本發明涉及一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗及其生產方法。屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
養羊業與國民經濟的發展和各族人民生活水平的提高關系十分密切，特別是進入21世紀后，我國養羊業得到快速發展，成果顯著，養羊業在國民經濟中的比重也逐年提高。根據聯合國糧農組織(FAO)數據，2013年，中國大陸地區的綿羊養殖量即達1.91億頭，山羊1.83億頭，合計3.74億頭。2014年，中國大陸地區的綿羊養殖量為2.02億頭，山羊1.88億頭，合計3.90億頭。雖然我國養羊數量位居世界首位，但與養羊業發達的國家相比，疫病防控水平較薄弱，這在一定程序上制約了我國養羊業的發展。2014年，國家現代肉羊產業技術體系分別對全國肉羊主產區內蒙古、新疆、寧夏、甘肅、青海等14個省區市的近60個縣(區、旗)的肉羊產業發展現狀進行專題調研后形成的《2014年全國肉羊產業調研報告》中指出：從調查的總體情況看，當前對我國肉羊產業危害最為嚴重的傳染病有羊支原體肺炎(傳染性胸膜肺炎)、鏈球菌病、梭菌病、羊痘、羊傳染性膿皰(羊口瘡)、羔羊痢疾和羊腸毒血癥。這些病均引起不同程度的死亡，養羊戶損失嚴重。其中最引人關注的是近年來發生嚴重的羊支原體肺炎，飼養密集的規模化羊場和經過長途運輸的羊只羊支原體肺炎的發病率很高，死亡嚴重。在寧夏、安徽、云南和四川調研時，發現所有的規模化羊場都存在羊傳染性胸膜肺炎，只是危害的程度不同。
山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleurpneumonia,CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp，引起的一種山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病，以呈現纖維素性肺炎和胸膜炎為特征,發病率為22％～30％，個別地區高達60％～80％，死亡率15％～30％。該病在非洲、亞洲等數十個國家和地區都有流行，對山羊養殖業帶來了較為嚴重的損失，被世界動物衛生組織列為B類傳染病。我國于1947年首發于甘肅,繼而在內蒙古、四川、山東、湖北、河北、云南、江西、江蘇等地陸續發現。近幾年，在湖南、河南、貴州、重慶、內蒙等地區都有CCPP的報道，給山羊養殖業造成了較大的經濟損失。
目前，我國預防山羊傳染性胸膜肺炎，主要依靠中國獸醫藥品監察所研發的“山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗”，該疫苗已在我國廣泛使用近60年，長期的臨床實踐證明該疫苗具有極好的臨床免疫保護效力。但原疫苗采用強毒氣管注射山羊，采集肺組織制成山羊傳染性胸膜肺炎組織滅活疫苗，該疫苗不適宜工業化生產，存在散毒的危險；肺組織中雜菌含量高，所制備的疫苗易出現過敏反應。
技術實現要素：
本發明目的在于制備出采用液體培養基發酵培養工藝生產的山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，用于預防山羊傳染性胸膜肺炎。
本發明技術方案
1.一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述滅活疫苗含有采用EZH液體培養基培養的山羊支原體山羊肺炎亞種抗原。
2.本發明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述山羊支原體山羊肺炎亞種抗原生產菌株為C87001株。
3.本發明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述液體培養基為EZH液體培養基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值至7.8，經0.22μm過濾除菌。
4.本發明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于用所述山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株作為疫苗生產菌株，接種適宜培養基，培養后收獲培養物經濃縮、滅活，加礦物油佐劑混合乳化制成山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗。
本發明具體實施方式
1.山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的制備
(1)生產和檢驗用菌種 山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株生產用基礎種子，山羊支原體山羊肺炎亞種C87002株為疫苗檢驗用菌種，由中國獸醫藥品監察所制備并提供(該菌原分類命名為絲狀支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)(請見中國獸醫藥品監察所、中國獸醫微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫菌種目錄(第二版)，中國農業科學技術出版社，2002年，p89)。)。
(2)一級種子繁殖及鑒定 取C87001株凍干菌種1支，接種含15％馬血清的EZH液體培養基，置37℃培養3～5日，當培養基pH值下降至7.0左右時，作為制苗用一級種子。
(3)二級種子繁殖及鑒定 取一級種子，接種含15％馬血清的EZH液體培養基，置37℃培養3～5日，當培養基pH值下降至7.0左右時，作為制苗用二級種子。
(4)制苗用抗原 制備取合格的二級種子，按培養基總量的2％接種含15％馬血清的EZH液體培養基，37℃培養，當培養物pH值下降到7.0左右時，終止培養。取樣進行純粹檢驗及活菌滴度測定。活菌滴度應≥1×109.0CCU/ml。
(5)抗原濃縮 采用2萬截留分子量(MW)超濾濃縮系統濃縮15倍(V/V)。
(6)滅活 按濃縮抗原總量的0.01％加入硫柳汞，充分混勻，在15～25℃作用10小時，期間攪拌數次。滅活結束后，2～8℃保存，應不超過30日，取樣進行半成品檢驗。
(7)疫苗配制 將油佐劑導入油相罐內，以至少121配高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用。根據滅活前活菌滴度測定結果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)將濃縮后的抗原稀釋至每1ml含1m109.0CCU菌體。將油相加入乳化罐內，以80～100r/min攪拌，同時按1:1(V/V)的比例，緩慢加入水相，加完后攪拌5～10min，用乳化機以5600r/min，循環乳化10～20min。乳化后取樣進行檢驗，合格后分裝。
本發明以上所述液體培養基為EZH液體培養基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值至7.8，經0.22μm過濾除菌。
2.山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的檢驗
(1)性狀
外觀 乳白色或淡黃色乳劑。
劑型 油包水型(W/O)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應呈油滴狀不擴散。
穩定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15min，管底析出的水相應不得超過0.5ml。
黏度 按現行《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合規定。
(2)裝量檢查 按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農業出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進行檢查，應符合規定。
(3)無菌檢驗 按《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。
(4)安全檢驗 用體重1.5～2.0kg健康家兔5只，各肌肉注射疫苗1.0ml；用1月齡的健康易感山羊2只，各分點肌肉注射疫苗4.0ml，均觀察10日。應全部健活。
(5)效力檢驗 用體重至少為20kg、1～3歲的健康易感山羊4只，各頸部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。21日后連同對照山羊3只，各氣管注射山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織乳劑4.0ml，觀察30日。對照山羊應全部發病，免疫山羊應至少保護3只。
(6)汞類防腐劑殘留量測定 按《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合規定。
本發明涉及生物材料資源信息
山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)C87001株生產用基礎種子，山羊支原體山羊肺炎亞種C87002株為疫苗檢驗用菌種，該類菌原分類命名為絲狀支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)C87001株和C87002株，均由中國獸醫藥品監察所制備并提供(請見中國獸醫藥品監察所、中國獸醫微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫菌種目錄(第二版)，中國農業科學技術出版社，2002年，p89)。
本發明的積極意義
本發明涉及一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗及其制備方法。本發明采用山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株，接種適宜培養基，收獲培養物，經濃縮、硫柳汞滅活后，加礦物油佐劑混合乳化制成，用于預防山羊支原體山羊肺炎亞種引起的山羊傳染性胸膜肺炎。本發明采用液體培養基發酵培養工藝生產山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，較原組織滅活疫苗具有明顯的優勢，即大大降低了疫苗生產過程中的生物安全風險、降低了生產成本，且所制備的疫苗不易出現過敏反應，安全性更高。
實施例
以下實施例為進一步說明本發明，不對本發明要求保護的技術方案構成限制。
實施例1
——疫苗制備及檢驗
按照確定的生產工藝，制備了3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，現將結果報告如下。
1.材料
(1)菌種 生產用菌種：山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株，F8代，活菌滴度為1×109.0CCU/ml；檢驗用菌種：山羊傳染性胸膜肺炎C87002株組織凍干毒，代號87002，代次：52代，規格：1.0g/支，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。
(2)培養基 EZH液體培養基及無菌檢驗用培養基、由中國獸醫藥品監察所培養基組提供。
所述EZH液體培養基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值至7.8，經0.22μm過濾除菌。
(3)油佐劑 Montanide ISA 50V佐劑，法國SEPPIC公司生產。
(4)實驗動物 試驗用山羊，1歲齡，健康，無皮膚病、寄生蟲感染，經山羊傳染性胸膜肺炎支原體F38株、綿羊肺炎支原體Y98株及布魯氏桿菌病等血清學檢驗均為陰性，來自甘肅省某養羊廠。家兔，體重1.5～2.0kg、健康，來自中牧實業股份有限公司蘭州生物藥廠實驗動物場。
(5)過濾器(Polygard CR，0.22μm)：反應罐(福州福爾特公司)；超濾濃縮設備(Millipore公司產品，Pellicon2盒式濾器，采用Biomax 2萬截留分子量，改良聚醚砜材料，0.5m2膜面積膜堆)；乳化設備(德國產IKA 2000/4型乳化機)。
2.抗原制備與檢驗
(1)將山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株生產種子按培養基總量2％的比例接種含15％的馬血清EZH液體培養基中，于37℃培養，待培養物pH值下降至7.0左右，收獲培養物，收獲菌液。采用此方法連續制備3批菌液，同時抽樣進行純粹檢驗、活菌滴度測定。
(2)抗原檢驗
1)純粹檢驗 按《中國獸藥典》附錄方法檢驗，均純粹。
2)活菌滴度測定 將待測樣品用含15％馬血清的EZH液體培養基進行10倍系列稀釋至10-12，同時設未加菌液的含15％馬血清EZH液體培養基作為陰性對照。置37℃培養7日，培養基顏色改變的最高稀釋度即為待測樣品的滴度。用3份樣品的平均滴度，作為菌液滴度(CCU/ml)。檢驗結果見表1。
表1 實驗室3批制品培養菌液的純粹檢驗和活菌滴度檢驗結果
注：“-”表示純粹檢驗結果為純粹。
從表1可以看出，實驗室3批制品均純粹，濃縮前菌液活菌滴度達7×109.0～1×1010.0CCU/mll。
(3)制苗抗原的濃縮
將3批檢驗合格的抗原培養物，分別以2萬分子量內壓式超濾膜堆濃縮超濾15倍，濃縮后抗原量為原液量的1/15。
(4)菌液的滅活
按0.01％比例將硫柳汞加入濃縮菌液，充分混勻，分別在室溫20℃滅活10小時，期間攪拌5次。滅活后，2～8℃保存，并無菌抽樣進行半成品檢驗。
(5)半成品檢驗
1)無菌檢驗 每批滅活抗原按現行《中國獸藥典》附錄方法進行檢驗，均無細菌及霉菌生長。
2)滅活檢驗 取滅活抗原接種含15％馬血清的EZH液體培養基2支，每支0.2ml，置37℃培養5日，均無支原體生長。檢驗結果見表2。
表2 3批制品的半成品檢驗結果
注：“-”表示無細、菌霉菌生長。
從表2可以看出，實驗室3批制品的抗原滅活完全。
(6)疫苗制備
1)抗原稀釋 據滅活前活菌滴度測定結果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)將濃縮后的抗原稀釋并調節濃度，使每1ml含1m109.0CCU菌體。
2)油相準備 將SEPPIC Montanide ISA 50V2油佐劑經121℃滅菌30min，備用。
3)疫苗乳化 按油相：水相為1:1的比例加入乳化罐內，以90r/min的轉速充分攪拌，再通過轉速為5600r/min的剪切機進行剪切，使疫苗乳化成油包水劑型。
4)分裝 疫苗充分混合后，在無菌條件下定量分裝，密封瓶口，2～8℃保存。
(7)成品檢驗
1)性狀檢測
外觀：試制的3批疫苗均為乳白色乳劑。
劑型：每批疫苗抽樣分別用一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，均呈云滴狀不擴散。
黏度：按現行《中國獸藥典》附錄方法進行檢測，黏度均小于200cP。
2)穩定性檢查：每批疫苗吸取10ml加入離心管中，以3000轉/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相均未超過0.5ml。
3)裝量檢查：按現行《中國獸藥典》附錄方法進行檢測，均應不低于100ml/瓶。
4)無菌檢驗：每批產品隨機抽取10瓶，按現行《中國獸藥典》方法進行檢驗，無細菌，霉菌等生長。
5)汞類防腐劑殘留量測定：按現行《中國獸藥典》進行，均符合獸用生物制品檢驗的一般規定。
6)安全檢驗
用體重1.5～2.0kg健康家兔5只，肌肉注射1.0ml/只；用1歲齡的健康易感山羊(山羊支原體山羊肺炎亞種抗體IHA效價不高于1∶4)2只，分點肌肉注射4.0ml/只。均觀察10日，全部健活。
7)效力檢驗
用體重20kg以上，1歲的健康易感山羊4只，各頸部皮下或肌肉注射2.0ml。21日后，連同條件相同的對照山羊3只，各氣管注射山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織劑4.0ml(含15個最小發病量)，觀察30日。對照山羊3/3發病，免疫山羊均4只全部保護。
實施例2
——與同類制品比較研究報告
為了比較山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗與同類制品在安全性、效力及免疫產生期等方面差異，取實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗制品和國產同類制品按1頭份/只接種1歲齡山羊，比較兩種疫苗接種的安全性和21日后攻毒保護率等。
1.試驗材料
(1.)試驗疫苗 3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗：批號為201001001、201001002和201001003。
(2)對照疫苗 山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，批號為200901，由哈藥集團生物疫苗有限公司生產；山羊支原體山羊肺炎亞種C87002組織凍干毒
(3)山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株，代號87002，代次：52代，規格：1.0g/支，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。
(4)實驗動物 1)試驗用山羊，1歲齡，購自某養殖場，體重20～40kg，健康，無皮膚病、寄生蟲感染，經山羊支原體山羊肺炎亞種F38株、綿羊肺炎支原體Y-98株及布魯氏桿菌病等血清學檢驗均為陰性。2)豚鼠，體重350～450g、健康；兔，體重1.5～2.0kg、健康，北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司、中牧實業股份有限公司蘭州生物藥廠。
2.安全檢驗
(1)對山羊的安全性
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)分別以2.0ml/只皮下接種1歲齡山羊，同時取哈藥集團生物疫苗有限公司的同類制品按1頭份/只皮下接種1歲齡山羊，觀察10日，是否出現局部和全身反應。
(2)對非靶動物(豚鼠和兔)的安全性
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)和哈藥集團生物疫苗有限公司生產的同類制品分別肌肉注射豚鼠和兔各2只，2.0ml/只，觀察10日，觀察是否出現局部和全身反應。
3批實驗室制品和哈藥集團生物疫苗有限公司生產的同類制品對試驗山羊、豚鼠和兔注射當日均有壓痛，次日后消失，無其它局部和全身反應，表3。
表3 實驗室制品和同類制品注射豚鼠和兔7日內的局部反應觀察結果
注：“/”表示未注射疫苗。
3.免疫產生期試驗
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)分別以2.0ml頸部皮下接種1歲齡山羊，同時取哈藥集團生物疫苗有限公司生產的同類制品按1頭份/只頸部皮下接種1歲齡山羊，接種后第14日和21日攻毒。見表4。
4.本動物攻毒保護試驗
免疫21日后，免疫羊與對照羊同時以山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織乳劑氣管接種4.0ml(含15個最小發病量)，臨床觀察30日。
表4 本發明的疫苗與國產同類制品的免疫產生期測定結果
從表4可以看出，接種3批制品和哈藥集團生物疫苗有限公司生產的同類制品后第14日，所有山羊攻毒保護達到3/4以上，第21日攻毒保護達到4/4；攻毒對照組山羊3/3發病。
實驗室3批制品的生產是采用EZH液體培養基培養山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株菌種，收獲菌液濃縮15倍、硫柳汞滅活、與進口50V油佐劑按1:1(v/v)混合乳化后分裝制成的。通過進行兩種制品安全性、效力及免疫產生期等方面比較，結果顯示：實驗室產品與哈藥集團生物疫苗有限公司生產的同類制品在效力和免疫產生期方面均相當。
實施例3
——最小免疫劑量確定
為了檢驗山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗不同劑量對靶動物的免疫效果，取實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗按不同劑量接種1歲齡山羊，21日后進行攻毒保護試驗，確定該制品的最小免疫劑量。現將結果報告如下。
1.材料
(1)疫苗 3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，批號為201001001、201001002和201001003批，由本實驗室制備。
(2)山羊傳染性胸膜肺炎C87002組織凍干毒 山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株，代號87002，代次：52代，規格：1.0g/支，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。
(3)實驗動物 甘肅省內一養殖廠山羊，1歲齡，健康、無傳染病、皮膚病和寄生蟲感染，經山羊支原體山羊肺炎亞種F38株、綿羊肺炎支原體Y98株及布魯氏桿菌病等血清學檢驗均為陰性。
2.攻毒保護
實驗室3批制品(批號為201001001、201001002和201001003批)分別按0.5、1.0、1.5、2.0ml的免疫劑量對山羊注射，注射后21日進行攻毒，不同免疫劑量攻毒保護率測定結果見表5、6。
表5 疫苗不同免疫劑量接種后攻毒保護率
表6 攻毒對照組山羊攻毒保護率
從表3和表4可以看出，3批制品按1.0、1.5、2.0ml免疫劑量接種山羊后21日攻毒保護率均達到3/4(75％)以上；攻毒對照組山羊3/3(100％)發病。
3.臨床癥狀觀察結果
攻毒后，每日觀察免疫組和對照組山羊的臨床癥狀，連續觀察30天。201001001批免疫組2號、4號、7號山羊均出現咳嗽、減食、體溫升高，201001002批免疫組18號、19號24號、27號山羊出均現咳嗽、減食、體溫升高；201001003批免疫組34號山羊出現咳嗽、減食、體溫升高，免疫組其余山羊臨床表現正常；對照組3只羊均出現咳嗽、減食、體溫升高等癥狀，其中C1號山羊于攻毒后24天死亡。
4.剖檢結果
攻毒后30天，對所有試驗山羊進行解剖，結果201001001批出現臨床癥狀的3只山羊解剖后發現肺部有不同程度的特征性病變；201001002批出現臨床癥狀的4只山羊解剖后發現肺部有不同程度的特征性病變；2010011003批出現臨床癥狀的34號山羊解剖后左肺膈葉2/3肝變，剖面呈大理石狀。其余免疫山羊左右肺均正常；對照組C1號死亡解剖后左肺尖葉2/3肝變，剖面呈大理石狀；其余2只對照山羊到期解剖均出現不同程度的肺部大理石樣特征性病變。
本試驗結果表明，采用0.5ml免疫劑量不能產生可靠的保護效果；采用1.0、1.5與2.0ml免疫劑量無顯著差異，3批疫苗1次接種21日后攻毒均可對山羊起到保護作用，證明本疫苗以1.0ml接種1歲齡山羊，21日后攻毒均能保護，為本疫苗最小免疫劑量。因此，為確保免疫效果，免疫劑量建議為2.0ml/只。
實施例4
——疫苗的免疫期測定
本試驗通過測定實驗室3批制品對1月齡山羊接種后不同時間的攻毒保護率，來評定疫苗對靶動物的免疫效力。
1.材料 同實施例3。
疫苗1頭份的使用劑量為：2.0ml/只，采用頸部皮下或肌肉注射。
2.攻毒保護率
實驗室3批制品(批號為201001001、201001002和201001003批)1頭份免疫程序對山羊注射，注射后第6、9、12和15個月攻毒，不同時間點攻毒保護率測定結果見表7、8。
表7 不同免疫程序接種后攻毒保護率(1)
表8 不同免疫程序接種后攻毒保護率(2)
從表3、表4結果可以看出，3批制品一次接種和兩次接種1頭份免疫山羊后6、9、12、15月攻毒保護率均達到3/4(75％)以上；各時間點攻毒對照組山羊3/3發病，經剖檢肺部有典型山羊傳染性胸膜肺炎病變。證明采用兩種免疫程序接種的山羊，15月內攻毒的保護率均達到《中國獸藥典》的規定。
3.臨床癥狀觀察結果
攻毒后，每日觀察免疫組和對照組山羊的臨床癥狀，連續觀察30天。山羊攻毒保護試驗組臨床表現正常；201001003批1針法分別在免疫后9、12個月攻毒后各有1只山羊出現咳嗽、減食、體溫升高，201001002批1針法免疫后12個月攻毒有1只山羊出現咳嗽、減食、體溫升高，201001001批2針法免疫后15個月攻毒有1只山羊出現咳嗽、減食、體溫升高，其余山羊臨床表現正常，對照組山羊均出現咳嗽、減食、體溫升高等癥狀。
4.剖檢結果
攻毒后30天，對所有出現咳嗽、減食、體溫升高的山羊及攻毒對照組山羊進行解剖，結果，肺部均出現不同程度大理石狀病變，未出現臨床癥狀山羊左右肺均正常。1針法山羊免疫疫苗6、9、12、15個月后攻毒保護試驗發病判定結果分別見表6、表8、表10和表12，2針法山羊免疫疫苗后的攻毒保護試驗發病判定結果分別見表9、表10、表11。
表9 疫苗免疫6個月山羊攻毒保護試驗發病判定結果
表10 疫苗免疫12個月山羊攻毒保護試驗發病判定結果
表12 疫苗免疫15個月山羊攻毒保護試驗發病判定結果
實施例5
——疫苗穩定性(保存期)試驗
試驗結果見表表12-16.
表12 三批疫苗在2-8℃保存不同時間性狀檢驗、無菌檢驗、裝量和汞類防腐劑殘留量測定結果
表13 三批疫苗在2～8℃保存不同時間安全檢驗結果
表14 實驗室制品2～8℃保存0、3和6個月攻毒保護率
表15 實驗室制品2～8℃保存9、12和18個月攻毒保護率
表16 疫苗2～8℃保存21、24和30個月攻毒保護率
從表14、15和16可以看出，3批制品保存30個月按2.0ml免疫劑量接種山羊后21日攻毒保護率雖均達到3/4(75％)以上，但保護率與保存21個月相比有明顯降低；攻毒對照組山羊3/3(100％)發病，經剖檢肺部有典型山羊傳染性胸膜肺炎病變。