本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，尤其涉及一種構(gòu)樹(shù)葉總酚酸新的提取方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera）為桑科構(gòu)樹(shù)屬植物，分布于我國(guó)黃河、長(zhǎng)江、珠江流域，在日本、越南、印度等國(guó)亦有分布，資源十分豐富。構(gòu)樹(shù)的成熟果實(shí)，稱(chēng)為“楮實(shí)子”，收載于歷版《中國(guó)藥典》，為常見(jiàn)中藥，具有補(bǔ)腎清肝、明目利尿的功效。構(gòu)樹(shù)葉又稱(chēng)為楮葉，性涼味甘，無(wú)毒，能清熱利濕，涼血止血，殺蟲(chóng)解毒，可用于治療吐血、衄血、血崩、外傷出血、水腫、疝氣、痢疾和癬瘡、更年期綜合癥、抗病毒和前列腺炎等疾病。
從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，人們開(kāi)始對(duì)構(gòu)樹(shù)的化學(xué)和藥理進(jìn)行研究。例如：從構(gòu)樹(shù)的整株植物中分離得到了多個(gè)黃酮類(lèi)化合物（Lee D，Bhat K，F(xiàn)ong H et al. Aromatase inhibitors from Broussonetia papyrifera [J].J. Nat. Prod，2001，64 (10): 1286-1293）；對(duì)構(gòu)樹(shù)葉的乙醇提取物（BPAE）與總黃酮苷（BPF）對(duì)家兔和豚鼠離體心房的作用進(jìn)行了研究（高允生，邱玉芳，高聆等. 構(gòu)樹(shù)葉醇提取物與黃酮苷對(duì)離體心房的抑制作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1988，4(2)：122-123），發(fā)現(xiàn)BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收縮的作用，且BPF的效價(jià)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于BPAE，證實(shí)了BPF是構(gòu)樹(shù)抑制心房收縮的主要有效成分，構(gòu)樹(shù)葉具有類(lèi)似鈣拮抗劑的作用。構(gòu)樹(shù)葉中除黃酮外，還含有其它含有酚羥基物質(zhì)，如木脂素等，這些物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為酚酸類(lèi)物質(zhì)（Ran Xiao-Ku, Wang Xiao-Tong,Liu Pei-Pei, Chi Yu-Xin, Wang Bo-Jia, Dou De-Qiang, Kang Ting-Guo, Xiong Wei.Cytotoxic constituents from the leaves of Broussonetia papyrifera.Chinese Journal of Natural Medicines 2013,11(3):269-273.）。在對(duì)構(gòu)樹(shù)葉的研究中，發(fā)現(xiàn)總酚酸具有較好的抗癌作用（CN102319291B一種構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用），未再見(jiàn)有其他的藥物應(yīng)用研究相關(guān)報(bào)道。
帕金森病（PD）是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性死亡為病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前治療手段主要以西藥為主，但西藥只改善癥狀，不能控制其進(jìn)程，長(zhǎng)期應(yīng)用療效減弱且毒副性增大，而中醫(yī)藥是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體整體狀況而起作用，藥性平和，毒副作用小。中藥在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，抗興奮性毒性等方面研究成果為長(zhǎng)期治療帕金森病，有效控制帕金森病進(jìn)程奠定了良好的基礎(chǔ)，近年來(lái)，中藥治療帕金森病已成為臨床主要治療手段之一。并且，如果患者單純服用中藥能有效控制早期帕金森病癥狀，既能避免西藥的毒副作用，又能大大增強(qiáng)患者服藥的依從性；因此，從中藥中發(fā)現(xiàn)抗帕金森的有效部位，并進(jìn)行新藥研發(fā)，顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物的新提取方法，并且該提取物用于制備抗帕金森病藥物中的新用途，該藥物針對(duì)性強(qiáng)，無(wú)毒副作用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物的新提取方法，具體包括以下步驟：取適量自然干燥的構(gòu)樹(shù)葉，粉碎成粉末；將構(gòu)樹(shù)葉粉末放入超臨界CO2萃取釜中，先用85%乙醇作為夾帶劑, 萃取時(shí)間為1.5 h，萃取壓力為40.0 MPa，萃取溫度為50℃，CO2流量為10 kg· h-1 ，分離壓力為5.8 MPa，分離溫度為40℃；提取后所得的乙醇液，經(jīng)減壓濃縮，減壓干燥，得構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物。
所述的構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物中，總酚酸含量大于50%，葉總酚酸提取物中大波斯菊苷含量3-7%，3, 5, 4′-三羥基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷(3, 5, 4′-trihydroxy-bibenzyl-3-O-β-D-glucopyranside)為1-3%。
所述的構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物用于制備抗帕金森藥物。
本發(fā)明的有益效果。
本發(fā)明采用超臨界流體從構(gòu)樹(shù)葉中獲得較高含量的總酚酸，構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物的總酚酸含量測(cè)定采用下述文獻(xiàn)報(bào)道的比色法對(duì)總酚酸的含量進(jìn)行測(cè)定：石玉媛，何凡，李瑩瑩，竇德強(qiáng)，康廷國(guó)，董鋒.不同產(chǎn)地亞貢葉中總酚酸的含量測(cè)定.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（7）：1475-1477。我們?cè)趯?duì)抗帕金森病中藥有效成分篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹(shù)葉總酚酸具有良好的抗帕金森病的作用，經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)和血清藥理學(xué)評(píng)價(jià)均發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹(shù)葉總酚酸具有較好的抗帕金森作用。本發(fā)明提取方法獲得的的構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物，方法簡(jiǎn)便，成本低，純度高，為其開(kāi)發(fā)成為抗帕金森病的藥物奠定了基礎(chǔ)。
附圖說(shuō)明
圖1構(gòu)樹(shù)葉樣品高效液相色譜法測(cè)定色譜圖；其中I為大波斯菊苷，II為3, 5, 4′-三羥基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1。
制備構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物：構(gòu)樹(shù)葉（包括葉柄），自然干燥后粉碎成20目的粉末；稱(chēng)取構(gòu)樹(shù)葉粉末200克，放入超臨界CO2萃取釜中（儀器型號(hào)：HSCE-50-1，大連卓爾高科技有限公司生產(chǎn)）；按照如下條件進(jìn)行提取：85%乙醇（乙醇和水的體積比）為夾帶劑, 萃取時(shí)間為1.5 h，萃取壓力為50.0 MPa，萃取溫度為50℃；CO2 流量為10 kg? h-1，分離壓力為5.8 MPa，分離溫度為40℃；提取后所得的乙醇液，經(jīng)減壓濃縮得浸膏，進(jìn)一步經(jīng)減壓干燥，得構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物。
總酚酸提取物重量為16.2g，測(cè)得總酚酸為8.93g，占所述干燥后的總酚酸提取物的重量百分比為55.1%，占構(gòu)樹(shù)葉原料藥材總重的百分比為4.5%；總酚酸提取物中，大波斯菊苷含量為5.21%，3, 5, 4′-三羥基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷含量為1.78%。
1. 總酚酸的測(cè)定方法，具體操作過(guò)程如下。
精密稱(chēng)取10mg的總酚酸提取物于10毫升容量瓶中，加甲醇超聲溶解、定容，制備供試品溶液。精密量取供試品溶液1ml，于25ml量瓶中，加甲醇5ml，加0.3%十二烷基硫酸鈉2ml后，然后加0.6% FeCl3.6H2O：0.9%K3[Fe(CN)6]為1：1（體積比)的混合溶液2ml，在暗處放置5min，加0.1mol/l HCl溶液至刻度，在暗處放置20min，以顯色劑為空白，以綠原酸為對(duì)品，在746nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=145.2X+0.0303(r=0.9997，線性范圍0.002 -0.005 mg/mL。其中Y為吸光度,X為對(duì)照品溶液濃度(mg/mL ))，進(jìn)行定量分析。
2.大波斯菊苷和3, 5, 4′-三羥基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜條件如下：儀器為Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）, 色譜柱：Kromasil C18 100A (5μm, 250×4.6mm)；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%磷酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0分鐘為35%A，25分鐘為45%A，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；運(yùn)行時(shí)間25min，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。
供試品溶液制備：精密稱(chēng)取10mg的總酚酸提取物于10毫升容量瓶中，加甲醇超聲溶解、定容，制備供試品溶液。進(jìn)樣前用0.45μm濾膜過(guò)濾，備用。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取大波斯菊苷和3, 5, 4′-三羥基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷樣品（自制，純度大于98%）5mg,甲醇定容于20ml容量瓶中。
3.構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物抗帕金森作用研究。
3.1.實(shí)驗(yàn)材料。
C57BL/6小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所用構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物為采用上述方法制備。
3.2.動(dòng)物分組。
將50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、陽(yáng)性藥組（多巴絲肼片（美多芭），上海羅氏制藥有限公司）和總酚酸高、低劑量組，每組10只。
3.3.造模及給藥方法。
模型組、陽(yáng)性藥組、構(gòu)樹(shù)葉總酚酸高和低劑量組皮下注射MPTP （購(gòu)于Sigma公司，批號(hào)：1001054803） 25 mg/kg，每天一次，連續(xù)4天。空白組以腹腔注射等量生理鹽水代替MPTP，每天一次，連續(xù)4天。第5天開(kāi)始，繼續(xù)皮下注射MPTP，同時(shí)構(gòu)樹(shù)葉總酚酸高、低劑量組分別給藥150mg/kg、75mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)給藥9天。陽(yáng)性藥組每天給予50mg/kg的多巴絲肼片,空白組和模型組每天給予等量的生理鹽水。每天對(duì)小鼠進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)考查。
3.4.行為學(xué)考查。
3.4.1懸掛實(shí)驗(yàn)。
目的是檢測(cè)C57BL/6小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況。給予構(gòu)樹(shù)葉總酚酸后的第7、8和9天，將受試小鼠懸掛于一水平電線上，電線直徑約為0.2mm。從小鼠雙前爪抓住電線開(kāi)始計(jì)時(shí)，小鼠掉落則計(jì)時(shí)結(jié)束。25秒以上的記6分；20-25秒記5分；15-20秒記4分；10-15秒記3分；5-10s記2分；0-5s記1分。最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分值越高，小鼠抓住電線越牢固；說(shuō)明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況越好，反之，則說(shuō)明小鼠震顫、肌強(qiáng)直等情況嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 懸掛實(shí)驗(yàn)得分結(jié)果（±s）。
注：△與空白組比較，有差異（p<0.05）；△△與空白組比較，差異顯著（p<0.01）；▲與模型組比較，有差異（p<0.05），▲▲與模型組比較，有顯著差異（p<0.01）。
3.4.2 爬桿實(shí)驗(yàn)。
目的是檢測(cè)C57BL/6小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況。于給予構(gòu)樹(shù)葉總酚酸的第7、8和9天，將直徑為2.5 cm的軟木球固定于一根長(zhǎng)50 cm，直徑1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測(cè)小鼠放到小球上，并記錄小鼠爬完桿子所需要的時(shí)間。然后按以下標(biāo)準(zhǔn)記分：0-3 秒內(nèi)完成上述動(dòng)作的記6分；3-6 秒內(nèi)完成的記5分；6-9秒內(nèi)完成的記4分；9-12秒內(nèi)完成的記3分；12-15秒內(nèi)完成的記2分；15秒以上的記1分。最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分值越高，小鼠爬完桿子的全程所用的時(shí)間越少，說(shuō)明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況越好，也說(shuō)明小鼠對(duì)爬桿實(shí)驗(yàn)越來(lái)越熟練，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 爬桿實(shí)驗(yàn)得分結(jié)果 （±s）。
注：△與空白組比較，有差異（p<0.05）；△△與空白組比較，差異顯著（p<0.01）；▲與模型組比較，有差異（p<0.05），▲▲與模型組比較，有顯著差異（p<0.01）。
3.4.3游泳實(shí)驗(yàn)。
目的是檢測(cè)C57BL/6小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況。于給予構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物的第7、8和9天，將受試小鼠放入一個(gè)20 cm × 30cm × 20 cm 規(guī)格的水箱中，水溫為22℃-25℃。記錄1min內(nèi)小鼠漂浮的時(shí)間。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：在1min內(nèi)，漂浮時(shí)間在10s內(nèi)的記6分；20s內(nèi)的記5分；30s內(nèi)的記4分；40s內(nèi)的記3分；50s內(nèi)的記2分；超出50s 的記1分。最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分值越高，小鼠游泳的時(shí)間越多；說(shuō)明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況越好，反之，則說(shuō)明小鼠震顫、肌強(qiáng)直等情況嚴(yán)重，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 游泳實(shí)驗(yàn)得分結(jié)果 （±s）。
注：△與空白組比較，有差異（p<0.05）；△△與空白組比較，差異顯著（p<0.01）；▲與模型組比較，有差異（p<0.05）；▲▲與模型組比較，有顯著差異（p<0.01）。
行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)樹(shù)葉提取物可明顯增強(qiáng)小鼠的懸掛指數(shù)、爬桿指數(shù)和游泳指數(shù)，具有顯著改善MPTP模型C57BL/6小鼠行為學(xué)的作用。
4.構(gòu)樹(shù)葉總酚酸抗帕金森病的血清藥理學(xué)研究。
4.1. 實(shí)驗(yàn)材料。
方法采用SD大鼠，雌雄各半，體重200 ± 20g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)。所用構(gòu)樹(shù)葉總酚酸為采用上述工藝自制。稱(chēng)取構(gòu)樹(shù)葉總酚酸提取物適量，配制成5 mg/mL的水溶液，待用。
4.2. 實(shí)驗(yàn)方法。
4.2.1 藥物血清的制備。
大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分為空白組和構(gòu)樹(shù)葉總酚酸高、低劑量組。高、低劑量組分別給藥150mg/kg、75mg/kg，每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥7天；空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)給7天。于末次給藥后0.5 h后麻醉，摘眼球取血，靜置0.5 h后，3000 rpm/min離心10 min，分離血清，然后56℃滅活30min以除去可能存在的生物活性物質(zhì)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，密封后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
4.2.2細(xì)胞分組與處理。
人母神經(jīng)細(xì)胞瘤系細(xì)胞（SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。用含10％滅活胎牛血清、青霉素100U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1的 DMEM F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至單層細(xì)胞約80%匯合時(shí)，傳代培養(yǎng)，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16 h待細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白血清組、模型組、實(shí)驗(yàn)高低劑量組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組分別加入含體積分?jǐn)?shù)5%、10%和20%的2.1項(xiàng)下高、低劑量組的完全培養(yǎng)基，空白血清組只加相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的2.1項(xiàng)下空白小組血清培養(yǎng)基；模型組給予響應(yīng)體積的2.1項(xiàng)下模型組血清的培養(yǎng)基。于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組和模型組同時(shí)加入1mM的MPP+（購(gòu)于sigma公司，批號(hào)：72111），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。模型組和構(gòu)樹(shù)葉總酚酸高、低劑量組，細(xì)胞每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加DMSO 100 μL，待結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè) 492 nm處各孔的吸收值（OD值）（參考波長(zhǎng)620 nm），計(jì)算細(xì)胞存活率。
細(xì)胞存活率％=實(shí)驗(yàn)組OD值／空白組OD值×100％。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
4.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
與空白血清組相比，模型組細(xì)胞存活率分別為（42.24% ± 1.71%）、（42.53% ± 1.09%）和（37.01% ± 0.97%）；預(yù)先加入高、低劑量的構(gòu)樹(shù)葉總酚酸含藥血清組的存活率顯著增加，與模型組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，一定體積分?jǐn)?shù)的構(gòu)樹(shù)葉總酚酸組含藥血清對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。
表4 不同體積分?jǐn)?shù)的含藥血清對(duì)抗MPP+細(xì)胞毒性后的SH-SY5Y細(xì)胞存活率(±s)。
注：*與模型組比較，有差異（p<0.05）；**與模型組比較，有顯著差異（p<0.01），***與模型組比較，有極顯著差異（p<0.001）。
上述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對(duì)本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動(dòng)，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。