本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種細胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣β白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellularFas-assiciateddeathdomain-likeinterleukin-1β-convertingenzyme(FLICE)-likeinhibitoryprotein,cFLIP)作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細胞內(nèi)脂肪堆積過多的病變，為一種較為常見的臨床不良表現(xiàn)，可由多種疾病誘發(fā)，是眾多肝臟疾病對肝臟正常功能影響的綜合表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)輕者無癥狀，重者可危及生命。脂肪肝包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病，兩者都是全球常見的慢性肝病。非酒精性脂肪性肝病是一種與胰島素抵抗及遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性疾病。隨著人們生活水平的不斷提高，患病率呈不斷上升趨勢。非酒精性脂肪肝性肝病不僅可導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)異常、失代償期肝硬化、肝功能衰竭等嚴重肝病，也與心血管疾病、2型糖尿病、代謝綜合征的發(fā)生存在密切聯(lián)系，嚴重威脅著人們的健康。因此，非酒精性脂肪性肝病的治療越來越受到重視，其治療原則包括：(1)去除病因，治療原發(fā)基礎(chǔ)病；(2)基礎(chǔ)治療：生活方式干預(yù)、飲食調(diào)整及運動治療等基本措施；(3)針對不同的病理學(xué)特征，因人而異與輔助藥物治療；(4)終末期行肝移植治療。cFLIP是THOME[1]等于1997年首先在病毒中發(fā)現(xiàn)的，隨后IRMLER等在惡性色素細胞瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)了此蛋白的存在，即命名為cFLIP[2]。人類cFLIP基因位于2號染色體長臂33-34區(qū)，14個外顯子，并通過選擇性剪接產(chǎn)生多個基因[3]。該蛋白結(jié)構(gòu)上與Caspase-8相似，但無Caspase-8的蛋白水解酶活性。它與含死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(Fasassociateddeathdomain,FADD)結(jié)合，使Caspase-8不能活化，抑制Caspase-8介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑的細胞凋亡[4]。cFLIP不僅是經(jīng)典的死亡受體介導(dǎo)外源性細胞凋亡通路，而且也不是常規(guī)的模式識別受體依賴性凋亡通路[5]。此外，最近的研究表明，cFLIP也參與被稱為程序性的壞死或壞死的非凋亡細胞死亡通路。cFLIP的這些功能受異構(gòu)體、濃度和組織特異性的方式調(diào)控，泛素蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)cFLIP蛋白的穩(wěn)定性有重要作用。參考文獻[1].Thome,M.,etal.,ViralFLICE-inhibitoryproteins(FLIPs)preventapoptosisinducedbydeathreceptors.Nature,1997.386(6624):p.517-21.[2].Clarke,P.,etal.,InhibitionofNF-kappaBactivityandcFLIPexpressioncontributetoviral-inducedapoptosis.Apoptosis,2005.10(3):p.513-24.[3].Nakano,H.,etal.,CellularFLICE-InhibitoryProteinRegulatesTissueHomeostasis.CurrTopMicrobiolImmunol,2015.[4].Tsuchiya,Y.,O.NakabayashiandH.Nakano,FLIPtheSwitch:RegulationofApoptosisandNecroptosisbycFLIP.IntJMolSci,2015.16(12):p.30321-41.[5].Wittkopf,N.,etal.,CellularFLICE-likeinhibitoryproteinsecuresintestinalepithelialcellsurvivalandimmunehomeostasisbyregulatingcaspase-8.Gastroenterology,2013.145(6):p.1369-79.技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種cFLIP基因的表達與脂肪肝之間的相互關(guān)系，提供一個用于治療脂肪肝的靶基因cFLIP的新用途，進而把cFLIP基因應(yīng)用于脂肪肝的治療。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明以cFLIP肝臟特異性基因敲除小鼠(cFLIP-KO)與cFLIP-flox小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，DIO)研究cFLIP基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與cFLIP-flox小鼠對比，cFLIP-KO小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的cFLIP-flox小鼠，從小鼠肝臟大體外觀，肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說明HFD組(Highfatdiet，高脂飲食)的cFLIP-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明cFLIP基因敲除會加劇脂肪肝的發(fā)生，cFLIP基因能夠抑制脂肪肝發(fā)生。本申請的研究證明了：在高脂誘導(dǎo)的脂肪肝模型中，cFLIP具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護肝功能，特別是改善脂肪肝的作用。針對cFLIP的上述功能，提供cFLIP作為藥物靶標(biāo)在篩選保護肝臟的藥物中的應(yīng)用。針對cFLIP的上述功能，提供cFLIP作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。以上藥物是指能夠促進cFLIP基因表達的藥物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)cFLIP基因的新功能，即cFLIP基因具有能夠抑制脂肪肝的作用。(2)基于cFLIP在抑制脂肪肝中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝的藥物。附圖說明圖1是肝臟特異性cFLIP基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖。圖2是cFLIP-flox和cFLIP-KO小鼠的體重結(jié)果圖(*：p＜0.05vscFLIP-floxNC組，**：p＜0.01vscFLIP-floxNC組，#：p＜0.05vscFLIP-floxHFD組，##：p＜0.01vscFLIP-floxHFD組)。圖3是cFLIp-KO和cFLIP-flox小鼠的肝臟大體外觀結(jié)果圖；A為肝臟重量，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖(##：p＜0.01vscFLIP-floxHFD組)。圖4是cFLIP-flox和cFLIP-KO小鼠的HE和油紅O染色圖。圖5是cFLIp-KO和cFLIP-flox小鼠肝臟脂質(zhì)含量測定結(jié)果圖，分別為肝臟甘油三酯、膽固醇以及游離脂肪酸含量測定結(jié)果(*：p＜0.05vscFLIP-floxNC組，#：p＜0.05vscFLIP-floxHFD)。具體實施方式通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實驗用動物及飼養(yǎng)：實驗動物種屬，性別，周齡及來源：cFLIP-flox和cFLIP肝臟特異性基因敲除(cFLIP-KO)小鼠，雄性，8周齡。CFLIP肝臟特異性基因敲除小鼠(cFLIP-KO)由cFLIP-flox小鼠與受蛋白啟動子控制、肝細胞特異性表達的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Albumin-Cre(購自TheJacksonLaboratory，貨號003574)雜交得到，構(gòu)建策略見圖1。肝臟特異性cFLIP基因敲除小鼠的構(gòu)建：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign(網(wǎng)址http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子2和4中各設(shè)計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為：cFLIP-sgRNA1：GGAACCTAGGGGTTTTTTCCGGGGGcFLIP-sgRNA2：ggAATCGAAAAGTTGATATAAGCCAGG此外還設(shè)計了一個用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(DonorVector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實驗。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGATloxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體(DonorVector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對應(yīng)酶切位點引物名稱引物序列酶切位點cFLIPLA-FCCGCTCGAGTTATAGCCCACACAGGCTGAXhoIcFLIPLA-RATGGACGTCGAAAAAACCCCTAGGTTCCCAatIIcFLIPM-FCCGGAATTCCGGGGGAGTCTCTGCTTTEcoRIcFLIPM-RGGCGATATCGCCAGGCCTGTCAATTTTACEcoRVcFLIPRA-FCGACGCGTTTATATCAACTTTTCGATTTGACMluIcFLIPRA-RATAAGAATGCGGCCGCTATCAACATGGCGTCAGGAANotI④打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分(負責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體(pST1374-Cas9)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。⑤cFLIP-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得cFLIP-floxed純合小鼠。⑥肝臟特異性cFLIP基因敲除小鼠的制作將上述cFLIP-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到cFLIPfloxed/floxed/Albumin-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到肝臟細胞特異性cFLIP基因敲除小鼠。實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：SPF級實驗動物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水?dāng)z食。【實施例1】小鼠脂肪肝(dietinducedobesity，DIO)獲得(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，cFLIP-flox小鼠和cFLIP-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即cFLIP-floxNC組，KONC組，cFLIP-floxHFD組，KOHFD組共4個組別。(2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：采用cFLIP-flox和KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關(guān)分析，明確cFLIP基因?qū)χ靖伟l(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，cFLIP-flox小鼠和cFLIP-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即cFLIP-floxNC組，KONC組，cFLIP-floxHFD組，KOHFD組共4個組別。小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測1次。第24周終末取材，取出小鼠肝臟稱重，一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(TissueFreezingMedium)包埋作為病理分析用。【實施例2】小鼠體重測定①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周、20周、24周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。體重變化結(jié)果如圖1所示，cFLIP-flox小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與cFLIP-KO小鼠24周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第8周開始HFD組的cFLIP-KO小鼠體重明顯高于HFD組的cFLIP-flox小鼠體重，一直持續(xù)到第24周(見圖2A)。表明cFLIP基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的體重。【實施例3】肝臟大體外觀測定及病理染色(1)終末肝臟組織取材1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。稱重完成后的肝臟組織一部分用于制備冰凍及石蠟切片，另一部分置于-80℃冰箱中保存以備測定肝臟脂質(zhì)含量。4)石蠟標(biāo)本：切取部分肝臟置于10％中性福爾馬林中固定。冰凍標(biāo)本：切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。2.肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實驗1)肝臟脫水，透明，浸蠟切取10％中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標(biāo)記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機器上設(shè)置以下程序，①脫水：75％酒精(45分鐘)→75％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→無水酒精(1小時)→無水酒精(1小時)；②透明：二甲苯(1小時)→二甲苯(1小時)；③浸臘(65℃)：石蠟(1小時)→石蠟(1小時)。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進機器籃筐內(nèi)，啟動上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時清洗機器備用。2)肝臟組織切片使用切片機切片(切片厚度5μm)。3)肝臟組織蘇木精-伊紅(HE)染色將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱(30分鐘)→二甲苯中(5分鐘×3次)→100％酒精(1分鐘)→90％酒精(1分鐘)→70％酒精(1分鐘)→蒸餾水洗→蘇木素(5分鐘)→自來水洗去切片上的浮色→1％鹽酸酒精(1至3秒)→自來水洗數(shù)下→Scott促藍液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL)(1分鐘)→自來水洗數(shù)下→伊紅(1分鐘)→蒸餾水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分鐘×3次)→在二甲苯未干時封片，拍照。4)肝臟組織油紅O染色①將冰凍肝臟組織切片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干30分鐘，4％多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。②以60％異丙醇處理1分鐘。③用油紅O(公司sigma，貨號O0625，濃度0.5克/100mL100％異丙醇)染色30分鐘。④之后以60％異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。⑤用Mayer’s蘇木素染液(5滴)淡染細胞核。⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍，充分水洗，水洗至細胞核藍化。⑦用甘油明膠封片，拍照。肝臟大體外觀結(jié)果見圖3所示，在HFD組的cFLIP-KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的cFLIP-flox小鼠高(如圖3A、B)。進一步通過組織切片，進行HE和油紅O染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，cFLIP-flox小鼠和cFLIP-KO小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到cFLIP-flox組小鼠的肝細胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細胞形態(tài)已幾乎完全破壞，而cFLIP-KO組小鼠的肝細胞形態(tài)變化更為嚴重(如圖4上)。通過肝臟油紅O染色來檢測肝組織中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的cFLIP-flox小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積，而在HFD組的cFLIP-KO小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著(如圖4下)。這些結(jié)果說明cFLIP基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。【實施例4】肝臟脂質(zhì)含量測定①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風(fēng)干，以去除水分。③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％TritonX-100的PBS溶液中，仔細吹吸混勻。④開啟電腦labman軟件，打印機，再開啟生化分析儀；⑤選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；⑥在labman軟件上檢查所需檢測指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測指標(biāo)和檢測順序等。⑦將制得的混勻液上機檢測，分析。肝臟脂質(zhì)含量測定結(jié)果如圖5A-C所示，經(jīng)過高脂飼料飼養(yǎng)24周后，cFLIPFLOXHFD組小鼠肝臟組織中甘油三酯、膽固醇以及游離脂肪酸含量明顯高于其NC對照組，而cFLIPKOHFD組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)成分含量則明顯高于cFLIPFLOXHFD組。說明cFLIP基因敲除顯著增加了高脂飼料飼養(yǎng)的小鼠肝臟組織中甘油三酯、膽固醇以及游離脂肪酸含量，cFLIP基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化，cFLIP基因?qū)τ谥靖渭膊【哂酗@著的抑制作用。上述結(jié)果顯示cFLIP-KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明cFLIP基因?qū)Ω纳浦靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明cFLIP基因在脂肪肝疾病模型中有著重要的保護作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>細胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣β白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白在治療脂肪肝中的應(yīng)用<130>1<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>cFLIP-sgRNA1<400>1ggaacctaggggttttttccggggg25<210>2<211>27<212>DNA<213>cFLIP-sgRNA2<400>2ggaatcgaaaagttgatataagccagg27<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctata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