本發明涉及生物醫用材料領域，具體是指一種自組裝蛋白質多層膜制備方法。
背景技術：
層層自組裝技術是一種有效制備薄膜的方法，可適用于多種材料的組裝，操作簡單，易于控制。其中聚電解質層層自組裝技術是通過將基底在陰陽離子聚電解質溶液中交替浸泡，從而在基底表面制備聚電解質薄膜。自組裝過程的結合力主要包括共價鍵，配位鍵 ，電荷轉移，氫鍵和靜電引力等形式的作用力。層層自組裝技術可以實現在玻璃，鈦合金，陶瓷,石英，單晶硅片，云母，金，銀，氧化鋁以及聚合物等底上的組裝，并且基底形狀不受限制。
隨著組織工程的發展 ,組裝工程材料表面的生物相容性的改善已成為生物醫用材料研究的一個關鍵問題 。而層層自組裝由于具有溫和的組裝條件,對生物分子和基材的廣泛適應性及其能在納米和亞微米尺度設計的可調性等優點 ,已經越來越多地被應用于組織工程材料的表面改性中。目前，層層自組裝技術得到了很大發展，制備自組裝膜的聚合物也從聚電解質擴展到蛋白質，DNA，染料分子，納米顆粒，膠束等等。通過層層自組裝技術把蛋白質直接固定在材料表面,使材料的細胞相容性明顯提高, 這類研究已成為生物材料研究中的熱點 。
采用人為的方式形成材料-蛋白質復合層,改善細胞在材料表面的吸附及生長性能, 是一種簡單有效的方法。靜電引力作用的自組裝物質需帶電荷，限制了蛋白膜自組裝過程對材料的選擇。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種自組裝蛋白質多層膜制備方法,本發明利用植物多酚和蛋白質分子間的氫鍵作用，采用層層自組裝的方法，制備多種具有生物活性的多層蛋白膜。
為實現上述目的，本發明的技術方案是包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將基材進行表面處理后，浸入到濃度為0.01～100mg/mL的陽離子聚電解質溶液中自組裝形成底層；
（2）植物多酚水溶液的配制
在緩沖溶液中，調節pH值1-14，依次加入氯化鈉，抗壞血酸和植物多酚，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01～100mg/mL的植物多酚水溶液；
（3）蛋白質水溶液的配制
在緩沖溶液中，調節pH值1-14，依次加入氯化鈉，抗壞血酸和蛋白質，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01～100mg/mL的蛋白質水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的植物多酚的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經過步驟（3）制備的蛋白質水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質，利用植物多酚與蛋白質通過氫鍵作用進行層層自組裝；
（5）多次循環操作步驟（4），得到自組裝蛋白質多層膜。。
進一步設置是陽離子聚電解質為聚乙烯亞胺(PEI)或聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH)。
進一步設置是所述的蛋白質為胰蛋白酶，所述緩沖溶液為1~100mM Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液或1~100mM醋酸-醋酸鈉緩沖液或1~100mMHEPES緩沖溶液的一種。
進一步設置是基材為陶瓷、鎳合金、鎂合金、鈦合金、不銹鋼、石英片、玻璃片、金、銀、氧化鋁中的任一種。
進一步設置是植物多酚為單寧酸、咖啡酸、雞納酸、茶多酚、兒茶素，葡萄籽多酚、仙鶴素、地榆素、玫瑰素、老鸛草素、云實素、柯子酸，月見草素、蝦子花素、石榴素或山茱萸素中的任一種。
進一步設置是蛋白質為明膠、膠原蛋白、血紅蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白、絲素蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、菠蘿酶、木瓜蛋白酶、氨基肽酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、霉菌蛋白酶、細菌蛋白酶、植物蛋白酶、彈性蛋白酶、酸性堿性中性蛋白酶、膠原酶、組織蛋白酶、鏈霉蛋白酶、熱溶素、激肽釋放酶、無花果蛋白酶、內肽酶、外肽酶、腸激酶、半胱氨酸蛋白酶、鈣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、透明質酸酶、幾丁質酶、淀粉酶、脂肪酶、過氧化氫酶或酪氨酸激酶中一種或多種組合。
進一步設置是所述的還原劑為抗壞血酸，濃度為1~100mM。
進一步設置是所述的氯化鈉濃度為0~1mol/L。
本發明采用植物多酚和蛋白質的分子間強氫鍵作用作為沉積過程的推動力。該自組裝膜的主體部分沒有使用聚陽離子，可以有效減少傳統自組裝膜中多層聚陽離子對細胞所產生的傷害。該多層膜主要由植物多酚和蛋白質構成，生物相容性好，可以顯著促進人體細胞的黏附、生長與增殖。將該自組裝多層膜裝飾在人體植入材料表面，能顯著提高植入材料的生物相容性，應用前景十分廣闊。
本發明的創新機理是：
因為氫鍵層層自組裝沒有電荷的限制，所以可以通過氫鍵作用對多種蛋白質進行組裝，極大豐富了蛋白質膜的種類。植物多酚分子中具有大量酚羥基和多種蛋白質分子中的酰胺鍵 可以形成穩定的氫鍵作用。自組裝多層膜中蛋白質提供細胞識別位點，可以顯著地促進細胞的粘附和生長。在生理環境條件下 ,該層層組裝的蛋白質多層膜具有良好的穩定性和生物相容性，且方法簡單易行，條件溫和，符合環保要求。本發明的蛋白膜可用于植入材料和器件的生物界面構建，提高醫用植入體的生物活性。
下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發明做進一步介紹。
附圖說明
圖1 本發明實施例1（單寧酸和溶菌酶）的QCM測試圖。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。
實施例1
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為0.01mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的HEPES緩沖液10ml，pH=8，依次加入抗壞血酸至1mM和單寧酸（TA）至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度0.01mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）蛋白質水溶液的配制
配置10mM的HEPES緩沖液10ml，調節pH至8，，依次加入1mM至抗壞血酸和溶菌酶至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經過步驟（3）制備的蛋白質水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環4次，得到自組裝蛋白質多層膜。
如圖1可知，單寧酸和溶菌酶可以進行連續組裝，形成蛋白質多層膜。
實施例2
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為1mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的HEPES緩沖液，pH=8，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mM和單寧酸（TA）至1mg/mL，攪拌至完全溶解，配置成濃度1mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）蛋白質水溶液的配制
配置50mM的HEPES緩沖液，pH=8，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mM和溶菌酶至1mg/mL，攪拌至完全溶解，配置成濃度為1mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的單寧酸，再浸入到經過步驟（3）制備的蛋白質水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環4次，得到自組裝蛋白質多層膜。
實施例3
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為100mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）單寧酸水溶液的配制
配置100mM的HEPES緩沖液，pH=8，依次加入氯化鈉至1mol/l，抗壞血酸至100mM和單寧酸（TA）至100mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度100mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置100mM的HEPES緩沖液，pH=8，依次加入氯化鈉至1mol/l，抗壞血酸至100mM和溶菌酶至100mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為100mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經過步驟（3）制備的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的溶菌酶，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環4次，得到自組裝蛋白質多層膜。
實施例4
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為0.01mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=8，依次加入抗壞血酸至1mM和單寧酸（TA）至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度0.01mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）蛋白質水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液， pH=8，，依次加入抗壞血酸至1mM和溶菌酶至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經過步驟（3）制備的蛋白質水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環4次，得到自組裝蛋白質多層膜。
如圖1可知，單寧酸和溶菌酶可以進行連續組裝，形成蛋白質多層膜。
實施例5
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為1mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=11，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mM和單寧酸（TA）至1mg/mL，攪拌至完全溶解，配置成濃度1mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）蛋白質水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=11，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mM和溶菌酶至1mg/mL，攪拌至完全溶解，配置成濃度為1mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的單寧酸，再浸入到經過步驟（3）制備的蛋白質水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環50次，得到自組裝蛋白質多層膜。
實施例6
本實施例包括如下步驟：
（1） 自組裝膜的基材預處理
將玻璃進行表面處理后，浸入到濃度為100mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；
（2）單寧酸水溶液的配制
配置100mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=14，依次加入氯化鈉至1mol/l，抗壞血酸至100mM和單寧酸（TA）至100mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度100mg/mL的單寧酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置100mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=14，依次加入氯化鈉至1mol/l，抗壞血酸至100mM和溶菌酶至100mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為100mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自組裝多層膜的制備
把經過步驟（1）處理基材浸入到經過步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經過步驟（3）制備的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的溶菌酶，利用單寧酸與溶菌酶通過氫鍵作用進行層層自組裝，如此循環100次，得到自組裝蛋白質多層膜。
其他實施例
其制備步驟參見上述實施例，該實施例的參數為，參見下表：