氯化鈣溶液后得到負載的菌影疫苗SE ghost(PorB)。

本發明還提供了上述淋病奈瑟菌-沙門菌菌影雙效疫苗、制備方法及其在免疫效力評價方面的應用。

本發明的技術方案達到了如下的有益效果：

(1)本發明提供了一種淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗，該疫苗中，巧妙地將沙門菌菌影作為載體裝載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗，使得該淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗具有良好的安全性、能同時誘導機體產生和提高針對淋病奈瑟菌和沙門菌的特異性體液免疫應答、黏膜免疫應答，且具有較高的抗體水平；有效地解決了目前尚無有效的淋病疫苗面世的技術問題。

(2)本發明提供了沙門菌菌影SE-ghost的制備方法，裂解效率約99％。沙門菌菌影可作為載體裝載核酸有較高的裝載效率。將淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗與沙門菌菌影凍干粉孵育后得到負載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的沙門菌菌影SE ghost(PorB)。

(3)使用該方法制備的淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗中，SE ghost(PorB)可同時誘導出針對淋病奈瑟菌和沙門菌的特異性體液免疫應答(血清IgG抗體)和黏膜免疫應答(IgA抗體)，其抗體水平均明顯高于單獨淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗和沙門菌菌影疫苗；且能同時產生針對淋病奈瑟菌和沙門菌的免疫保護效力，顯示了互為佐劑的雙效免疫增強作用；該負載疫苗的研制進一步拓寬了淋病疫苗、沙門菌疫苗的研究領域，因而具有廣闊的市場前景。

附圖說明

圖1是是重組質粒pVAX1-PorB的酶切鑒定圖。。

圖2是重組菌裂解效率結果圖。

圖3SE ghost透射電鏡圖

圖4是SE-ghost(PorB)的制備效果電泳鑒定圖。

圖5是SE-ghost(PorB)免疫小鼠血清中抗淋病奈瑟菌PorB的IgG抗體水平。

圖6是SE-ghost(PorB)免疫小鼠陰道洗液中抗淋病奈瑟菌PorB的IgA抗體水平。

圖7是SE-ghost(PorB)免疫小鼠血清補體介導的抗體殺傷淋病奈瑟菌的作用結果。

圖8是SE-ghost(PorB)免疫小鼠血清中抗沙門菌的IgG抗體水平。

圖9是SE-ghost(PorB)免疫小鼠糞便上清中抗沙門菌的IgA抗體水平。

具體實施方式

為了闡明本發明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及具體實施方式對本發明做進一步的介紹。

1、淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的制備

參照GenBank中淋病奈瑟菌PorB基因的序列，設計合成一對引物：上游引物(P1)：CGGGGATCCATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG，下游引物(P2)：CCCCTGCAGTTAGAATTTGTGGCGCAGAACGAC。這對引物覆蓋整個PorB基因，預期擴增目的片段大小為1.1kb。以淋病奈瑟菌WHO株基因組DNA為模板，PCR擴增出目的基因PorB，序列測定結果表明，PorB大小為1053bp，與GenBank公布的多株淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的序列具有100％的同源性。PCR產物經雙酶切回收后將其重組到真核表達載體pVAX1中，經PCR和雙酶切(圖1)鑒定后，獲得重組真核表達質粒pVAX1-PorB。大量提取質粒，測得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.7-1.8。用0.01M pH 7.2PBS稀釋后凍存于-20℃備用。

2、沙門菌菌影的制備

將噬菌體裂解基因E插入到溫控表達載體pBV220中制得溶菌質粒p-E，以p-E為模板，為了制備出能在沙門菌中誘導表達的質粒pB-E，本部分采用了PBBR-MCS2克隆載體，將PCR擴增得到的溶菌盒重組到上述克隆載體中并將其轉入沙門菌中。重組菌接種于5ml含Kan抗性LB液體培養基中，28℃200rpm振蕩培養8-10h。次日以1:500比例轉接于2000ml含Kan抗性LB液體培養基，28℃200rpm振蕩培養。待細菌培養至OD₆₀₀值約為0.3～0.4時，迅速升溫至42℃誘導表達以制備沙門菌菌影SE-ghost。取誘導前與誘導后菌液經系列稀釋后涂布于LB平板上，于37℃培養15小時，通過計數CFU評價裂解效率。結果顯示，裂解效率約99％(圖2)。取誘導前與誘導后菌液經過戊二醛前固定，四氧化鋨后固定，乙醇逐級脫水，依次加入丙酮，丙酮/樹脂(1:1)1h，丙酮：樹脂(1:2)，樹脂包埋，制作超薄切片，透射電子顯微鏡觀察。結果顯示，誘導前的細菌內部充滿內容物，呈現黑色，而誘導后細菌內容物排出，呈現透明的空泡狀結構(圖3)。大量制備菌影后，經超純水洗滌3次，用真空冷凍干燥儀進行凍干，獲得SE-ghost凍干粉，-70℃保存備用。

3、負載淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的沙門菌菌影雙效疫苗的制備

為了優化DNA疫苗負載沙門菌菌影的條件，我們將不同濃度的真核表達質粒pVAX1-PorB與沙門菌菌影孵育。優化后的制備條件是：將5mg沙門菌菌影凍干粉重懸于7mg淋病奈瑟菌PorB DNA溶液中，加入終濃度為25mM CaCl₂，置于37℃恒溫搖床，220rpm振搖孵育2h，8000rpm離心5min。用超純水洗滌沉淀3次，4500rpm離心5min，沉淀用PBS懸浮，4℃保存備用。瓊脂糖凝膠電泳評價裝載效率(圖4)。結果表明，淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗被成功裝載入沙門菌菌影中。

實施例2

本實施例2中對實施例1中所制備而得的淋病奈瑟菌-沙門菌雙效疫苗進行了免疫效力評價，其具體步驟如下：

(1)作為淋病疫苗的免疫效力評價：

1)動物分組及免疫：

30只6周齡SPF級BALB/c小鼠，隨機分成3組：SE-ghost(PorB)組、pVAX1-PorB組和PBS對照組。小鼠免疫前10h斷食和斷水，并在免疫前半小時給小鼠灌胃口服100μl的10％碳酸氫鈉溶液，灌胃口服免疫3～4h后給水給食。SE-ghost(PorB)組免疫劑量為1×10⁹CFU，pVAX1-PorB為100μg。每兩周免疫一次，共免疫3次。

2)免疫小鼠體液免疫應答水平的檢測：

三免二周，于小鼠眼靜脈叢采血，進行間接ELISA試驗。

間接ELISA試驗：純化的重組蛋白PorB作為抗原包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，用PBST洗滌3次后，每孔加入10％牛血清的封閉液200μl，4℃封閉過夜。待測小鼠血清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，將底物緩沖液TMB以80μl/孔加入孔底，使用酶標儀讀取各孔450nm處的OD值。結果表明，第三次免疫后，SE-ghost(PorB)組血清IgG抗體水平明顯增加，顯著高于pVAX1-PorB組(P<0.01)(圖5)。研究結果表明，SE-ghost(PorB)誘導小鼠產生抗淋病奈瑟菌PorB的特異性體液免疫應答，且SE-ghost可增強淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的體液免疫應答水平，具有免疫佐劑效應。

3)免疫小鼠黏膜免疫應答水平的檢測：

三免二周，收集小鼠陰道洗液，進行間接ELISA試驗。

間接ELISA試驗：純化的重組蛋白PorB作為抗原包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，用PBST洗滌3次后，每孔加入10％牛血清的封閉液200μl，4℃封閉過夜。待測小鼠陰道洗液作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgA作為二抗，將底物緩沖液TMB以80μl/孔加入孔底，使用酶標儀讀取各孔450nm處的OD值。結果表明，第三次免疫后，SE-ghost(PorB)組陰道洗液IgA抗體水平明顯增加，顯著高于pVAX1-PorB組(P<0.01)(圖6)。研究結果提示SE-ghost(PorB)誘導小鼠產生抗淋病奈瑟菌PorB的特異性黏膜免疫應答，SE-ghost可增強淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的黏膜免疫應答水平，具有免疫佐劑效應。

4)作為淋病疫苗的免疫效果評價：

血清中補體介導的抗體殺菌活性試驗：將淋病奈瑟菌WHO-A作為活菌檢測原、各組待檢血清用PBS倍比稀釋作為抗體、人新鮮血清作為補體，按比例分別加入10％活菌檢測原、80％稀釋血清和10％補體，充分混勻，37℃孵育30min。將處理后的菌液適當稀釋后分別涂布于淋病奈瑟菌FB固體培養基上，37℃5％CO₂孵育36h。計數細菌菌落數并計算相對存活率。同時以等量淋病奈瑟菌稀釋液涂板為陰性對照。相對存活率＝各實驗組涂板的菌落數/以等量淋病奈瑟菌涂板的菌落數×100％。結果顯示，SE-ghost(PorB)組血清抗體的補體介導的淋病奈瑟菌殺菌作用效果顯著高于pVAX1-PorB組(P<0.01)。PBS組血清抗體沒有補體介導的殺傷淋病奈瑟菌的作用(圖7)。研究結果提示SE-ghost可增強淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的免疫保護效果。

(2)作為沙門菌疫苗的免疫效力評價：

1)動物分組及免疫：

30只6周齡SPF級BALB/c小鼠，隨機分成3組：SE-ghost(PorB)組、SE-ghost組和PBS對照組。小鼠免疫前10h斷食和斷水，并在免疫前半小時給小鼠灌胃口服100μl的10％碳酸氫鈉溶液，灌胃口服免疫3～4h后給水給食。SE-ghost組、SE-ghost(PorB)組免疫劑量為1×10⁹CFU。每兩周免疫一次，共免疫3次。

2)免疫小鼠體液免疫應答水平的檢測：

三免二周，于小鼠眼靜脈叢采血，進行間接ELISA試驗。

間接ELISA試驗：將滅活沙門菌用包被液稀釋濃度為5×10⁸CFU/ml包被酶標板，每孔加100μl，4℃包被過夜。用PBST洗滌3次后，每孔加入10％牛血清的封閉液200μl，4℃封閉過夜。待測小鼠血清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，每孔加入80μl底物緩沖液TMB，使用酶標儀讀取各孔450nm處的OD值。結果顯示，在三免后，SE-ghost組、SE-ghost(PorB)組血清IgG抗體水平顯著高于PBS組(P<0.01)，且SE-ghost(PorB)組血清IgG的抗體水平顯著高于SE-ghost組(P<0.01)(圖6)。研究結果提示SE-ghost(PorB)灌胃接種小鼠誘導產生抗沙門菌的特異性的體液免疫應答，PorB能顯著提高SE-ghost的體液免疫應答水平，具有免疫增強效應。

3)免疫小鼠黏膜免疫應答水平的檢測：

三免二周，收集小鼠糞便，進行間接ELISA試驗。

間接ELISA試驗：將滅活沙門菌用包被液稀釋濃度為5×10⁸CFU/ml包被酶標板，每孔加100μl，4℃包被過夜。用PBST洗滌3次后，每孔加入10％牛血清的封閉液200μl，4℃封閉過夜。待測小鼠糞便上清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgA作為二抗，每孔加入80μl底物緩沖液TMB，使用酶標儀讀取各孔450nm處的OD值。結果顯示，在三免后，SE-ghost組、SE-ghost(PorB)組黏膜IgA抗體水平顯著高于PBS組(P<0.01)，且SE-ghost(PorB)組黏膜IgA抗體水平顯著高于SE-ghost組(P<0.05)(圖9)。研究結果表明，SE-ghost(PorB)接種小鼠誘導產生抗沙門菌的特異性的黏膜免疫應答，PorB能顯著提高SE-ghost的黏膜免疫應答水平，具有免疫增強效應。

4)沙門菌感染后各組的保護效力：

于末次免疫后2周，試驗鼠灌胃口服1×10¹⁰CFU腸炎沙門菌HA2株，每日觀察小鼠存活情況，分析疫苗保護效果。結果顯示，PBS組小鼠共死亡6只，SE-ghost組小鼠死亡2只，SE-ghost(PorB)組癥狀較輕，小鼠沒有死亡(見表1)。結果表明，淋病奈瑟菌PorB能提高SE-ghost的免疫保護效果，具有免疫增強效應。

表1：SE-ghost(PorB)免疫小鼠抗沙門菌感染的免疫保護試驗結果

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，本發明要求保護范圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。