本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及從蘿卜纓中制備具有抗氧化和延緩衰老活性的乙酸乙酯萃取部位及其在制備抗氧化和延緩衰老藥物方面的應用。

背景技術：

我國是世界上老齡化發展速度最快的國家之一，也是老齡人口最多的國家之一。據世衛組織預測，到2050年，我國老齡人口將超過4億，給社會帶來沉重的負擔。延緩衰老是推動健康老齡化的有效對策，也是提高老年人群生活質量的有效措施，延緩衰老已成為全球普遍關注的重大課題。

衰老生物體發育成熟后，在正常生理情況下隨著年齡的增長，生物體自我更新和修復能力減弱、內環境穩定性下降、結構成分逐漸發生退行性變化而趨向死亡的不可逆變化過程。迄今，關于衰老的理論學說已有數十種。包括端粒學說、自由基學說、自身免疫學說、DNA損傷學說、線粒體學說等。其中Harman提出的自由基學說得到國際公認。該學說認為，機體衰老是由于機體代謝活動過程中產生過多的自由基，攻擊機體大分子物質，造成細胞水平及機體水平氧化損傷，從而加速細胞及機體衰老的進程。基于自由基學說，從天然植物中篩選安全、有效的抗氧化活性成分用于延緩衰老研究，一直備受關注。

蘿卜纓是十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus L.)的根生葉，又稱萊菔葉。萊菔，是我國一種重要的蔬菜，全國各地均有種植，可四季栽培，全年供應，產銷量很大。蘿卜纓作為蘿卜的副產品，資源也十分豐富。萊菔葉的營養成分豐富，美國公眾科學中心的一項科學研究，即按照熱量、葉黃素、維生素C、維生素K、鉀和纖維素等的含量指標給85種蔬菜打分，結果顯示萊菔葉位列第三名。同時，蘿卜纓還具有很高的營養價值和藥用價值。現代營養學研究表明，蘿卜纓具有促進胃腸蠕動、治療胃潰瘍、抗氧化及降血壓等多種生物活性。Ghayur和Gilani報道蘿卜纓水提物具有降壓作用，該水提物中含有皂苷和生物堿類物質(Ghayur MN,Gilani AH.J Health Sci,2007,53:151-155.)。Devaraj等報道蘿卜纓提取物對實驗性大鼠胃潰瘍具有保護作用，且最大口服安全劑量可達2000mg/kg，其中乙醇粗提物、氯仿相、乙酸乙酯相和水相均具有抗乙酸誘導大鼠慢性胃潰瘍作用，并定性乙酸乙酯相含有皂苷和黃酮(Devaraj VC,Gopala Krishna B,et al.Saudi Pharm J,2011,19:171-176)。Gilani報道蘿卜纓提取物能通過多途徑刺激胃腸蠕動和子宮收縮，24h內一次口服萊菔葉粗提物5000mg/kg無急性毒性(Gilani AH,Nabeel GM.J Ethnopharmacol,2004,95:169-172)。Beevi報道蘿卜纓甲醇和丙酮提取物具有清除自由基和抗氧化作用，并初步證實其富含多酚類物質(Beevi SS,Narasu ML,Gowda BB.Plant Foods Hum Nutr,2010,65:8-17)。但到目前為止，將蘿卜纓用于延緩衰老領域的研究和應用，在國內外均未見相關報道。本發明可進一步擴大蘿卜纓的開發和利用，同時也為延緩衰老研究提供新資源，可產生良好的社會效益和可觀的經濟效益。

技術實現要素：

本發明的目的是提供蘿卜纓具有抗氧化和延緩衰老活性應用潛力的有效部位。

蘿卜纓提取物的各部位經過反復多次的抗氧化和延緩衰老活性篩選，確認蘿卜纓70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位可明顯延長果蠅的壽命，提高果蠅體超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性，降低脂質過氧化產物(MDA)含量，并且在清除DPPH自由基、還原能力測定實驗中表現出較好的體外抗氧化活性，表明蘿卜纓的提取物具有良好的抗氧化作用，具有延緩衰老的潛力。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種蘿卜纓的活性部位，具有抗氧化和延緩衰老性能，為蘿卜纓70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位，按照如下方法獲得：

步驟1、干燥蘿卜纓，粉碎過200目篩；

步驟2、將過篩的蘿卜纓加入到體積分數為70％～95％的乙醇的水溶液中恒溫浸提；經抽濾后，對濾渣重復提取三次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，得蘿卜纓乙醇提取物；

步驟3、將蘿卜纓乙醇提取物用水超聲分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇分級萃取，各萃取3次，將相同的萃取液合并；減壓濃縮合并后的溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水飽和正丁醇部位和水部位，其中乙酸乙酯部位即為所述蘿卜纓的活性部位。

步驟2中，所述蘿卜纓與乙醇水溶液的用量比為1g：10～20mL；所述恒溫浸提的溫度為35～45℃。

步驟3中，所使用的水與石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽或正丁醇的體積比均為1：0.5～1.5。

所述的蘿卜纓的活性部位用于延長果蠅壽命。本發明采用果蠅這一模式生物，以整體動物實驗作為檢測手段，觀察上述蘿卜纓活性部位對果蠅壽命的影響，發現高低劑量的上述蘿卜纓活性部位能顯著延長果蠅的壽命。同時在體外模型中具有顯著的抗氧化活性，表明蘿卜纓活性部位在制備抗氧化和延緩衰老藥物方面具有良好的潛力。

所述的蘿卜纓的活性部位用于制備抗氧化和延緩衰老藥物。

所述抗氧化和延緩衰老藥物為滴丸、膠囊、片劑或顆粒劑的形式，上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。

所述的蘿卜纓的活性部位用于與藥學上可接受的輔料組成的藥物組合物。

有益效果：

與現有技術相比，本發明提供了一種具有抗氧化和延緩衰老活性的蘿卜纓乙醇提取物活性部位。

經檢測確認蘿卜纓70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位可明顯延長果蠅的壽命，提高果蠅體超氧化物歧化酶(內SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性，降低脂質過氧化產物(MDA)含量，并且在清除DPPH自由基、還原能力測定實驗中表現出較好的體外抗氧化活性，表明蘿卜纓乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位蘿卜纓的提取物具有良好的抗氧化作用，具有延緩衰老的潛力。

附圖說明

圖1為乙酸乙酯萃取部位對雌性果蠅壽命的影響；

圖2為乙酸乙酯萃取部位清除DPPH自由基實驗；

圖3為乙酸乙酯萃取部位還原能力實驗。

具體實施方式

下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1

蘿卜纓95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位制備：

取粉碎過200目篩的蘿卜纓粉100g，加入2000mL體積分數為95％的乙醇水溶液于水浴45℃下浸提，經抽濾，濾渣重復提取三次，合并濾液，真空濃縮回收乙醇，得蘿卜纓乙醇提取物；蘿卜纓乙醇提取物用100mL水超聲分散，依次用50mL石油醚、50mL氯仿、50mL乙酸乙酯、50mL水飽和正丁醇分級萃取，各萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水飽和正丁醇部位和水部位；其中乙酸乙酯部位即為蘿卜纓乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。

實施例2

蘿卜纓70％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位制備：

取粉碎過200目篩的蘿卜纓粉100g，加入1000mL體積分數為70％的乙醇水溶液于水浴35℃下浸提，經抽濾，濾渣重復提取三次，合并濾液，真空濃縮回收乙醇，得蘿卜纓乙醇提取物；蘿卜纓乙醇提取物用100mL水超聲分散，依次用50mL石油醚、50mL氯仿、50mL乙酸乙酯、50mL水飽和正丁醇分級萃取，各萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水飽和正丁醇部位和水部位；其中乙酸乙酯部位即為蘿卜纓乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。

實施例3

乙酸乙酯萃取部位延緩果蠅壽命的作用

1.實驗材料

野生型黑腹果蠅由南京農業大學遺傳學研究室提供；

2.劑量選擇

設一個空白對照組合二個劑量組，各劑量組培養基含受試物濃度為0、5mg/kg和15mg/kg。

3.果蠅基礎培養基

玉米粉8.5％、蔗糖6.5％、瓊脂分0.75％、丙酸0.5％、酵母粉0.75％、水83％，pH＝7。

4.果蠅壽命實驗

挑選10h內孵出的未發生交配的雌性果蠅，經乙醚麻醉，隨機分為空白對照組、樣品高劑量組、樣品低劑量組，每管20只，每組10管，在溫度25±1℃、濕度55～65％、12h光照交替的培養箱中培養。每根管放約2mL的培養基，用雙層紗布封口。前兩周均飼喂基礎培養基，15天后各樣品處理組開始喂飼加樣品的培養基。每天上午定時觀察并記錄死亡的果蠅數目，4天更換一次培養基，觀察果蠅至完全死亡為止。實驗過程中剔除非正常原因死亡和操作過程中不慎飛走的果蠅數量。統計各組果蠅的平均壽命和最高壽命。平均壽命的計算用每組全部果蠅生存天數之和除以果蠅數目；最高壽命取每組最后死亡的10只果蠅生存天數的平均值。結果見圖1、表1。

表1乙酸乙酯萃取部位對雌性果蠅壽命的影響

5.果蠅體內SOD、CAT和MDA的測定

挑選10h內孵出的未發生交配的雌性果蠅，經乙醚麻醉，隨機分為空白對照組、樣品高劑量組、樣品低劑量組，每管20只，每組10管，在溫度25±1℃、濕度55～65％、12h光照交替的培養箱中培養。在喂飼被測樣品的第45天經乙醚麻醉處理，稱重后，用9倍的生理鹽水制備10％的組織勻漿，混勻后，6000rpm/min離心10min，吸取上清液，參照試劑盒方法進行SOD、CAT活力和MDA含量的測定。結果見表2。

表2乙酸乙酯萃取部位對雌性果蠅體內SOD、CAT活力和MDA含量的影響

實施例4

乙酸乙酯萃取部位體外抗氧化活性測定：

1.DPPH自由基清除實驗

稱取3mg的乙酸乙酯萃取部位樣品溶解在3mL甲醇中配制得到1000μg/mL的母液，用甲醇梯度稀釋母液，得到50—1000μg/mL的一系列濃度的樣品溶液。往試管中加入2mL的0.2mmol/L DPPH溶液和1mL的不同濃度樣品溶液或1mL的甲醇溶液做空白對照，并充分混勻，暗處放置30min后在517nm處測定吸光度(A)，重復測三次，然后取平均值。DPPH自由基清除率的計算方法如下：

其中，A_空白為空白對照樣的吸光度，A_樣品為樣品的吸光度。

數據表明，乙酸乙酯萃取部位具有清除DPPH自由基能力。結果見圖2。

2.還原能力實驗

取1mL不同濃度的樣品提取物溶液，加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(0.2M，pH 6.6)和2.5mL的1％鐵氰化鉀溶液，在50℃水浴20min，然后加2.5mL 10％的三氯乙酸(TCA)終止反應，3000rpm離心10min，吸取2.5mL上清液，相繼加2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1％的FeCl₃，充分混勻，室溫下靜置反應10min，測定在700nm處的吸光值，測定3次取平均值。數據表明，乙酸乙酯萃取部位具有較強的還原能力。結果見圖3。

實施例5

滴丸的制備

分別稱取400g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，再加入乙酸乙酯萃取部位凍干粉末，攪拌均勻，傾入保溫管中，調節恒溫裝置，使藥液在80一90℃下滴入冷卻過的液體石蠟中(溫度±4℃)，滴完后，將藥丸傾入濾紙上吸干石蠟油，再加入少量滑石粉，混勻，得乙酸乙酯萃取部位滴丸1000粒。

實施例6

膠囊劑的制備

乙酸乙酯萃取部位凍干粉末100g，與藥用淀粉50g，混合均勻，烘干，按每粒0.45g制成膠囊。

實施例7

片劑的制備

乙酸乙酯萃取部位凍干粉末100g，淀粉50g，混合均勻，用乙醇制粒，經整粒機整粒，壓片，每片0.35g。

實施例8

顆粒劑的制備

乙酸乙酯萃取部位凍干粉末150g，淀粉100g，糖粉40g，混合均勻，用乙醇制粒，干燥、整粒、分裝即得。