本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是白薇作為抗真菌類(lèi)藥物的新用途。

背景技術(shù)：

真菌感染分為淺部真菌感染和深部真菌感染兩類(lèi)，淺部真菌感染是由癬菌侵犯皮膚、毛發(fā)、指(趾)甲等體表部位造成，發(fā)病率高，難根除。深部真菌感染，又稱(chēng)侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是由以念珠菌、隱球菌為主的酵母樣真菌和以曲霉為主的絲狀真菌侵犯內(nèi)臟器官及深部組織造成，危害性大，病死率高。每年在世界范圍內(nèi)約130萬(wàn)人因嚴(yán)重真菌感染死亡。與危害嚴(yán)重的侵襲性真菌感染相比，抗真菌藥物的發(fā)展相對(duì)滯后。隨著臨床上抗菌藥的濫用，真菌耐藥性隨之蔓延，且臨床有效抗真菌的品種有限。

真菌耐藥性的一個(gè)原因是真菌在人體的生物材料表面形成生物被膜。生物被膜是一個(gè)微生物聚集群體，是微生物不可逆地與無(wú)活力物體或活組織表面接觸，由自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹著活菌細(xì)胞形成的微生態(tài)，其具有高度耐藥性的特異表型。有研究報(bào)道，白念珠菌形成生物被膜后對(duì)氟康唑的敏感性下降幾百倍，對(duì)兩性霉素B的敏感性下降幾十倍。目前臨床對(duì)白色念珠菌的生物被膜尚無(wú)理想對(duì)策。(參見(jiàn)；趙蘭雪.抗白念珠茵生物被膜中藥成分的篩選及機(jī)制研究[D].福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士論文，2013：1-2.)。

真菌由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)毒力增強(qiáng)會(huì)增強(qiáng)。白色念珠菌作為臨床上的一種機(jī)會(huì)致病性真菌，其生長(zhǎng)形態(tài)具有二相性，它能夠依外界環(huán)境的變化從酵母態(tài)變?yōu)榫z態(tài)。而菌絲態(tài)因其有著粘附和侵襲的優(yōu)勢(shì)，容易造成宿主的感染，因而白色念珠菌酵母態(tài)到菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變將顯著增強(qiáng)它的毒力。(參見(jiàn)；常文強(qiáng).Retigeric acid B的抗真菌機(jī)制及白色念珠菌中分子工具的構(gòu)建[D].山東大學(xué)博士論文，2013：1-2.)

綜上所述，發(fā)現(xiàn)高效低毒無(wú)耐藥性的新型抗真菌藥物已經(jīng)迫在眉睫。中藥是我們國(guó)家的寶庫(kù)，有悠久的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)方面和作用機(jī)制方面存在多樣性，收到廣泛的重視。由于中藥和天然藥物具有豐富的資源、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，且在現(xiàn)在技術(shù)的幫助下發(fā)現(xiàn)其未知的藥理活性，使中藥再次成為大家研究的熱點(diǎn)，也使我們看到抗真菌藥研究的新希望。

為了研究新型抗真菌藥物，本發(fā)明以中藥白薇為研究對(duì)象。白薇為蘿摩科鵝絨藤屬植物直立白薇Cynanchum atratum Bunge.或蔓生白薇Cynanchum versicolor Bunge.的干燥根及根莖，具有清熱涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效，用于溫邪傷營(yíng)發(fā)熱、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、產(chǎn)后血虛發(fā)熱、熱淋、血淋、癰疽腫毒等癥。直立白薇多生于山坡或樹(shù)林邊緣，分布于東北、中南、西南以及河北、山西、陜西、山東、安徽、江西、福建、湖北等地。直立白薇的化學(xué)成分主要為C21甾體皂苷類(lèi)化合物，這類(lèi)成分廣泛存在于同屬植物中。C21甾體皂苷類(lèi)化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛，退熱和抗腫瘤等藥理活性(參見(jiàn)：鄭兆廣，張衛(wèi)東，柳潤(rùn)輝，張川，孔令義.蔓生白薇的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2006,37(7)987-989.)

白薇始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清熱、涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效，用于溫邪傷營(yíng)發(fā)熱、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、產(chǎn)后血虛發(fā)熱、熱淋、血淋、癰疽腫毒等癥。現(xiàn)代藥理表明白薇具有：退熱、消炎、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、抗腫瘤、抗失憶、抗細(xì)菌等作用。而抗細(xì)菌作用僅見(jiàn)于1992年出版的《中藥藥理毒理與臨床》中報(bào)道的白薇中的皂苷對(duì)肺炎球菌有抑制作用。(參見(jiàn)：趙新超.直立白薇質(zhì)量研究[D].山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士論文，2009：7-8.)

目前，尚未見(jiàn)有關(guān)白薇抗真菌的報(bào)到，也未見(jiàn)其作為協(xié)同抗真菌增效藥物的相關(guān)報(bào)道。經(jīng)查新，以往均無(wú)白薇提取物作為主要進(jìn)行配制的防治真菌感染疾病的藥物的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種白薇作為抗真菌類(lèi)藥物的新用途。

本發(fā)明的第一方面，提供白薇作為抗真菌類(lèi)藥物的新用途，即，白薇在制備抗真菌藥物、抗真菌藥物增效劑、抗真菌生物被膜藥物(試劑)以及抗真菌菌絲藥物(試劑)中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的白薇為直立白薇。

優(yōu)選的，所述的白薇是經(jīng)75％乙醇粗提，再通過(guò)二氯甲烷萃取，最后采用大孔樹(shù)脂富集60％的乙醇溶液洗脫部位的餾分，得白薇活性成份。

更優(yōu)選的，所述白薇活性成份，具體通過(guò)如下方法獲得：

1)75％乙醇粗提：白薇50g研磨成粉末，過(guò)20目篩，5倍量的75％乙醇50℃浸泡24h，超聲提取30min，重復(fù)操作2次，合并2次提取液，離心取上清液，得終濃度為200mg生藥/ml的提取液，置于4℃冰箱備用；

2)二氯甲烷萃取：取步驟1)制備的提取液1000ml，減壓回流干燥至無(wú)醇味得浸膏，將浸膏與等體積的水混懸，不斷攪拌，混合均勻，然后用等體積二氯甲烷萃取，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干至浸膏，保存到4℃冰箱備用；

3)大孔樹(shù)脂富集：將步驟2)制備的二氯甲烷浸膏，超聲用水溶解，過(guò)D101大孔樹(shù)脂，富集60％的乙醇溶液洗脫部位的餾分，旋干至浸膏，制得白薇活性成分。

優(yōu)選的，所述抗真菌藥物增效劑中的抗真菌藥物是氟康唑、酮康唑、伏立康唑或兩性霉素B等抗真菌藥物。

優(yōu)選的，所述的真菌是深部真菌菌株、淺部真菌菌株、敏感菌株或耐藥菌株。

優(yōu)選的，所述的真菌是白色念珠敏感菌Y0109、白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)均sc5314、白色念珠耐藥菌102、白色念珠耐藥菌103、近平滑念珠菌22019、光滑念珠菌537、新生隱球菌32609、石膏樣小孢子菌Cmccfmza、紅色毛癬菌Cmccftla或煙曲霉菌7544。

優(yōu)選的，所述的白薇在抗真菌菌絲藥物(試劑)中的應(yīng)用是指白薇經(jīng)乙醇粗提得終濃度為200mg生藥/ml的提取液，該提取液用于抑制真菌菌絲的形成。

本發(fā)明的第二方面，提供一種抗真菌的藥物組合物，所述藥物組合物的活性成分是抗真菌藥物和白薇。

優(yōu)選的，所述的抗真菌藥物是氟康唑、酮康唑、伏立康唑或兩性霉素B等抗真菌藥物。

優(yōu)選的，所述的藥物組合物的活性成分是氟康唑和直立白薇。

本發(fā)明的第三方面，提供一種抗白念珠菌生物被膜的藥物組合物，所述藥物組合物的活性成分是抗白念珠菌生物被膜藥物和白薇。

優(yōu)選的，所述的藥物組合物的活性成分是兩性霉素B和直立白薇。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，白薇對(duì)常見(jiàn)深部真菌和淺部真菌均有很好的抑制作用，對(duì)于耐藥真菌，抗真菌藥物與白薇合用時(shí)，能明顯降低常規(guī)抗真菌藥物的藥物劑量，能不同程度地提高常用抗真菌藥對(duì)真菌的抑制作用，并能使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，增強(qiáng)對(duì)耐藥真菌的抑制作用。

白薇具有抗真菌生物被膜活性，不僅能抑制真菌生物被膜的粘附、生長(zhǎng)增殖，而且能協(xié)同兩性霉素B顯著地抗生物被膜。白薇醇提物在200μg/ml(生藥)的濃度下，能完全抑制白念菌絲形成。

白薇具有顯著地抗真菌及其協(xié)同抗真菌的活性，直立白薇具有抗菌效果，對(duì)常見(jiàn)致病真菌(白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、石膏樣小孢子菌、紅色毛癬菌、煙曲霉菌)均有抑制作用。直立白薇的75％乙醇粗提物分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取后檢測(cè)其抗真菌的活性，發(fā)現(xiàn)二氯甲烷萃取部位的抗菌活性效果最好。然后用D101大孔樹(shù)脂富集二氯甲烷的活性部位，流動(dòng)相為0％、30％、60％、100％的乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)60％乙醇部位的抑菌效果最好。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明為中藥白薇開(kāi)辟了新的用途，不僅本身具有抗真菌的作用，而且用于抗真菌藥物的增效劑，不但能提高藥物的抗真菌作用，而且在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，可降低抗真菌藥物的用藥劑量，為患者節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用，并可減少藥物的毒副作用。

本發(fā)明的中藥白薇是我國(guó)傳統(tǒng)藥物，具有資源豐富，價(jià)格便宜，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，白薇和抗真菌藥物合用也能夠減少藥物的毒副作用，節(jié)省患者的醫(yī)藥費(fèi)用。

附圖說(shuō)明

圖1是白薇1mg～4mg對(duì)白念標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314和白念耐藥菌103不同程度的抑制作用以及白薇1mg-4mg與氟康唑合用的協(xié)同作用；

其中，a-白念標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314；b-白念耐藥菌103；c-白念耐藥菌103+氟康唑6μg/ml；d-白念耐藥菌103+氟康唑12μg/ml；

a、b、c、d中對(duì)應(yīng)位置的6片藥物為：1-白薇1mg/片；2-氟康唑10μg/片；3-白薇4mg/片；4-白薇3mg/片；5-空白紙片；6-白薇2mg/片。

圖2是不同濃度白薇醇提液抑制白念珠菌菌絲的作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1：白薇醇提取液?jiǎn)为?dú)抗常見(jiàn)致病真菌的作用

一、材料和方法

1、試劑

白薇：上海雷允上醫(yī)藥有限公司中藥部

氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LC)：美國(guó)Sigma公司

伏立康唑(Voriconazole，VCZ)：美國(guó)Sigma公司

酮康唑(Ketoconazole，KCZ)：美國(guó)Sigma公司

無(wú)水乙醇：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司

石油醚：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司

二氯甲烷：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司

乙酸乙酯：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司

正丁醇：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司

其它試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑

2、菌株

白念珠菌(Candida albicans)標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314、敏感菌Y0109由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)的WilliamA.Fonzi教授惠贈(zèng)，白念珠菌耐藥菌(Candida albicans)102、103、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)ATCC 22019、光滑念珠菌(Candida glabrata)537、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)32609、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)Cmccfmza、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)Cmccftla、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)7544均由長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供。所有菌株已經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定。

3、培養(yǎng)基

RPMI 1640液體培養(yǎng)液：RPMI 1640 10g，NaHCO3 2.0g，嗎啡啉丙磺酸34.5g，NaOH調(diào)pH至7.0，三蒸水定容1 000ml，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌；4℃保存?zhèn)溆谩pider培養(yǎng)液(PH 7.2)：營(yíng)養(yǎng)肉湯10g，甘露醇10g，磷酸氫二鉀2g，三蒸水定容1000ml，高壓滅菌，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1 000ml，高壓滅菌，于4℃保存。

沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)：蛋白胨10g、葡萄糖40g、瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調(diào)整pH值至7.0，定容至1 000ml，高壓滅菌，4℃保存。

4、儀器

DL-1000B智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)，

SW-CT-IF型單人雙面超凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥Nunclon公司)，

12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，

80A漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)，

THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，

XW-Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)，

倒置顯微鏡(美國(guó)EVOS公司)，

單反相機(jī)(日本Nikon公司)。

5、白薇粗提取液的制備：

白薇50g研磨成粉末，過(guò)20目篩，5倍量的75％乙醇50℃浸泡24h，超聲提取30min，2次，合并2次提取液，離心取上清液，得終濃度為200mg生藥/ml的提取液，置于4℃冰箱備用。

6、白薇二氯甲烷部位的制備：

將保存的白薇粗提物1000ml，減壓回流干燥至無(wú)醇味，得浸膏，將浸膏與等體積的水混懸，不斷用玻璃棒攪拌，使混合完全。然后用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，剩余部位為水部位。分別旋轉(zhuǎn)蒸干至浸膏，取少量用75％乙醇配置成6.4mg/mL的溶液(用于檢測(cè)石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位的抑菌活性，見(jiàn)表2)，剩余浸膏保存到4℃冰箱備用。

7、白薇大孔樹(shù)脂100％乙醇餾分的制備：

將保存的二氯甲烷浸膏，用水超聲溶解，過(guò)D101大孔樹(shù)脂，流動(dòng)相為0％、30％、60％、100％的乙醇溶液，富集各部位的餾分并旋干至浸膏，取少量用75％乙醇配置成6.4mg/mL的溶液，待測(cè)。

8、陽(yáng)性藥的配制

以二甲亞砜(DMSO)溶解FLC、VCZ、KCZ，配制成6.4μg/ml藥物母液，置于4℃冰箱備用。

9、菌液制備

菌株活化酵母菌35℃SDA固定培養(yǎng)板孵育24-48h，挑取單克隆接種至含YEPD培養(yǎng)液，于30℃、200rpm/min振蕩培養(yǎng)16h后，使其處于指數(shù)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，以保證菌的純度和活力；絲狀菌煙曲霉35℃馬鈴薯斜面培養(yǎng)基孵育7天，無(wú)菌紗布過(guò)濾。

菌懸液配制血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整酵母菌液濃度至0.5×103CFU/ml～2.5×103CFU/ml、絲狀菌液濃度0.5×104CFU/ml～2.5×104CFU/ml用于藥敏實(shí)驗(yàn)。離心收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期白念珠菌，用滅菌的PBS緩沖溶液(PH7.2)清洗3次，將白念珠菌細(xì)胞混懸于1ml Spider培養(yǎng)液中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)菌濃度為1.0×106cells/ml用于菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及生物被膜實(shí)驗(yàn)。

10、藥物敏感測(cè)試板的制備

按2009和2008年CLSI推薦標(biāo)準(zhǔn)M27-A3和M38-A2方案：取無(wú)菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100μl；2號(hào)孔分別加菌液198μl和白薇提取物2μl；2～11號(hào)孔進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)垢骺椎淖罱K藥物濃度分別為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906μg/ml，各孔中乙醇的含量均低于1％。12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100μl作生長(zhǎng)對(duì)照。陽(yáng)性藥FLC、VCZ和KCZ的終濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.0313μg/ml。各孔中DMSO的含量均低于1％。藥敏板于35℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，念珠菌和煙曲霉孵育48h、新生隱球菌孵育72h，用酶標(biāo)分析儀于630nm測(cè)各孔OD值，并輔以目測(cè)。

11、最低抑菌濃度(MIC值)

與生長(zhǎng)對(duì)照孔比較≥90％生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為氟康唑和中藥提取物的MIC90。生長(zhǎng)對(duì)照孔的OD值控制在0.2左右，與生長(zhǎng)對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降90％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC90(真菌生長(zhǎng)90％被抑制時(shí)的藥物濃度)。中藥提取物大多顏色較深可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，輔以目測(cè)，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度。每塊藥敏板均設(shè)有質(zhì)控菌株及質(zhì)控化合物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中質(zhì)控株近平滑念珠菌ATCC22019、質(zhì)控化合物氟康唑、伏立康唑、酮康唑MIC波動(dòng)范圍不超過(guò)1個(gè)藥物梯度濃度，且均在CLSI-M27-A3和CLSI-M38-A2公布的質(zhì)控菌株MIC標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，即本研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間段重復(fù)3次，三次結(jié)果不超過(guò)一個(gè)濃度差則可信，且以高濃度MIC為準(zhǔn)，若不符，再次重復(fù)測(cè)定。

12、紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

用0.9％生理鹽水調(diào)菌懸液濃度為1.0×106cells/ml，取3ml鋪于YEPD固體培養(yǎng)基，35°恒溫培養(yǎng)30min，棄上層液體，待液體揮干，在板上放含不同劑量藥物的無(wú)菌紙片，倒置平皿于35°培養(yǎng)箱孵育48h，觀察抑菌圈內(nèi)外菌落狀態(tài)，并拍照。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

由表1中可見(jiàn)，蔓生白薇對(duì)各類(lèi)真菌均無(wú)效，直立白薇對(duì)念珠菌屬及臨床耐藥白念珠菌均有很好的抑制作用，對(duì)常見(jiàn)深部真菌新生隱球菌、煙曲霉以及淺部致病真菌石膏狀小孢子菌、紅色毛癬菌抑制作用也較為明顯。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中藥直立白薇對(duì)常見(jiàn)致病真菌均有很好的抗真菌作用。

由表2可知，發(fā)現(xiàn)白薇的活性部位為二氯甲烷部分，對(duì)白念珠菌Y0109和新生隱球菌32609的MIC90為1μg/ml，通過(guò)D101大孔樹(shù)脂進(jìn)一步追蹤其活性部位，發(fā)現(xiàn)白薇二氯甲烷60％-100％乙醇洗脫部位是其活性較好的部位，抗真菌作用較強(qiáng)。

圖1表示白薇1mg～4mg對(duì)白念標(biāo)準(zhǔn)菌和耐藥菌103均有不同程度的抑制作用，氟康唑10μg并無(wú)抑菌圈；白薇1mg-4mg與氟康唑合用，抑菌圈均明顯擴(kuò)大，說(shuō)明有較好的協(xié)同作用。

實(shí)施例2：白薇與氟康唑聯(lián)合對(duì)白念珠菌的作用

材料和方法

1、藥敏板的制備

取無(wú)菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100μl；2號(hào)孔分別加菌液198μl和白薇提取物2μl；2～11號(hào)孔進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)垢骺椎淖罱K藥物濃度分別為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906μg/ml，各孔中乙醇的含量均低于1％。12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100μl作生長(zhǎng)對(duì)照。將各藥敏板于30℃恒溫箱培養(yǎng)。

其他實(shí)驗(yàn)步驟和方法同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3白薇與氟康唑聯(lián)合對(duì)2株臨床白念珠菌的MIC₈₀值(μg/ml)

由表3可知，白薇不但具有抗真菌作用，而且與抗真菌藥物氟康唑協(xié)同具有抗菌增效作用。氟康唑單用的MIC80值均大于1024μg/ml，合用4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml的氟康唑后，白薇的MIC80由250μg/ml下降到31.25～125μg/ml，顯示了白薇提取物對(duì)氟康唑的增效作用。

實(shí)施例3：白薇與兩性霉素B聯(lián)合使用對(duì)白念珠菌生物被膜的作用

材料和方法：

1、試劑

白薇：上海雷允上醫(yī)藥有限公司中藥部。

兩性霉素B：購(gòu)自生工生物工程有限公司。

XT：購(gòu)自Sigma公司。

甲萘醌(menadione)：購(gòu)自Sigma公司。

二甲亞砜(DMSO)：中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司。

兩性霉素B用二甲亞砜溶解，配成所需濃度，于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

XTT用滅菌的PBS配成0.5mg/ml的飽和溶液，用0.22μm孔徑的濾器濾過(guò)除菌，甲萘醌(menadione)用100％丙酮配成10mM溶液，XTT、甲萘醌(menadione)于-80℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置4℃冰箱、35℃溫箱梯度融化，充分混勻，進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2、抗白念珠菌生物被膜藥敏板制備：取無(wú)菌96孔板，于每排11號(hào)孔加RPMI 1640培養(yǎng)液150μl作陽(yáng)性對(duì)照；2～10號(hào)孔各加RPMI 1640培養(yǎng)液150μl；1號(hào)孔分別加入RPMI 1640培養(yǎng)液298.8μl和兩性霉素B溶液1.2μl。1～10號(hào)孔10級(jí)倍比稀釋?zhuān)垢骺椎陌邹弊罱K藥物濃度分別為5000、2500、1250、625、312.5、156.25、和78.13μg/ml，兩性霉素B最終藥物濃度分別為8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％。取出培養(yǎng)90min的生物被膜板，用PBS緩沖溶液洗3次，取配好的含藥物培養(yǎng)液100μl加入到被膜板對(duì)應(yīng)的孔中，12號(hào)孔不培養(yǎng)生物被膜，作陰性對(duì)照。各藥敏板于37℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24h(一系列不含化合物的孔作為空白對(duì)照也采用上述培養(yǎng)方式培育)。

3、黏附最低抑菌濃度(sessile minimum inhibitory concentration，SMIC)的測(cè)定白念珠菌生物被膜于37℃培養(yǎng)24h后，取出生物被膜板，用PBS緩沖溶液輕輕洗3次，每孔加入200μl XTT/menadione(12號(hào)孔也加)，避光，37℃靜置孵育2-3h，取出生物被膜板，吸取100μl XTT/menadione至無(wú)菌96孔板中，用Infinite M200多功能酶標(biāo)儀(TECAN,Austria)于490nm測(cè)各孔OD值(直接反映被膜細(xì)胞代謝活性變化)。與陽(yáng)性對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為SMIC80(生物被膜生長(zhǎng)80％被抑制時(shí)的藥物濃度)。當(dāng)藥物的SMIC80值超過(guò)白薇測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：SMIC80值高于最高濃度64μg/ml時(shí)，計(jì)為“>64μg/ml”；SMIC80值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為“≤0.125μg/ml”。

4、聯(lián)合用藥的效果評(píng)價(jià):

部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)是評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù)。抑菌濃度分?jǐn)?shù)(FIC)，分別為每一種藥物聯(lián)合抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度(MIC)與單用時(shí)MIC的比值.而FIC指數(shù)(FICI)則等于兩種藥物FIC之和。很多文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)FICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FIC指數(shù)越小，協(xié)同作用越強(qiáng)；0.5<FICI≤1時(shí)兩藥的相互作用確定為相加作用；1<FICI≤4時(shí)為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)FICI>4時(shí)兩藥產(chǎn)生拮抗作用

上述實(shí)驗(yàn)均平行操作6次，當(dāng)SMIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)才被接受，并以較高濃度作為SMIC80值；當(dāng)SMIC80值相差兩個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。XTT還原法的基本原理在于四氮唑鹽能夠在電子耦合劑甲萘醌的作用下，通過(guò)具有線粒體活性的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有特殊顏色的甲月替四氮唑鹽。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4

表4白薇及其和兩性霉素B聯(lián)合對(duì)白念珠菌成熟被膜的抑制效果

表4結(jié)果顯示：白薇、兩性霉素B單獨(dú)用藥對(duì)白念標(biāo)準(zhǔn)菌生物被膜均有抑制作用，而氟康唑則沒(méi)有抑制生物被膜的作用；白薇合用0.0625～0.25μg/ml的兩性霉素B后，SMIC80值由625μg/ml下降到125～31.25μg/ml，顯示了白薇提取物對(duì)兩性霉素B協(xié)同抗生物被膜作用。

實(shí)施例4：白薇醇提液抑制白念珠菌菌絲的作用

材料和方法

1、藥敏板制備

取無(wú)菌12孔細(xì)胞培養(yǎng)板一塊，每孔加入1ml 1.0×106cells/ml菌懸液，加入含有不同藥物濃度中藥醇提取液(v≤20μl)，37℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)3h，在EVOS xl型倒置顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀況并拍照。

其它實(shí)驗(yàn)步驟和方法同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：白薇醇提物在200μg/ml(生藥)的濃度下，能完全抑制白念菌絲形成。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。