本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種豬支氣管敗血波氏桿菌病疫苗。
背景技術：
豬支氣管敗血波氏桿菌病,又稱波氏菌病,是一種重要的豬呼吸道系統疾病,以各種急慢性的呼吸道病癥為特征,極易引起其它病原菌的混合和繼發感染,全世界多數養豬業發達的國家均有此病發生,給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。豬波氏桿菌病在全世界分布廣泛,在歐洲、美國、加拿大、日本的感染率都很高,全世界已經有30％-50％的豬群受到波氏桿菌的感染。我國對豬波氏桿菌進行的流行學調查顯示,我國多個省份和地區爆發嚴重,感染率高達61.1％。隨著集約化程度的不斷提高,對養豬業的危害也日趨嚴重。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種豬支氣管敗血波氏桿菌病疫苗，從而彌補現有疫苗的不足。
本發明還提供一種滅活疫苗，其中抗原為滅活的豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株；
本發明所提供豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中國武漢、武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016606。
上述的滅活疫苗，抗原的滅活采用甲醛滅活；
本發明的滅活疫苗的制備方法如下：
1)油相：采用MONTANIDETM ISA 201 VG佐劑(以下簡稱201佐劑)；
2)水相制備：將純粹檢驗合格的YBB01株抗原，將菌泥分別重懸于滅菌的生理鹽水中，均稀釋至4.0×109CFU/ml滅活后，檢驗合格后，作為抗原；
3)乳化：將水相和油相預熱至31℃，按質量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘；
4)分裝：定量分裝，加蓋密封，并粘貼標簽，置2～8℃保存。
本發明的疫苗所使用的豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株的毒力強高、免疫原性好并具有較好的交叉保護性。本發明制備的疫苗的安全性良好，未出現由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。保存期試驗中經過性狀、安全性試驗、效力試驗數據的分析，各項指標均穩定有效；效力試驗結果證明，YBB01株產生抗體快，重要的是免疫后能夠抵御流行株的保護。
具體實施方式
申請人篩選獲得了一株豬支氣管波氏桿菌YBB01株，并用其制備疫苗，從而促成了本發明。
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例1：豬支氣管波氏桿菌YBB01株的篩選
1.流行病學調查 自2013年以來，發明人對豬支氣管敗血波氏桿菌的流行病學進行調查，并對部分豬場進行跟蹤調查。調查結果發現，豬支氣管敗血波氏桿菌目前已在我國豬場廣泛存在。
2.細菌分離 采集疑似病豬的肺臟、胸腹腔積液、心包積液等病料，接種TSA培養基，于5％CO2條件下，37℃培養24～48h，挑取單個菌落，進行培養并鑒定。
3.細菌鑒定
3.1 形態觀察 取疑似菌落，涂片后革蘭氏染色鏡檢，觀察其細菌形態。
3.2 生化特性鑒定 對可疑菌落進行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、衛矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、鳥氨酸、賴氨酸、谷氨酸脫羧酶、枸櫞酸、明膠、甲基紅、VP、吲哚半固體等生化試驗，于37℃培養24～48h，觀察結果。
3.3 PCR鑒定 將上述初步鑒定的細菌進一步用PCR方法確定。用接種環取少許被檢菌落于100μL無菌PBS,混勻,取1μL菌懸液作PCR模板。根據波氏桿菌fla基因(NO.AF232939)序列設計引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,擴增片段大小為235bp,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
4.毒力試驗 將分離的10株豬支氣管波氏桿菌分別滴鼻注射8～10周齡健康易感仔豬各5頭，3.0ml/頭(活菌量均約為4.0×109CFU)，另取5頭不攻毒作為對照。連續觀察14日，記錄試驗豬的發病及死亡情況。試驗結果表明，YBB01株毒力最強，5頭仔豬發病，其中4頭死亡。
5.免疫原性 根據毒力試驗結果，將篩選的毒力較強的YBB01株菌株菌液分別調整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，每種疫苗分別肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬采血并分離血清，使用間接血凝方法測定血清的抗體效價；并用本菌株進行滴鼻注射攻毒(活菌量均約為4.0×109CFU)。觀察試驗豬的發病及死亡情況。抗體檢測結果表明，免疫組5/5均大于等于1:16,對照組5/5均小于等于1:4；攻毒保護結果表明，免疫組5/5保護,對照組5/5發病。
6.交叉攻毒保護 根據毒力試驗結果，將YBB01株及其他9株分離菌株菌液調整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質量比1:1混合乳化，分別制備單價滅活疫苗，頸部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬分別用分離的10株同型菌株進行攻毒(4.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗仔豬的發病及死亡情況。試驗結果表明，YBB01組免疫組仔豬均未發病或死亡，均5/5保護；而對照組仔豬，均4/5-5/5發病。其他分離菌株免疫組攻毒后，保護率為1/5～3/5。表明YBB01株所制備的豬支氣管波氏桿菌滅活疫苗能抵御YBB01株及各地方分離株的攻擊而起到保護作用。
實施例2：豬支氣管波氏桿菌YBB01株抗原的制備
1.菌液培養 采用發酵罐對YBB01株進行培養：按發酵罐容積的60％～80％加入TSB培養基，同時加入消泡劑，通入高壓蒸汽進行滅菌，待其溫度降至37～38℃時，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二級種子液進行發酵培養。培養溫度36～37℃、攪拌轉速100r/min、pH值7.2～7.4，整個培養過程通過調節進氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養8小時后，取樣進行活菌計數和純粹檢驗。分別將發酵完成的菌液，導入柱式離心機離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過24小時。
2.滅活 根據活菌計數結果，將菌泥重懸于適量滅菌的生理鹽水中，稀釋至4.0×109CFU/ml，分別計量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時，進行滅活檢驗，其余菌液置2～8℃保存，不超過14日。
3.半成品檢驗
3.1 純粹檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
3.2 活菌計數 按現行《中國獸藥典》附錄進行計數。
3.3 滅活檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
實施例3：疫苗的制備
1 水相配制 檢驗合格的YBB01株抗原。
2 油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐劑(以下簡稱201佐劑)。
3 乳化 水相和油相預熱至31℃，按質量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。
3 分裝 定量分裝，加蓋密封，并粘貼標簽，置2～8℃保存。
4 成品檢驗
4.1 性狀
外觀 乳白色乳劑。
劑型 水包油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應呈云霧狀擴散。
穩定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應不大于0.5ml。
黏度 按現行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規定。
4.2 裝量檢查 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應符合規定。
4.3 無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。
4.4 安全檢驗 用3～5周齡健康易感仔豬5頭，每頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，觀察14日，應不出現因疫苗引起的局部或全身不良反應。
4.5 效力檢驗
4.5.1 血清學方法 取3～5周齡健康易感仔豬10頭，其中5頭頸部肌肉注射疫苗2.0ml/頭，其余5頭作非免疫對照。一次免疫后21日，按相同劑量和相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日對所有仔豬采血并分離血清，檢測間接血凝抗體效價。免疫組5頭仔豬的抗體效價均應≥1:16，對照組5頭仔豬抗體效價均應≤1:4。
4.5.2 免疫攻毒法 用3～5周齡健康易感仔豬10頭，隨機分為A、B兩組，每組5頭，其中A組為免疫組，均頸部肌肉注射疫苗，2.0ml/頭，B組為非免疫對照組，均頸部肌肉注射生理鹽水，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同方法和相同劑量進行二次免疫，二次免疫后14日進行攻毒。A、B組試驗豬滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量約為4.0×109CFU/頭)。觀察14日，免疫組豬均應至少4頭保護，對照組豬均應至少4頭發病。
實施例4：免疫交叉保護試驗
用YBB01株制備的滅活疫苗，頸部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有免疫仔豬分別用分離的10株同型菌株進行攻毒(4.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗仔豬的發病及死亡情況。攻毒后，免疫組仔豬均未發病或死亡，均5/5保護；而對照組仔豬，均4/5-5/5發病。表明YBB01株所制備的豬支氣管波氏桿菌滅活疫苗能抵御YBB01株及各地方分離株的攻擊而起到保護作用(表1)。而且，發明人用各地方分離株制備疫苗，免疫仔豬后，再用本發明篩選的YBB01株進行攻毒實驗；結果表明其它分離株疫苗的免疫效果遠低于本發明YBB01株制成的滅活疫苗的效果。因此YBB01株可作為豬波氏桿菌病滅活疫苗的候選菌株。
表1：YBB01株疫苗對不同菌株的免疫交叉保護試驗結果