本發明涉及止血海綿制備技術領域，更具體地，涉及一種烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿及其制備方法和應用。

背景技術：

生物醫用材料作為一種新型的止血材料，是被認為局部外傷止血最有效的材料之一，具有可吸收、高效、經濟以及無毒等優點，隨著救治過程中對局部外傷止血的要求越來越高，其止血功效就顯得越來越重要。它主要是通過自身材料的特征與優勢，吸附血液，凝聚血小板，堵塞血管，促進凝血酶產生或激活凝血因子，從而達到止血作用。

目前較為成熟的生物止血材料主要有海藻酸鹽海綿、殼聚糖海綿、膠原蛋白海綿以及一些復合海綿等。這些材料由于成分不同，止血機制、止血效果和生物相容性等也各有特點。

比如說殼聚糖是來源廣泛的甲殼素脫乙酰化的天然高分子，生物相容性好，通過作用于紅細胞，使其發生聚集而使血液凝固。但是不能激活凝血因子Ⅻ，其止血作用有限。膠原蛋白海綿利用大面積結構破壞血小板促進凝血，但一般來說動物源性膠原蛋白的生物相容性較差。海藻酸鹽海綿高吸濕性的特點，其生物相容性不如殼聚糖海綿；現有技術中的發明專利所述的膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復合止血海綿雖然解決了止血海綿在生物相容性、吸濕性、啟動凝血因子等方面的問題，但由于這幾種材料的止血作用都不及烏賊墨全面，相關文獻有提到，經過臨床觀察，現已證實烏賊墨是一種很好的全身性止血藥，對婦科、內科的許多出血性疾病有顯著療效。烏賊產量高，分布廣，藥源充足，成本低廉，有無副作用。因此該復合海綿還存在止血作用不夠全面的缺點。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的生物相容性差、止血時間較長、吸收滲血效果不佳，創傷修復能力較弱、止血作用不夠全面、毒副作用或者刺激性強、制備時間較長上述缺陷，提供一種烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿。

本發明的第二個目的是提供所述烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的制備方法。

本發明的第三個目的是提供所述烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：

一種烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的制備方法，是將0.4～0.8mg/mL烏賊墨多糖溶液緩慢加入1.5～3.5%殼聚糖溶液中，混勻后，加入2～6%氯化鈣溶液，待形成凝膠后，將凝膠凍結，再進行冷凍干燥即得。

本發明所制備方法中用到殼聚糖，殼聚糖在作為藥用材料發揮止血優勢的同時，由于其具有一定的黏度，便于混合液形成水凝膠，使海綿產品外形美觀，吸附性良好，大大增強了海綿產品止血時封堵傷口，吸附滲血的能力。烏賊墨多糖的主要作用是提供強大而全面的止血功效，彌補殼聚糖不能激活凝血因子Ⅻ的不足之處。氯化鈣則主要提供交聯作用，使得海綿產品網狀結構整齊，孔隙分布均勻，質地松軟，韌性良好。

在海綿的制備過程中，冷凍干燥的效果決定了海綿產品的質量。經過查閱對比，本發明中整個止血海綿的制備工藝所耗時間比現有大部分類似研究都要短，既減少了耗能，又提高了生產效率。

優選地，所述烏賊墨多糖溶液與殼聚糖溶液的體積比為1：2～1：3。

優選地，所述冷凍干燥的時間為16～20h。

本發明采用星點設計-效應面法來優選制備止血海綿的最優處方，以殼聚糖濃度、烏賊墨多糖濃度和氯化鈣濃度作為考察因素；以海綿產品的外觀質量綜合評分和吸水倍數作為考察指標，運用Design-Expert.V8.0.6軟件生成星點設計實驗結果表，并對實驗結果進行方差分析，得出效應面圖，通過分析效應面圖，從而得出最優處方，最后利用軟件給出的最優處方制備海綿產品與預測指標值比較，最終得到的烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿質量良好。最優處方為殼聚糖濃度2.29%、烏賊墨多糖濃度0.55mg/ml、氯化鈣濃度2.82%。

因此，作為一種具體的實施方式，本發明所述烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的制備方法，是將0.55 mg/ml的烏賊墨多糖溶液緩慢加入2.29%的殼聚糖溶液中，混勻后，再加入2mL 2.82%的氯化鈣溶液，待形成凝膠后，轉到-20℃凍結12h，再進行冷凍干燥 16h即得；所述0.55 mg/ml的烏賊墨多糖溶液與2.29%的殼聚糖溶液的體積比為1：3。

本發明還提供上述方法制備得到的烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿。

本發明還提供所述烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的應用。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明提高了一種烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿的制備方法，是將0.4～0.8mg/mL烏賊墨多糖溶液緩慢加入1.5～3.5%殼聚糖溶液中，混勻后，加入2～6%氯化鈣溶液，待形成凝膠后，將凝膠凍結，再進行冷凍干燥即得；采用星點設計-效應面法來優選制備止血海綿的最優處方，以殼聚糖濃度、烏賊墨多糖濃度和氯化鈣濃度作為考察因素；以海綿產品的外觀質量綜合評分和吸水倍數作為考察指標，運用Design-Expert.V8.0.6軟件生成星點設計實驗結果表，并對實驗結果進行方差分析，得出效應面圖，通過分析效應面圖，從而得出最優處方，最后利用軟件給出的最優處方制備海綿產品與預測指標值比較，最終得到的烏賊墨多糖/殼聚糖止血海綿質量良好。殼聚糖在作為藥用材料發揮止血優勢的同時，由于其具有一定的黏度，便于混合液形成水凝膠，使海綿產品外形美觀，吸附性良好，大大增強了海綿產品止血時封堵傷口，吸附滲血的能力。烏賊墨多糖的主要作用是提供強大而全面的止血功效，彌補殼聚糖不能激活凝血因子Ⅻ的不足之處。氯化鈣則主要提供交聯作用，使得海綿產品網狀結構整齊，孔隙分布均勻，質地松軟，韌性良好。

附圖說明

圖1為烏賊墨多糖濃度和氯化鈣濃度對止血海綿外觀質量綜合評分的響應面分析。

圖2為烏賊墨多糖濃度和殼聚糖濃度對止血海綿外觀質量綜合評分的響應面分析。

圖3為氯化鈣濃度、烏賊墨多糖濃度、殼聚糖濃度對止血海綿吸水倍數的響應面分析。

圖4為本發明制備得到的止血海綿的產品圖；圖4A為產品正面圖，圖4B為產品側面圖，圖4C為產品電鏡圖；圖4D為產品吸水效果圖。

具體實施方式

下面將結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領域技術人員所熟知的常規方法和技術，試劑或材料均為通過商業途徑得到。

一、外觀質量綜合評分細則

外觀質量從制得止血海綿的外觀、表面特征和電鏡圖三方面進行評分，共50分，具體評分細則如下：

1、外觀（滿分20分）

從海綿的形狀（占10分）和顏色（占10分）兩個方面進行打分。海綿的形狀如果為平整的圓形，則為最高分10分，若不成圓形，有部分凹陷或者翹起，則會扣掉相應的得分，最低分為1分；顏色均勻、雪白則為最高分10分，若顏色偏黃或不均勻則根據顏色越黃扣除更多分數，最低分為1分。

2、表面特征（滿分10分）

海綿的表面如果疏密一致、呈海綿狀、且質地輕、富有彈性、手感好，則為最高分10分，若出現明顯裂縫、表面孔隙粗細不一、彈性差，則會扣掉相應的得分，最低分為1分。

3、電鏡圖（滿分20）

從海綿表面撕下一小塊薄層，用光學顯微鏡觀察其表面結構，如果為網狀結構，表面呈開放性孔洞，在空間上分布均勻，則為最高分20分；若觀察到海綿的網狀結構不明顯、孔洞分布不均勻則會扣掉相應的得分，最低分為1分。

4、吸水倍數計算

剪取1cm×1cm的海綿小塊，稱重記為W1，放入約20℃純凈水中浸泡，使其充分吸水后，用鑷子輕輕夾住一角提出水面，自然瀝水約30秒后稱重，記為W2，精確至0.001g，計算（W2－W1）/ W1得到吸水倍數。

實施例1

將烏賊墨多糖溶于水，配成一定濃度的烏賊墨多糖溶液（A液）；將殼聚糖溶于1%醋酸溶液中，配成一定質量濃度的殼聚糖溶液（B液）；量取一定量的B液，置50ml燒杯中，緩慢加入一定量的A液，攪拌均勻；另取一定量的氯化鈣溶液加入到上述燒杯溶液中，加速充分攪拌使之混勻，混合液倒入直徑為6cm的培養皿中，觀察膠凝狀態，待完全形成凝膠后，培養皿轉到-20℃凍結12h，再進行冷凍干燥 16～20h，制成多孔隙海綿狀固體，即烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿。

（1）殼聚糖分子量對制備復合止血海綿工藝的影響

考察殼聚糖分子量共5個水平，分別為1萬、20萬、40萬、60萬、80萬，控制殼聚糖質量濃度2.5%、烏賊墨多糖濃度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化鈣質量濃度4%，按照上述制備方法制備烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，考察殼聚糖分子量對制備復合止血海綿工藝的影響，實驗結果見表1。

由表1可知，隨著殼聚糖分子量的增大，海綿的外觀質量綜合評分會相對提高；吸水倍數方面，1萬分子量殼聚糖對應復合止血海綿的吸水倍數雖然最高，但是由于其他項得分過低，且在水中極容易溶散，吸附性差，不利于貼附傷口。根據實驗結果，20萬分子量殼聚糖對應的止血海綿外觀質量綜合評分高達42分，吸水倍數為17.41倍。綜合來看，20萬分子量殼聚糖對應的復合止血海綿質量較優。

（2）烏賊墨多糖濃度對制備復合止血海綿工藝的影響

考察烏賊墨多糖溶液的濃度共5個水平，分別為0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml，控制殼聚糖分子量20萬、殼聚糖質量濃度2.5%、配比（A液：B液）1：3、氯化鈣質量濃度4%，按照上述制備方法制備烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，考察烏賊墨多糖濃度對制備復合止血海綿工藝的影響，實驗結果見表2。

由表2可知，烏賊墨多糖濃度過高或過低都會降低其對應海綿的外觀質量，和影響吸水情況。因此，分別選取烏賊墨多糖濃度為0.2mg/ml和1.0mg/ml作為星點設計中優化處方的水平范圍。

（3）殼聚糖質量濃度對制備復合止血海綿工藝的影響

考察殼聚糖質量濃度共5個水平，分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，控制殼聚糖分子量20萬、烏賊墨多糖濃度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化鈣質量濃度4%，按照上述制備方法制備烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，考察殼聚糖濃度對制備復合止血海綿工藝的影響，實驗結果見表3。

表3可以看出：殼聚糖質量濃度低于0.5%時溶液會比較稀，不利于產品成海綿狀；而當殼聚糖質量濃度高于4.5%時，殼聚糖溶液過于黏稠，最終使得產品質地過硬，吸水倍數也有所下降。因此分別選取殼聚糖濃度為0.5%和4.0%作為星點設計中優化處方的水平范圍。

（4）A液：B液的比值對制備復合止血海綿工藝的影響

考察配比（A液：B液）共5個水平，分別為1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，控制殼聚糖分子量20萬、殼聚糖質量濃度2.5%、烏賊墨多糖濃度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化鈣質量濃度4%，按照上述制備方法制備烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，考察配比（A液：B液）對制備復合止血海綿工藝的影響，實驗結果見表4。

由表4可知，當烏賊墨多糖液與殼聚糖溶液配比為1:2和1:3時，海綿的外觀質量評分會相對較高；而配比為1:5的產品吸水倍數最低，且浸水后海綿黏性差，不利于貼附傷口；吸水倍數方面，雖然配比為1:1和1:4對應的產品吸水倍數較高，但是由于其浸水后較易溶散，不利于傷口止血。綜合來看，配比為1:3對應的產品質量較優。

（5）氯化鈣濃度對制備復合止血海綿工藝的影響

考察氯化鈣質量濃度共5個水平，分別為1%、2%、4%、6%、10%，控制殼聚糖分子量20萬、殼聚糖質量濃度2.5%、烏賊墨多糖濃度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3，按照上述制備方法制備烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，考察氯化鈣濃度對制備復合止血海綿工藝的影響，實驗結果見表5。

由表5可知，氯化鈣質量濃度過低或者過高都會降低產品的外觀質量，濃度過低會使得海綿質地過硬，沒有其他產品具有的松軟感；濃度過高則會使得海綿入水即溶散，極不穩定。因此分別選取氯化鈣質量濃度為1%和10%作為星點設計中優化處方的水平范圍。

實施例2星點設計-效應面法實驗設計

以止血海綿的外觀質量綜合評分和吸水倍數為考察指標，對烏賊墨多糖濃度、殼聚糖質量濃度、氯化鈣質量濃度三個因素進行考察。根據星點設計-效應面法的原理，進行3因素5水平實驗設計，因素及水平見表6。

通過Design-Expert.V8.0.6軟件生成20種處方組合，實驗結果見表7。

以Y₁和Y₂為因變量，運用Design-Expert.V8.0.6軟件以各因變量分別對自變量進行多元線性回歸、二項式、三項式擬合，并以復相關系數（R2）和置信度（P）為模型判定標準，選擇較大R2值和較優P值對方程進行優化。軟件顯示，線性回歸和二項式各擬合方程的復相關系數均較低，說明模型擬合度不高，自變量與因變量之間的線性相關性較差，因此不宜用線性和二次項模型。而多元三項式各擬合方程的復相關系數均較高，說明具體實驗因素對效應值的影響不是簡單的線性關系。多元三項式的擬合方程如下：

Y₁=41.27+3.24A+1.19B-0.74C+0.99AB+1.12AC+1.11BC-3.25A2-2.11B2+0.29C2+0.62ABC-0.20A2B-0.13A2C-1.88AB2（R2=0.8121，P＜0.05）

Y₂=10.53+0.56A-1.18B-16.77C-0.0037AB+3.62AC+1.23BC-0.78A2-0.88B2+8.46C2-0.27ABC+0.52A2B+9.84A2C-4.70AB2（R2=0.9978，P＜0.0001）

根據三項式擬合方程，運用Design-Expert.V8.0.6軟件，分別固定3個變量之一為中值，繪制Y₁和Y₂的三維等高線效應面圖，結果見圖1、圖2和圖3。

外觀質量綜合評分的效應面圖（圖1、圖2）：a.烏賊墨多糖濃度與氯化鈣質量濃度的效應面（固定殼聚糖質量濃度=2.25%）；b.殼聚糖質量濃度與氯化鈣質量濃度的效應面（固定烏賊墨多糖濃度=0.60mg/ml）；c.殼聚糖與烏賊墨多糖濃度的效應面（固定氯化鈣質量濃度=2.82%）。

吸水倍數的效應面圖（圖3）：a：烏賊墨多糖濃度與氯化鈣質量濃度的效應面（固定殼聚糖質量濃度=2.25%）；b: 殼聚糖質量濃度與氯化鈣質量濃度的效應面（固定烏賊墨多糖濃度=0.60mg/ml）；c: 殼聚糖與烏賊墨多糖濃度的效應面（固定氯化鈣質量濃度=2.82%）。

由圖1和圖2可以看出，當分別固定殼聚糖質量濃度、烏賊墨多糖濃度和氯化鈣質量濃度的值時，曲面變化程度圖c＞b＞a，表明三者對海綿外觀質量綜合評分的影響：氯化鈣質量濃度＜烏賊墨多糖濃度＜殼聚糖質量濃度。可見，海綿的外觀質量主要由殼聚糖質量濃度和烏賊墨濃度決定的。而在圖3中，曲面變化程度圖b＞a＞c，表明三者對海綿的吸水倍數的影響：烏賊墨多糖濃度＜殼聚糖質量濃度＜氯化鈣質量濃度。

綜合分析，在一定范圍內，適當增加殼聚糖質量濃度和烏賊墨濃度、減小氯化鈣質量濃度，可以提高海綿外觀質量綜合評分以及增大海綿的吸水倍數。這可能是因為殼聚糖溶液具有一定的稠度，其濃度越大越稠，而烏賊墨多糖是水溶性的，兩者混合，只有當殼聚糖稠度適中時，才能很好地形成凝膠，加上氯化鈣的交聯作用，從而得到外觀質量好的海綿。而氯化鈣質量濃度對于海綿吸水倍數的影響最為顯著則可能由于其交聯作用的特點。

選擇圖1、圖2和圖3中外觀質量綜合評分和吸水倍數最大的區域，即可得出烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿處方中3個自變量對應的變化范圍，結果見表8。運用Design-Expert.V8.0.6軟件預測最優值，選取最優處方如下：殼聚糖質量濃度為2.29%；烏賊墨多糖濃度為0.55mg/ml；氯化鈣質量濃度為2.82%。

取上述優化處方制備的烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿，對海綿外觀質量綜合評分以及吸水倍數進行試驗考察，比較模型預測值與實測值的外觀質量綜合評分和吸水倍數，結果見表9。

按照優化處方，制備的止血海綿柔軟多孔，吸水后黏度適中，在外觀質量綜合評分上與預測值相差不大。不過吸水倍數的實測值與預測值偏差較大，這可能是由于制定的外觀質量綜合評分規則不夠完善，且主觀性較強，表現出負相關系數不高，導致軟件在分析時不能精確地反映因素間的相互影響，使得軟件預測最優處方以及效應值時受到了影響，最終產生了較大的偏差。但是，吸水倍數在20左右，說明制得的烏賊墨多糖-殼聚糖止血海綿仍具有吸附滲血的功效，而且加上該海綿的其他止血優勢，相信此種新型止血海綿可以發揮全面的止血功效。