本發明屬于疫苗制備領域，具體涉及一種一種顯著提高免疫能力的肺癌干細胞疫苗的制備方法。
背景技術：
：腫瘤疫苗即是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，以調節機體免疫功能，達到治療腫瘤的目的。治療性腫瘤疫苗可通過主動免疫誘導全身特異性抗腫瘤效應。根據其制備方法不同，疫苗主要分為：細胞疫苗、多肽疫苗和蛋白質疫苗、核酸疫苗、抗獨特型抗體疫苗等。腫瘤干細胞疫苗是最近興起的研究方法，在肝癌、卵巢癌等方面已獲得了相應的研究進展。由于腫瘤干細胞的免疫原性非常的弱，開展腫瘤干細胞疫苗的主要任務之一便是提高其免疫原性。不過，對于不同的腫瘤干細胞而言，提高免疫原性所依賴的原理和方法尚未形成共識，許多研究之間還存在矛盾之處。一般而言，聚酐對于免疫原性的穩定性具有著很好的效果，可增強免疫應答。不過在本發明的前期研究中，發明人發現其并不能發揮此效果。同樣，甘露聚糖或者甘露聚糖肽雖也是常用的抗腫瘤佐劑（如“Oligomannose-coatedliposomesasatherapeuticantigen-deliveryandanadjuvantvehicleforinductionofinvivotumorimmunit”），其同樣難以制備成肺癌疫苗。因此，本領域亟需一種適用于肺癌干細胞疫苗的制備方法。技術實現要素：針對現有技術的缺點，本發明的目的之一在于提供一種顯著提高免疫能力的肺癌干細胞疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟：（1）將復蘇后的肺癌干細胞于DMEM全培養基中培養，DMEM全培養基中含8%的FBS，培養溫度為37℃，濕度為85%，CO2的濃度為0.5%，培養3-4天，之后對所培養的細胞進行1:3的分盤，再用同樣的培養基在同樣的培養條件下培養3天，細胞呈現紡錘體或近似紡錘體；（2）對步驟（1）所得物利用60Co進行輻照處理，劑量為3-4Gy；（3）選取CD133陽性干細胞，培養后進行滅活處理，利用生理鹽水重懸干細胞，使得細胞濃度為1×105-1×106個/ml；（4）按照體積比4:1.5:2的比例，將步驟（3）所得物、殼聚糖生理鹽水溶液和昆布多糖生理鹽水溶液混合，混合后，殼聚糖濃度為2%，昆布多糖的濃度為2.5%。利用60Co進行輻照，能夠使得陽性干細胞的比例大幅增加，利于疫苗的制備。一般而言，利用輻照會產生一些難以預料的后果，但是采用低劑量（3-4Gy）的60Co輻照時，并沒有發現其它不理的后果，而是大幅增加了陽性干細胞的比例。初步的研究發現，在本發明的輻照劑量下，CD133陽性干細胞的比例可達到70-90%左右，而不進行輻照，所得的CD133陽性干細胞僅為40%左右。不過，輻照劑量與CD133干細胞比例之間并非呈線性關系，更為重要的是，即使采用同樣的輻照劑量進行多次實驗，不同實驗之間所得CD133陽性干細胞比例在30-50%范圍內呈具有統計學差異的無規律隨機分布。關于該現象的機理，還需要進行深入的研究。另外，本發明還發現利用甘露聚糖作為佐劑無法實現滿意的疫苗功能，可能是甘露聚糖并不能增強免疫應答。本發明能夠獲得較好的效果的原因可能在于對肺癌干細胞的處理過程增加了其免疫原性，可能是輻照、培養方式、佐劑的選擇或者其結合使然。這方面需要后續進行相關單因素和條件篩選實驗來驗證。不過，可以肯定的是，在所有條件不變的情況下，將佐劑替換為在腫瘤干細胞疫苗中常用的甘露聚糖或者甘露聚糖肽確實不能獲得滿意的效果。步驟（2）中，輻照劑量為3Gy。雖然該劑量并不能進一步穩定的增加CD133陽性干細胞的比例，但出于保守考慮，取本發明所發現的輻照劑量的最低值，可能是一種合理的選擇。步驟（3）中，細胞濃度為5×105個/ml。步驟（3）中，所述的滅活為：對干細胞進行多次凍融處理。本發明的另一個目的在于提供上述方法制備得到的疫苗。本發明的另一個目的在于提供所述疫苗在制備治療肺癌藥物方面的用途。本發明的有益效果：本發明所得疫苗對于肺癌具有顯著的療效，可顯著的增強免疫能力，并控制腫瘤的生長。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述
發明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例（1）將復蘇后的肺癌干細胞于DMEM全培養基中培養，DMEM全培養基中含8%的FBS，培養溫度為37℃，濕度為85%，CO2的濃度為0.5%，培養3-4天，之后對所培養的細胞進行1:3的分盤，再用同樣的培養基在同樣的培養條件下培養3天，細胞呈現紡錘體或近似紡錘體；（2）對步驟（1）所得物利用60Co進行輻照處理，劑量為3Gy；（3）選取CD133陽性干細胞，培養后進行多次凍融處理，將其滅活，然后利用生理鹽水重懸干細胞，使得細胞濃度為5×105個/ml；（4）按照體積比4:1.5:2的比例，將步驟（3）所得物、殼聚糖生理鹽水溶液和昆布多糖生理鹽水溶液混合，混合后，殼聚糖濃度為2%，昆布多糖的濃度為2.5%。對比實施例除佐劑為甘露聚糖肽和脂肪乳之外，其余與實施例一致。實驗例對植入肺癌腫瘤的10只昆明鼠注射實施例所得疫苗作為實驗組1，另取10只昆明鼠注射對比實施例所得物作為實驗組2，另取10只昆明鼠注射生理鹽水作為對照組。實驗組和對照組的注射量均為200ul,15天后進行外周淋巴細胞數目、淋巴細胞功能和腫瘤體積檢測。結果如表1、表2和表3所示。表1注：*P＜0.01表2實驗組1實驗組2對照組IFN-γ（pg/ml）1.69±0.110.81±0.130.74±0.20TNF（pg/ml）1.57±0.260.76±0.150.69±0.12IL-4（pg/ml）2.95±0.112.01±0.151.88±0.24注：*P＜0.01表3實驗組1實驗組2對照組腫瘤體積變化（%）-30±2+15±3+80±5注：“+”表示腫瘤體積增加，“-”表示腫瘤體積減少，*P＜0.01。當前第1頁1 2 3