本發明的主題是一種多糖水溶液的滅菌方法以及通過所述方法制備的多糖溶液。
背景技術：
：關節病（變形性關節病）是一種常見的關節退行性疾病。其包括軟骨表面的損傷（磨損）、軟骨顆粒的脫離、以及軟骨顆粒導致的滑膜炎癥。在輕中度關節病的情況下，近年來已經嘗試使用透明質酸的關節內注射(粘性補充療法(visco-supplementation))來改善患者的疼痛狀態并同時減緩關節病的進展。透明質酸是滑液（關節液）的一種天然成分。透明質酸在滑液中起到潤滑劑的作用。特別有利的是，透明質酸水溶液是粘彈性的。這導致非常良好的潤滑性和滑動性。由于有利的潤滑性，過去的近二十年以來，透明質酸溶液已被用于粘性補充療法。現有技術的目前狀態是使用由發酵制成并且以無菌透明質酸水溶液形式使用的透明質酸。除此之外，原則上也可以將水溶性纖維素衍生物，如羧甲基纖維素和甲基纖維素，以及淀粉衍生物，如羥乙基淀粉，用于粘性補充療法。迄今為止，一般通過暴露于伽馬輻射來滅菌透明質酸水溶液。在此情況下通常使用25kgy或更高的劑量。該滅菌法對最終包裝好的透明質酸溶液實施。但是，伽馬輻射暴露會帶來嚴重的缺陷。由于聚合物鏈的降解，根據伽馬輻射的劑量會產生或多或少的低分子量降解產物，除此之外，還可能出現導致透明質酸溶液變色的副反應。使用伽馬輻射的另一個缺陷是，常用的伽馬源具有球面輻射場。因此，入射劑量可隨著待滅菌物體的位置而變化。這導致不均勻的聚合物降解，不均勻的聚合物降解可能會造成最終粘度的不均勻性。實際上不可能得到滅菌后的透明質酸溶液的可重復的最終粘度。另外，伽馬輻射會導致包裝器件（通常是一次性塑料注射器）的脆性。透明質酸水溶液的蒸汽滅菌也會帶來類似的缺陷，其會導致透明質酸和塑料包裝器件的損壞。由于溶液的粘度相對較高，透明質酸水溶液的無菌過濾基本上是不可行的，或者僅在付出超常努力的情況下可行。并且，無菌過濾僅能夠除去一定尺寸的微生物生命形態。無菌過濾不能除去或滅活病毒。除了所述物理方法外，通常還使用化合物用于醫療產品的滅菌。這些化合物包括甲醛、戊二醛、鄰苯二甲醛。使用醛類滅菌的缺陷在于，需要在滅菌后再將醛類除去，以防止在人體中使用期間造成損害。這就排除了在儲存在其最終包裝中的透明質酸水溶液的情況下用醛類進行滅菌。醛類無法再從儲存在其最終包裝中的透明質酸溶液中除去。氧化劑，如過氧化氫、過氧甲酸、過氧乙酸、次氯酸以及釋放次氯酸的物質（如氯胺t2或三氯異氰尿酸），是非常有效的滅菌手段。這些試劑的缺陷在于，它們會造成溶解的透明質酸的顯著氧化降解。另外，未反應的氧化劑殘余物可殘留在儲存在其最終包裝中的透明質酸溶液中，并且可能會具有局部毒性作用。制藥業中已知，蛋白質水溶液，如疫苗，對氧化滅菌劑和各種物理滅菌法（例如用伽馬輻射滅菌）的作用非常敏感。為此，這些蛋白質水溶液先經過無菌過濾，然后添加少量的β-丙內酯以滅活病毒。β-丙內酯酰化病毒的dna/rna或蛋白質的氨基。作為溶劑存在的水能夠緩慢分解β-丙內酯，從而僅經過短時間就可使蛋白質水溶液中不再存在任何活性的β-丙內酯。迄今為止，已知氣態β-丙內酯會不可逆地滅活內生孢子（r.k.hoffmann,b.warshowsky:beta-propiolactonevaporasadisinfectant.appl.microbiol.1958年9月；6(5):358-362）。并且，已知β-丙內酯在非水有機單體/單體混合物和含有有機單體的糊狀粘固粉（pastycements）中滅活內生孢子（ep2596812b1）。但是，除了繁殖形態（vegetativeform）外，微生物還具有可生性形態（generativeform），如內生孢子。微生物的這些可生性生存形態由革蘭氏陽性菌，特別是桿菌和梭菌屬形成，作為在不利生存條件下持續存在的一種手段。在它們的休眠狀態下，內生孢子沒有活躍的代謝，并且具有多層孢子莢膜以極大程度地保護孢子芯免受化學物質作用和其他環境影響。這使得孢子對熱和化學物質的作用極為耐受（borick,p.m.:chemicalsterilizers.adv.appl.microbiol.10(1968)291-312;gould,g.w.:recentadvancesintheunderstandingofresistanceanddormancyinbacterialspores.j.appl.bacteriol.42(1977)297-309;gould,g.w.:mechanismsofresistanceanddormancy.p.173-209.inhurst,a.andgould,g.w.(ed.),thebacterialspore.vol.2academicpress,inc.紐約,1983）。由于它們的抗性高，內生孢子被用作驗證和控制滅菌過程有效性的生物指示物。這是基于以下假設：內生孢子的滅活指示殺滅了所有繁殖型微生物生命形態。革蘭氏陽性菌的內生孢子被分類在國際抗性iii級中。抗性i級包括無孢子形成的細菌和形成孢子的細菌的繁殖形態，抗性ii級包括在105℃的蒸汽流中幾分鐘之內被殺滅的孢子。根據dab2008（德國藥典），所有抗性i-iii級的微生物均必須被殺滅或不可逆地滅活。技術實現要素：本發明的目的在于開發一種多糖水溶液的滅菌方法。所述方法能夠在滅菌的同時不引起溶解的多糖聚合物的顯著降解。并且，要開發的滅菌方法應適于對儲存在其最終包裝中的多糖水溶液、包括與所述多糖水溶液接觸的包裝器件的內壁進行滅菌。要開發的滅菌方法應安全地滅活耐受性iii級的微生物。在本發明的范圍內，無菌應被理解為意指根據en556-1:2001不含活的微生物的狀態。根據權利要求1，本發明的目的通過一種多糖水溶液的滅菌方法得以解決。根據本發明，在緩沖液存在下將β-內酯添加到多糖水溶液中，混合物在4℃至40℃的溫度下儲存至少24小時。一個優選的方法的特征在于：a)將至少一種多糖溶解在水中；b)將至少0.5重量%的β-內酯添加到a）中制備的多糖水溶液中；c)將混合物在4℃至40℃的溫度下儲存至少24小時，其中所述水溶液含有緩沖體系，該緩沖體系的緩沖能力足以緩沖由所述β-內酯的水解產生的3-羥基丙酸，從而使滅菌后的多糖水溶液的ph值等于未滅菌的多糖溶液的ph值。根據權利要求14，所述目的通過根據上述方法中的任一種制得的無菌多糖溶液也得以實現。顯然，令人驚訝地，通過使用根據權利要求1所述的方法，可對多糖水溶液進行滅菌而僅發生最低程度的聚合物降解。這意味著滅菌后的多糖溶液的增比比濃粘度（reducedspecificviscosity）與未滅菌的多糖溶液的增比比濃粘度的比率可保持在大于/等于0.8。在確定該比率時，是否測量增比比濃粘度、動力粘度或運動粘度是不重要的。在對多糖水溶液可進行凝膠滲透色譜法處理的情況下，滅菌后的多糖的數均摩爾質量與未滅菌的多糖的數均摩爾質量的比率可保持在大于/等于0.8。并且，根據本發明的滅菌方法不會引起任何由于滅菌過程中的副反應而導致的變色。懸浮在多糖水溶液中的耐受性iii級的內生孢子通過根據本發明的方法經由β-內酯的作用滅活。在這種情況下，所述多糖溶液含有緩沖液，所述緩沖液足以能夠緩沖由所述β-內酯的水解釋放的3-羥基丙酸，從而使滅菌后的多糖溶液的ph值等于之前未滅菌的多糖溶液的ph值。優選在這種情況下使用與β-內酯等量的緩沖液。本發明進一步基于以下令人驚訝的發現：β-內酯允許多糖水溶液的滅菌在緩沖液的存在下進行，而在所述滅菌過程中沒有發生多糖的顯著聚合物降解。根據本發明的滅菌方法的特別優勢在于，所述多糖溶液在滅菌前后的粘度保持相等。提及多糖水溶液用于粘性補充療法的用途，這意味著所述溶液的粘度可在滅菌前精確調整，因為沒有由于滅菌過程而導致的粘度變化。因此，可提供精確調整了粘度和其他流變性質的無菌多糖溶液用于粘性補充療法。另一個優點是，不存在由于所述滅菌方法導致的多糖水溶液的變色。多糖是其中大量（至少10個）單糖通過糖苷鍵彼此相連形成的碳水化合物。在本發明范圍內的水溶性多糖為由單糖、雙糖、其進一步的寡聚物或衍生物組成并且以相同的方式彼此相連的多糖。根據本發明，所述多糖為天然多糖和人工多糖。根據本發明，衍生物應被理解為鹽、醚、酸或酯的酯，尤其是堿金屬鹽，特別是鈉鹽和鉀鹽。實例包括海藻酸、海藻酸鈉、透明質酸、透明質酸的鈉鹽、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素的鈉鹽、羥乙基纖維素、纖維素醚、淀粉、淀粉醚、瓜爾膠、甲殼素、殼聚糖。優選地，所述多糖選自透明質酸的鈉鹽、羧甲基纖維素的鈉鹽、羥乙基纖維素、羥乙基淀粉、甲基纖維素和氧化纖維素。根據本發明，所述多糖也可以是上述多糖的混合物。所述多糖優選以至少0.5重量%的量使用。并且，優選以至多5重量%的量使用。特別優選以1-2重量%的量使用多糖。每種情況下的量是指水中多糖的量。所述β-內酯可為由通式（i）表示的化合物（a1），在所述式中，r1、r2、r3和r4彼此獨立地可代表h、取代或未取代的烴基、鹵素基團、硝基或氰基。化合物（a1）的立體化學不受任何方式的限制。優選地，本發明的范圍包括由通式（i）表示的所有異構體作為化合物（i），無論它們的確切構型如何。所述烴基彼此獨立地可為取代的或未取代的烴基。取代的烴基的至少一個取代基優選選自鹵素基團、硝基和氰基。所述烴基彼此獨立地可為飽和或不飽和烴基。優選地，不飽和烴基包括至少一個碳-碳雙鍵。所述烴基彼此獨立地可為支化或未支化的烴基。優選烴基r1、r2、r3和r4為未支化的烴基。所述烴基彼此獨立地具有1-4個碳原子范圍內的主鏈長度，優選1-2個碳原子范圍內的主鏈長度，甚至更優選1個碳原子。氟基、氯基和溴基是通式（i）中優選的鹵素基團。所述基團各自彼此獨立地可代表基團r1、r2、r3和r4中的一個或多個。根據一個優選的實施方案，基團r1、r2、r3和r4各自代表h。根據另一個優選的實施方案，基團r1代表甲基且基團r2、r3和r4代表h。根據另一個優選的實施方案，基團r1、r2和r3代表h且基團r4代表甲基。根據再一個優選的實施方案，基團r1和r3代表h且基團r2和r4代表甲基。根據一個特別優選的實施方案，化合物（a1）為β-丙內酯（cas編號57-57-8）。所述β-丙內酯也可以是化合物（a2），其為任一化合物（a1）的二聚體。化合物（a2）的立體化學不受任何方式的限制。根據本發明，ph值7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液優選作為緩沖液，其中ph值7.4的磷酸鹽緩沖液是特別優選的。特別地，磷酸氫鉀和磷酸氫二鈉的組合、磷酸氫鈉和磷酸氫二鈉的組合、磷酸二鈉和磷酸的組合、磷酸三鈉和磷酸氫鈉的組合以及磷酸三鈉和磷酸的組合非常適合制備所述磷酸鹽緩沖液。優選地，以大于/等于0.5重量%的濃度將所述磷酸鹽緩沖液的所有組分一起溶解在所述多糖水溶液中。根據本發明，由所述β-丙內酯的水解產生的3-羥基丙酸是所述緩沖液的組分。根據本發明，3-羥基丙酸和透明質酸的鈉鹽或3-羥基丙酸和羧甲基纖維素的鈉鹽組成緩沖液。對于本發明而言重要的是，所述多糖水溶液的滅菌在初級包裝內部發生。因此，不需要額外的努力，如伽馬輻射或電子輻射或高壓蒸汽滅菌。因此，可節省大量生產成本。為了成功滅菌，重要的是將所述多糖水溶液和β-丙內酯混合后立刻將多糖水溶液填充到初級包裝器件中。這保證了可將足夠的滅菌劑用于多糖溶液和初級包裝器件內壁的滅菌。反之，如果將所述多糖溶液和β-丙內酯混合一段延長的時間后再填充所述初級包裝器件，則根據溫度和在填充所述初級包裝器件之前消逝的時間,可能會因水解生成3-羥基丙酸而損失β-丙內酯。特別地，這會導致所述初級包裝器件的內壁的滅菌產生問題。本發明的范圍包括根據本發明的方法制備的無菌多糖水溶液。所述無菌多糖溶液的特征在于，所述多糖水溶液含有至少一種至少部分可溶于水的多糖、水和3-羥基丙酸，以及緩沖體系。并且，根據本發明，所述無菌多糖水溶液含有由鈉離子、磷酸二氫根離子、磷酸氫根離子、磷酸根離子、3-羥基丙酸和3-羥基丙酸根組成的緩沖體系。其中也可含有鉀離子。根據本發明，滅菌后的多糖溶液的比濃粘度（reducedviscosity）與未滅菌的多糖溶液的比濃粘度的比率大于0.8。本發明的范圍還包括所述無菌多糖水溶液用于粘性補充療法以及作為人用藥和獸用藥的藥物載體的用途。具體實施方式通過以下呈現的實施例對本發明進行說明，但不限制本發明的范圍。實施例將以下的多糖和/或多糖衍生物用于下述實驗中：透明質酸的鈉鹽（mn~130萬道爾頓，kraebergmbh），羧甲基纖維素的鈉鹽（mn~90,000道爾頓，sigma-aldrich），甲基纖維素（sm-4000,shin-etsu-chemicalco.），羥乙基纖維素（60sh-4000,shin-etsu-chemical.co）制備ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液。為此目的，將1.65g磷酸氫鉀和9.71g二水合磷酸氫二鈉溶于1升蒸餾水中。實施例1各使用30ml磷酸鹽緩沖液（ph值7.4）制備多糖溶液。多糖多糖在磷酸鹽緩沖液中的濃度[wt.%]透明質酸的鈉鹽0.25羧甲基纖維素的鈉鹽2.00甲基纖維素(sm-4000)1.00羥乙基纖維素(60sh-4000)1.00將總計106cfu的萎縮芽孢桿菌（bacillusatropheus）的孢子懸浮液添加到無菌的25ml塑料管中的5ml的各多糖溶液中。然后用渦旋混合器使孢子均勻懸浮。接下來，將0.5重量%、1.0重量%和2.0重量%的β-丙內酯添加到5ml的預先混合了孢子的各多糖溶液中。然后將樣品在渦旋混合器中再次均化。未用β-丙內酯處理的多糖溶液用作陽性對照。在室溫下儲存48小時之后，按照dinenisp11737第二部分對多糖溶液進行無菌測試。該測試一式兩份進行。（+）生長（-）未生長。與用作陽性對照的未處理的多糖溶液相比，用β-丙內酯滅菌的多糖溶液顯示沒有任何變色。實施例2將以下的多糖用于下述實驗中：nahya1:透明質酸的鈉鹽（mn~100萬道爾頓，sigma-aldrich），nahya2:透明質酸的鈉鹽（mn~130萬道爾頓，kraebergmbh），nahya3:透明質酸的鈉鹽（mn~200,000道爾頓，用二氧化氯降解的透明質酸）將透明質酸溶解在ph7.4的磷酸鹽緩沖液中，以各自達到1重量%的濃度。總計5ml的各透明質酸溶液與100μl的β-丙內酯混合，并在室溫下儲存48小時。與此平行地，也儲存未用β-丙內酯處理的透明質酸溶液作為對照。在另一個對比中，未用β-丙內酯處理的透明質酸溶液用伽馬輻射滅菌。透明質酸溶液的伽馬滅菌由bbfsterilisationsservicegmbh使用co60源以25.2kgy的劑量進行。未滅菌條件下的透明質酸溶液的ph值為7.4，在用β-丙內酯滅菌后ph仍為7.4。與未滅菌的透明質酸溶液相比，用β-丙內酯滅菌的透明質酸溶液顯示沒有任何變色。未滅菌的透明質酸溶液和用β-丙內酯滅菌的透明質酸溶液目測均為透明且無色的。相反，用伽馬輻射滅菌的透明質酸溶液表現出輕微的變黃。透明質酸樣品的分子量和分子量分布通過凝膠滲透色譜法使用普魯蘭標準品來確定。使用折光指數檢測器（ri檢測器）作為檢測器。該測量使用來自jasco的gpc設備一式兩份進行。mn：數均摩爾質量mw：重均摩爾質量d：多分散性。多糖溶液用β-丙內酯滅菌并未導致聚合物降解。通過對比可見，伽馬滅菌導致了顯著的聚合物降解。實施例3將以下的多糖衍生物用于下述實驗中：羧甲基纖維素的鈉鹽（mw~90,000道爾頓，sigma-aldrich），羥乙基纖維素（60sh-4000,shin-etsu-chemical.co）各使用30ml的磷酸鹽緩沖液（ph值7.4）制備多糖溶液。多糖多糖在磷酸鹽緩沖液中的濃度[wt.%]羧甲基纖維素的鈉鹽2.00羥乙基纖維素(60sh-4000)1.00將總計100mg的β-丙內酯添加到5ml的各多糖溶液中，混合，并在室溫下儲存48小時。未處理的多糖溶液用作對照。為了對溶液進行粘度測量，將溶液稀釋至0.2重量%和0.4重量%的多糖濃度。由于聚合物降解程度高，通過伽馬輻射滅菌的多糖溶液未進行稀釋而測量。與未滅菌的多糖溶液相比，用β-丙內酯滅菌的透明質酸溶液顯示沒有任何變色。在25℃下使用ubbelohde粘度計（毛細管i，k=0.010257）測量稀釋后的多糖溶液（5倍測量）。注：使用了目測透明的甲基纖維素溶液。但是，不能排除甲基纖維素溶液中可能存在透明的凝膠顆粒。這可能是滅菌后的甲基纖維素溶液與未滅菌的甲基纖維素溶液相比運動粘度略高的原因。在滅菌后的甲基纖維素溶液中可能存在凝膠顆粒。用β-丙內酯滅菌的多糖溶液的運動粘度基本上與未滅菌的多糖溶液的運動粘度相同。多糖溶液用β-丙內酯滅菌并不會引起聚合物降解。相反，由伽馬滅菌的多糖溶液的運動粘度與未滅菌的多糖溶液的運動粘度的對比明顯可見，伽馬滅菌導致相當量的聚合物降解。當前第1頁12